不同剂量内毒素刺激枯否细胞分泌肿瘤坏死因子-α及内皮素-1的体外观察

目的:探讨体外脂多糖(LPS)刺激枯否细胞(KC)分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及内皮素-1(ET-1)的作用。方法:采用大鼠肝KC分离与培养技术,动态观察LPS刺激KC分泌TNF-α和ET-1的作用。结果:LPS具有明显活化KC作用,在一定LPS浓度范围内对KC分泌的TNF-α及ET-1有促进作用。结论:LPS可促进体外培养的KC分泌TNF-α及ET-1,这可能与内毒素血症导致的肝损伤有关。     

内皮素性大鼠门静脉高压模型的建立

目的：建立内皮素-1(ET-1)引起门静脉压力升高的动物模型。方法:正常雄性SD大鼠48只,随机分为生理盐水组、ET-1低剂量组(0.3μg/kg),ET-1中剂量组(1.0μg/kg)和ET-1高剂量组(3.0μg/kg)。生理盐水组大鼠经股静脉注入生理盐水,其余各组大鼠按相应剂量经股静脉注入ET-1溶液,观察门静脉压力和颈动脉压力的变化情况,并筛选出能使门静脉压力升高最适宜的剂量;另取15只大鼠随机分为对照组、ETAR阻断剂(BQ-123)组和ETBR阻断剂(BQ-788)组,实验开始前30min经各组大鼠股静脉分别注入生理盐水、ETR阻断剂BQ-123(给药剂量为12.5μg/kg)和BQ-788(给药剂量为15μg/kg),然后以选定的适宜剂量匀速注入ET-1溶液,观察各组大鼠门静脉压力变化。结果:不同剂量的ET-1均能使门静脉压力升高,尤以高剂量组最为明显;而提前注入ETR阻断剂之后,再注入ET-1溶液门静脉压力虽然升高,但升高的幅度较小。结论:成功创建了内皮素性大鼠门静脉高压模型,此模型可用于研究ET-1在PHT发病机制中的作用和药物对PHT时血中ET-1的影响。     

Pinacidil对低氧性肺动脉高压大鼠肺动脉压和血浆内皮素-1的影响

目的：探讨钾通道开放剂pinacidil对低氧性肺动脉高压（HPH）及对血浆内皮素-1（ET-1）含量的影响。方法：将45只雄性Wistar大鼠分为3组：①对照组;②低氧组,每天低氧8h,共4周;③治疗组,每天低氧前半小时腹腔注射pinacidil3mg/kg,共4周,4周后观察3组平均肺动脉压（mPAP）,右心室肥厚指标、血浆中ET-1的水平。结果：低氧组大鼠mPAP明显高于对照组。右心室肥厚显著,血浆中ET-1含量明显高于对照组;治疗组mPAP明显低于低氧组,右心室肥厚轻于低氧组,血浆中ET-1含量明显低于低氧组。结论：pinacidil能有效降低HPH中肺动脉压力、阻抑右心室肥厚,并影响血浆中ET-1的水平。     

不同剂量内毒素刺激枯否细胞分泌肿瘤坏死因子-α及内皮素-1的体外观察

目的:探讨体外脂多糖(LPS)刺激枯否细胞(KC)分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及内皮素-1(ET-1)的作用。方法:采用大鼠肝KC分离与培养技术,动态观察LPS刺激KC分泌TNF-α和ET-1的作用。结果:LPS具有明显活化KC作用,在一定LPS浓度范围内对KC分泌的TNF-α及ET-1有促进作用。结论:LPS可促进体外培养的KC分泌TNF-α及ET-1,这可能与内毒素血症导致的肝损伤有关。     

脂多糖刺激人血管内皮细胞分泌内皮素和肾上腺髓质素及其机制研究

目的:研究脂多糖(LPS)刺激人血管内皮细胞(HVEC)分泌内皮素-1(ET-1)与肾上腺髓质素(Adm)的机制。方法:在培养的HVEC上,用放射免疫法测定不同浓度LPS刺激HVEC分泌的ET-1与Adm,以及不同的细胞信号转导阻断剂对其分泌的影响。结果:LPS呈时间和浓度依赖性地增加HVEC分泌ET-1和Adm,ET-1/Adm比值与对照组比较无明显差异(P＞0.05)。在LPS刺激基础上,细胞外信号调节激酶(ERKs)抑制剂PD₀₉₈₀₅₉和P38蛋白激酶抑制剂SB₂₀₂₁₉₀可明显降低LPS刺激HVEC分泌ET-1(P＜0.01),仅SB₂₀₂₁₉₀显著降低Adm的分泌(P＜0.05),其余PKC抑制剂H₇,钙调素(CaM)抑制剂W₇,Ca²⁺阻断剂nicardipine,钙调神经磷酸酶(CaN)抑制剂环孢霉素(CsA)对LPS刺激HVEC分泌ET-1和Adm均无明显影响(P＞0.05)。结论:LPS刺激HVEC分泌ET-1可能与ERKs和P38两条途径有关,LPS刺激HVEC分泌Adm只与P38信号通路有关,两者均不取决于PKC、Ca²⁺、CaM、CaN依赖的信号通路。     

脂多糖对人脐静脉内皮细胞分泌功能的影响

目的：探讨脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）对血管内皮细胞分泌功能的影响。方法：选择体外培养的人脐静脉内皮细胞株（ECV-304）为研究对象,用不同剂量的LPS进行处理,采用放免法检测上清液中内皮素-1（endothelin-1, ET-1）的含量,用流式细胞仪检测内皮细胞细胞间粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1）的表达量。结果：LPS使ECV-304的ET-1含量显著增加,ICAM-1的表达量明显上调,并在一定范围内随着LPS浓度增加,呈剂量-效应关系。结论：LPS可使内皮细胞合成和释放ET-1增加,ICAM-1表达量增加.     

芥子气中毒后肺组织内皮素-1及内皮素A受体的含量和转录表达的研究

目的:探讨内皮素-1(ET-1)、内皮素A受体(ETAR)在芥子气中毒病理生理过程中的作用和地位。方法:应用免疫组化及RT-PCR技术,观测大鼠芥子气中毒后肺组织ET-1、ETAR的转录表达变化,相互关系及与组织损伤的关系。结果:中毒后肺组织ET-1的含量明显高于对照组,2h达峰值,但在12h后低于对照组;中毒后肺组织ET-1及ETAR的mRNA表达均高于对照组,ET-1mRNA在24h仍高于正常,ETARmRNA在24h低于正常组。结论:ET-1及其受体在芥子气中毒后肺的病理生理过程中可能起着重要作用。     

PDGF-B反义寡脱氧核苷酸对大鼠肝星状细胞增殖及Ⅰ型胶原合成的影响

目的：探讨PDGF-B反义寡脱氧核苷酸(ASODN)对大鼠肝星状细胞（HSCs）增殖及Ⅰ型胶原合成的影响。方法：合成了特异性的PDGF-B硫代磷酸ASODN及其对照错义寡脱氧核苷酸(MSODN),并将其加入至培养的HSCs。采用MTT法检测PDGF-BASODN对HSCs的增殖抑制作用,RT-PCR检测PDGF-B和collagen-ⅠmRNA的表达,流式细胞仪与ELISA法分别检测PDGF-B的表达和Ⅰ型胶原的合成。结果：PDGF-BASODN在终浓度为10μmol/L,作用HSCs-T6细胞48h时,能明显地抑制其增殖,降低PDGF-B和collagen-ⅠmRNA的表达;FCM与ELISA分析表明,HSCs表达PDGF-B和合成Ⅰ型胶原都明显低于对照组,而对照组寡脱氧核苷酸在相同浓度下未见抑制效应。结论：PDGF-BASODN可以抑制HSCs的增殖、Ⅰ型胶原的合成、内源性PDGF-B的表达,可能成为一种有用的抗肝纤维化基因治疗的药物。     

核因子κB p65反义寡核苷酸对大鼠肝星状细胞增殖和I型胶原表达的影响

目的 探讨核因子κB(NF-κB)p65反义寡核苷酸(ASOND)对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖和I型胶原表达的影响.方法 Ⅳ型胶原酶消化密度梯度离心法分离培养大鼠HSC;脂质体介导的不同浓度的NF-κB p65 ASOND(0.001、0.01、0.1和1μmol/L)进入HSC;台盼蓝染色排斥法检测NF-κBp65 ASOND对HSC的毒性实验并检测各组乳酸脱氢酶(LDH)活性;MTT法测定NF-κB p65 ASOND对1mg/LTNF-α刺激后HSC增殖影响;RT-PCR法和ELISA法检测不同浓度NF-κB p65 ASOND对1mg/LTNF-α刺激后HSC I型胶原表达的影响.结果 转染NF-κB p65 ASODN后,HSC细胞NF-κB蛋白的表达下降,不同浓度(0.001、0.01、0.1和1 μmol/L)的NF-κB p65 ASOND对于体外培养HSC的存活率和LDH无明显影响(P>0.05),0.01～μmol/L的NF-κB p65 ASOND抑制HSC的增殖,lmg/L TNF-α刺激HSC的I型胶原蛋白和mRNA的表达,且随浓度的增加作用增强(P<0.05).结论 NF-κB p65 ASOND可通过抑制NF-κB活性减少HSC活化增殖及Ⅰ型胶原生成,从而减少细胞外基质的产生.     

大鼠肝前性门静脉高压症形成中一氧化氮和内皮素-1水平的动态变化

目的:观察大鼠肝前性门静脉高压症形成中一氧化氮(NO)和内皮素-1(ET-1)水平的动态变化,探讨其在门静脉高压症高动力循环中的作用。方法:以部分门静脉结扎(PVL)法复制肝前性门静脉高压症大鼠模型,分别用硝酸还原酶和放免法检测正常组、假手术(SO)组及PVL组术后不同时点的门静脉血浆NO^-₂/NO^-₃、ET-1水平,并同步监测血流动力学指标的动态变化。结果:PVL术后各时点NO^-₂/NO^-₃水平显著高于而ET-1水平显著低于正常组,同时伴有血流动力学的明显变化。结论:门静脉高压症大鼠存在高动力循环状态(HCS)。NO和ET-1参与HCS的形成和维持。     

奥曲肽抑制骨桥蛋白刺激的肝星状细胞增殖

目的：探讨奥曲肽对骨桥蛋白（OPN）刺激的肝星状细胞(HSCs)增殖的影响。方法:体外培养HSCs,MTT法测定HSCs增殖,Westernblotting测定细胞外信号调节激酶1（ERK1）蛋白表达。结果:①干预24h,奥曲肽2.5、5.0和10.0mg/L组吸光度（A）值均显著低于OPN组,抑制率分别是18.75%、37.50%和40.63%,P＜0.05;10.0mg/L组作用12、24和48h的抑制率分别是34.38%、40.63%和53.13%,P＜0.05。②对照组有ERK1蛋白表达,OPN刺激24h后,ERK1蛋白含量较对照组高95.62%;3个剂量奥曲肽组ERK1蛋白含量则分别降低16.74%、34.30%和65.72%。结论：奥曲肽对OPN刺激的HSCs增殖有明显的抑制作用,在一定范围内,呈剂量依赖性和时间依赖性;该作用与其抑制ERK1蛋白表达有关。     

肝损伤时诱导肝星状细胞中小窝蛋白-1表达升高

目的 探究肝损伤介导肝星形细胞小窝蛋白-1的表达的影响.方法 通过肝总管结扎手术诱导大鼠肝损伤模型和体外培养肝星形细胞LX-2,检测肝组织和肝星形细胞小窝蛋白-1的表达水平.结果 ①与假手术组相比,胆总管结扎手术可显著诱导肝脏损伤,手术后7d,手术组大鼠体重显著减轻,肝脏重量和肝指数显著增加,以及血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平显著增加;②与假手术组相比,肝损伤可显著诱导小窝蛋白-1在mRNA和蛋白水平显著增加;③与胆总管结扎组相比,LPS处理可显著增加肝星形细胞小窝蛋白-1的表达水平.结果 肝损伤可显著诱导肝星形细胞小窝蛋白-1的表达.     

术前输注供者CD80low/CD86low树突状细胞，延长小鼠同种异体移植心脏存活

目的:应用B7-1和B7-2反义寡核苷酸(ASB7-1/ASB7-2oligo)抑制CD80(B7-1)、CD86(B7-2)在供体小鼠骨髓树突状细胞(DC)上的表达,观察这类DC对同种异体小鼠心脏移植存活时间的影响并探讨其机理。方法:小鼠B7-1和B7-2反义寡核苷酸在lipofectamine协助下分别转染供体鼠C57BL/10J(B10)小鼠骨髓DC,流式细胞仪检测其CD80/CD86的表达,证实为CD80^low/CD86^low。将各组DC经尾静脉输注到受体小鼠C3H/HeJ(C3H)体内,1周后进行心脏移植术,观察存活时间;体外实验观察各组DC对同种异体T细胞的激活作用,包括混合淋巴细胞反应、细胞毒性效应、及IL-2的产生。结果:ASB7-1和ASB7-2分别显著抑制DC表达CD80/CD86;转输这些CD80^low/CD86^lowDC可使小鼠心脏移植物存活时间显著延长,分别为(18.6±0.89)d和(23.67±10.73)d,与转输成熟骨髓DC(IL-4DC)组和生理盐水注射组(6.22±0.97)d、(11.17±1.72)d比较,均有显著差异(P<0.01);CD80^low或CD86^lowDC对异体T细胞激活作用较弱,表现为T细胞增殖能力、IL-2产生及细胞毒杀伤均明显低。结论:应用反义寡聚核苷酸转染供者DC,降低其CD80或CD86的表达,可以抑制供者特异性的免疫应答,延长移植物存活时间。     

术前输注供者CD80~(low)/CD86~(low)树突状细胞,延长小鼠同种异体移植心脏存活

目的 :应用B7- 1和B7- 2反义寡核苷酸 (ASB7- 1/ASB7- 2oligo)抑制CD80 (B7- 1)、CD86 (B7- 2 )在供体小鼠骨髓树突状细胞 (DC)上的表达 ,观察这类DC对同种异体小鼠心脏移植存活时间的影响并探讨其机理。方法 :小鼠B7- 1和B7- 2反义寡核苷酸在lipofectamine协助下分别转染供体鼠C5 7BL/10J(B10 )小鼠骨髓DC ,流式细胞仪检测其CD80 /CD86的表达 ,证实为CD80 low/CD86 low。将各组DC经尾静脉输注到受体小鼠C3H/HeJ(C3H)体内 ,1周后进行心脏移植术 ,观察存活时间 ;体外实验观察各组DC对同种异体T细胞的激活作用 ,包括混合淋巴细胞反应、细胞毒性效应、及IL - 2的产生。结果 :ASB7- 1和ASB7- 2分别显著抑制DC表达CD80 /CD86 ;转输这些CD80 low/CD86 lowDC可使小鼠心脏移植物存活时间显著延长 ,分别为 (18.6± 0 .89)d和 (2 3.6 7± 10 .73)d ,与转输成熟骨髓DC(IL - 4DC)组和生理盐水注射组(6 .2 2± 0 .97)d、(11.17± 1.72 )d比较 ,均有显著差异 (P <0 0 1) ;CD80 low或CD86 lowDC对异体T细胞激活作用较弱 ,表现为T细胞增殖能力、IL - 2产生及细胞毒杀伤均明显低。结论 :应用反义寡聚核苷酸转染供者DC ,降低其CD80或CD86的表达 ,可以抑制供者特异性的免疫应答 ,延长移植物存活时间。     

复方丹参滴丸对人血管内皮细胞功能及形态保护作用的研究

目的：观察复方丹参滴丸对细菌内毒素（LPS）所致人血管内皮细胞功能及形态结构损伤的作用。方法：人脐静脉内皮细胞培养,建立脂多糖损伤模型（以10mg/L的LPS培养液培养细胞12h）,按分组分别把不同浓度的丹参滴丸（1g/L、0.5g/L、0.25g/L、0.1g/L）于损伤前、损伤后加入,分别进行细胞活力、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、内皮素（ET-1）、细胞内钙浓度的测定及倒置显微镜、倒置相差显微镜、激光共聚焦显微镜、透射电镜等形态学指标观察。结果：损伤后给不同浓度丹参滴丸对LPS所致人血管内皮细胞损伤均有明显减轻（P0.05)。损伤前、后分别给予不同浓度滴丸后,LPS所致血管内皮细胞形态结构损伤均有明显减轻。结论：丹参滴丸对血管内皮细胞具明显保护作用。     

IOX1对TGF-β诱导的LX2细胞增殖、凋亡及细胞外基质相关蛋白表达的影响

目的:探讨组蛋白去甲基化酶抑制剂IOX1(5-羧基-8-羟基喹啉)提高组蛋白H3第9位赖氨酸二甲基化(H3K9me2)水平对转化生长因子β(TGF-β)诱导的人肝星状细胞株LX2增殖、凋亡及细胞外基质合成和代谢的影响。方法:采用实时无标记细胞分析技术动态观察不同浓度IOX1对TGF-β诱导的LX2细胞增殖的影响。采用流式细胞术观察IOX1对TGF-β诱导的LX2细胞凋亡的影响。Western blot检测细胞中H3K9me2水平,以及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(Col I)、基质金属蛋白酶1(MMP-1)和金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP-1)蛋白的表达。结果:与对照组相比,不同浓度的IOX1均能抑制LX2细胞增殖。流式细胞术结果表明,IOX1能够促进LX2细胞凋亡(P<0. 05)。Western blot结果发现,IOX1能提高LX2中H3K9me2水平,且呈剂量依赖性(P<0. 05);与对照组相比,300μmol/L IOX1能够明显抑制TGF-β诱导的LX2细胞中α-SMA、TIMP-1和Col I蛋白的表达(P<0. 05),MMP-1蛋白...     

Regulation of SIRT1-TLR2/TLR4 pathway in cell communication from macrophages to hepatic stellate cells contribute to alleviates hepatic fibrosis by Luteoloside

Regulating macrophage-hepatic stellate cells (HSCs) crosstalk through SIRT1-TLR2/TLR4 has contributed to the essence of new pharmacologic strategies to improve hepatic fibrosis. We investigated how Luteoloside (LUT), one of the flavonoid monomers isolated from Eclipta prostrata (L.) L., modulates macrophage-HSCs crosstalk during hepatic fibrosis. HSC-T6 or rat peritoneal macrophages were activated by TGF-β or LPS/ATP, and then treated with LUT or Sirtinol (SIRT1 inhibitor) for 6 h. Further, HSCs were cultured with the conditioned medium from the LPS/ATP activated peritoneal macrophages. In HSC-T6 or peritoneal macrophages, LUT could decrease the expressions of α-SMA, Collagen-I, the ratio of TIMP-1/MMP-13. LUT also significantly increased the expressions of SIRT1 and ERRα. And LUT significantly suppressed the releases of pro-inflammatory cytokines, including NLRP3, ASC, caspase-1, IL-1β, and regulated signaling TLR2/TLR4-MyD88 activation. The expressions of TLR2, TLR4, NLRP3, caspase-1, IL-1β, α-SMA were increased and the expression of ERRα was decreased by Sirtinol, indicated that LUT might mediate SIRT1 to regulate TLR4 expression and further alleviate inflammation and fibrosis. LUT could regulate SIRT1-mediated TLR4 and ECM in HSCs was reduced, when HSCs were cultured with conditioned medium. Hence, LUT could decrease the expressions of fibrosis markers, reduce the releases of inflammatory cytokines in activated HSCs or macrophages. In conclusion, LUT might be a promising candidate that regulating SIRT1-TLR2/TLR4 signaling in macrophages interacting with HSCs during hepatic fibrosis.     

肝窦内皮细胞损伤和表型改变在大鼠肝硬化门脉高压发生中的作用

目的：探讨肝窦内皮细胞（SECs）损伤和表型改变与大鼠肝硬化门脉高压的关系。方法：采用二甲基亚硝胺（DMN）4周12次腹腔注射复制大鼠肝硬化模型,分别于造模后1d、2d、3d、1周、2周、4周、6周、8周作动态观察;肠系膜前静脉分支插管法测门脉压力（Ppv）;透射电镜观察肝组织超微结构;免疫组化观察肝窦壁CD44和Ⅷ因子相关抗原（vWF）表达;Northernblot检测肝组织内皮素-1（ET-1）mRNA和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）mRNA表达;Westernblot检测肝组织eNOS表达;放射免疫法测定血清透明质酸（HA）和肝组织ET-1含量。结果：DMN造模1d后CD44染色明显弱于正常对照组（P<0.05）,SECs窗孔减少,血清HA含量显著高于正常对照组(P<0.05);DMN造模2d后vWF阳性染色明显强于正常对照组(P<0.05);DMN大鼠的Ppv与肝窦壁vWF表达量和血清HA含量呈显著正相关(P<0.05);造模2d和3d时ET-1mRNA表达强于正常对照组,ET-1含量轻度高于正常对照组;造模1d、2d和3d时eNOSmRNA表达强于正常对照组,而eNOS一直呈低水平状态。结论：SECs损伤和表型改变是DMN大鼠肝硬化门脉高压形成的病理基础之一;ET-1和NO产生的平衡失调,使肝内血流阻力增加,在门脉高压形成过程中起重要作用。     

反义寡核苷酸抑制猪内皮细胞生成内皮素的研究

目的：研究内皮素反义寡核苷酸能否抑制猪肺动脉内皮细胞生成内皮素。方法：设计并合成三段针对内皮素－１前体基因的反义寡核苷酸片段，检测其对培养的内皮细胞生成内皮素的影响。结果：两个反义寡核酸片段能明显抑制体外内皮细胞生成内皮素，而相应正义和非特异硫代寡核苷酸则无此抑制作用，说明其作用具特异性。结论：内皮素－１反义寡核苷酸有可能用于内皮素相关的疾病的治疗。     

脂多糖对体外培养人脐静脉内皮细胞分泌功能及活力的影响

摘要目的：观察脂多糖对人脐静脉内皮细胞分泌缩血管因子内皮素-1、舒血管因子一氧化氮及其细胞活力的影响,为探讨感染性休克的发病机制提供实验资料。方法：选用体外培养的3代人脐静脉内皮细胞,分别使用浓度为1g/L、100mg/L、10mg/L、1mg/L、100μg/L、10μg/L、1μg/L的脂多糖与之孵育6h。分别使用放免法、硝酸还原酶法以及MTT法测定培养上清液内内皮素、一氧化氮的含量和内皮细胞的活力。结果：正常对照组培养基中ET-1的浓度(pg/L)为:251.64±10.90。脂多糖与内皮细胞共孵育组培养基中ET-1的浓度（pg/L）分别为：220.85±19.14、278.67±15.45、306.40±11.60、312.87±33.50、324.38±17.02、291.49±14.30、282.11±13.38,各组与正常对照组比较,P<0.05或P<0.01;正常对照组培养基中总硝酸根离子（NO_x）的浓度（μmol/L）为629.46±13.36,脂多糖与内皮细胞共孵育组培养基中NO_x的浓度(μmol/L)分别为：732.58±23.21、669.87±9.32、661.24±16.80、650.33±13.24、606.59±12.94、626.75±9.83、627.61±5.61,各组与正常对照组比较,P<0.05或P<0.01。各组内皮细胞的活力分别为：74%、81%、86%、88%、91%、93%、93%。结论：低浓度的脂多糖对血管内皮细胞不具有强烈的毒性作用,而主要以影响其功能为主：促进缩血管物质ET的分泌,而抑制舒血管物质NO的产生。而高浓度的LPS对血管内皮细胞不但有较强烈的毒性作用,同时影响其功能：抑制缩血管物质ET的分泌,而促进舒血管物质NO的产生。