顺铂对大鼠耳蜗螺旋神经节细胞外向延迟整流钾电流的影响

目的:观察记录顺铂作用下急性分离新生大鼠耳蜗螺旋神经节细胞(SGNs)延迟整流钾通道的电流曲线,分析顺铂对SGNs钾电流激活动力学的影响,并初步探讨其耳毒性机制。方法:采用全细胞膜片钳技术记录SGNs外向延迟整流钾电流及顺铂对此电流的影响。结果:钳制电压为-60mV,刺激电压从-60mV到 80mV逐渐去极化,阶跃电压为10mV,持续时间为500ms,可在SGNs上记录到外向钾电流,该电流对TEA-Cl(4-乙基胺)敏感,具有延迟整流特性;在细胞外液中加入10μmol/L顺铂,能明显抑制SGNs延迟整流钾电流;顺铂对此电流的抑制作用与细胞外液中顺铂的浓度呈剂量依赖性;外液洗脱后SGNs电流可基本恢复正常。结论:钾通道与SGNs动作电位的产生密切相关,顺铂可抑制SGNs钾通道电流,导致听觉功能障碍。     

顺铂致豚鼠螺旋神经节细胞凋亡及Caspase-3活化的研究

目的：探讨顺铂的耳毒性作用与螺旋神经节细胞（sprial glanglion cell,SGC)凋亡的关系，及SGC的凋亡是否与凋亡蛋白酶Caspase-3信号转导有关。方法：取40只听力正常的豚鼠，随机分为顺铂1、2、4天组和对照组，每天检测听性脑干反应（ABR）和40Hz相关电位以观察豚鼠高，低频的听阈变化，并用TNEL法检测凋亡细胞数量变化，免疫组化检测SGC中Caspase-3p20活性片段的表达。结果：随着注射顺铂时间的延长，豚鼠听力逐渐下降，同时SGC的TUNEL染色明显增强，Caspase-3p20活性片段的表达增高，与对照组比较均有显著性差异（P＜0．01），结论：顺铂的耳毒性损害机制与SGC的凋亡有关；顺铂所致的SGC凋亡过程中有Caspase-3p20的激活。     

小鼠耳蜗螺旋神经节细胞电生理学特性的研究

目的：应用膜片钳技术记录小鼠耳蜗螺旋神经节细胞的全细胞电流,了解电压依赖性离子通道的基本电生理学特性,并比较耳蜗顶、底转螺旋神经节细胞电生理学特性的差异。方法：应用全细胞构型电压钳制技术,采用不同的电极内液及阻断剂,在不同的刺激参数下记录耳蜗顶、底转螺旋神经节细胞的电压依赖性离子通道电流,并进行分析比较。结果：实验记录到了内向的钠电流、延迟整流钾电流、超极化激活内向阳离子通道电流及瞬时外向钾电流,并发现耳蜗顶、底转螺旋神经节细胞的延迟整流钾电流及瞬时外向钾电流的电生理学特性具有显著性差异（P〈0．05）。结论：实验记录到的各种离子电流数据表明耳蜗螺旋神经节细胞具有完成动作电位的形成、传导并对其功能进行调节的离子通道基础;耳蜗顶、底转螺旋神经节细胞电生理学特性的差异有助于听觉的形成过程。     

顺铂对耳蜗螺旋神经节细胞毒性作用及机制

目的通过透射电镜及免疫组化法观察顺铂对耳蜗螺旋神经节细胞的毒性作用。方法16只豚鼠随机均分为2组。顺铂组连续5天腹腔注射顺铂2mg/kg/d;对照组连续5天腹腔注射生理盐水2mg/kg/d;用药前后测试听力,处死动物后制作耳蜗标本,透射电镜观察及免疫组化法测定诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)的表达。结果ABR:顺铂组听力下降明显,阈值显著升高(P<0.01)。透射电镜观察:顺铂组螺旋神经节细胞的细胞器损伤严重,核变形,线粒体肿胀,大量空泡样变,粗面内质网增多,有髓神经纤维的髓鞘增厚;对照组螺旋神经节细胞核无变形,核仁基本居中,线粒体结构正常。免疫组织化学显示:顺铂组螺旋神经节有iNOS阳性反应显色,灰度值降低,iNOS活性升高,与对照组比较,有显著性差异(P<0.01)。结论顺铂可致耳蜗螺旋神经节细胞损伤并呈iNOS阳性表达,导致听力下降。     

顺铂作用下沙鼠耳蜗螺旋神经节神经元和Corti器细胞的凋亡

目的 探讨顺铂是否可引起沙鼠耳蜗螺旋神经节(spiral ganglion，SG)神经元和Corti器细胞的凋亡。方法 对沙鼠进行顺铂连续腹腔注射，每日4mg／kg体重，分别于健康对照组及给药4、5、6、7d各处死沙鼠12只，取左侧耳蜗，每组动物取10只耳蜗做平行蜗轴的石蜡切片，另2只耳蜗做底回蜗轴及基底膜超薄切片。通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling method，TUNEL)及透射电镜检测连续用药不同时间后底回SG及Corti器的细胞凋亡情况。结果 连续应用顺铂5—7d，在透射电镜下可以观察到底回SG神经元及外毛细胞中出现凋亡特征性病理改变，TUNEL标记的石蜡切片中可见给药5d后SG和Cord器出现的阳性细胞明显高于健康对照组，给药6～7d阳性细胞进一步增加。结论 细胞凋亡是顺铂损伤沙鼠SG神经元和Cord器细胞的重要方式。     

神经营养因子受体在顺铂中毒大鼠耳蜗螺旋神经节中的表达

目的 探讨神经营养因子受体TrkB、TrkC和p75在顺铂中毒大鼠螺旋神经节中的表达及意义.方法 成年Wistar大鼠50只,随机分为对照组(生理盐水5 ml/kg,1次/d,腹腔注射,连续5 d),用药1 d组(顺铂5 mg/kg,腹腔注射),用药3 d组(顺铂5 mg/kg,1次/d,腹腔注射,连续3 d),用药5 d组A(顺铂5 mg/kg,1次/d,腹腔注射,连续5 d,第6天处死),用药5 d组B(顺铂5 mg/kg,1次/d,腹腔注射,连续5 d,第12天处死),每组10只,建立在体顺铂耳毒性模型.通过反转录一聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测耳蜗中TrkB、TrkC及p75的mRNA表达最,通过免疫组织化学染色测定TrkB、TrkC及p75蛋白在螺旋神经节巾的表达.结果 成功建立顺铂耳毒性大鼠模型,随着给约时间的延长,TrkB、TrkC和p75在螺旋神经节中的表达呈动态变化.TrkB的mRNA和蛋白表达(x±s,下同)在用药1 d及3 d组分别达到0.76±0.06、88.78±4.28及0.82±0.09、91.64±4.06,与对照组及其他用药组比较差异具有统计学意义(P值均＜0.05);TrkC的mRNA和蛋白表达在用药1 d组达到0.80±0.06和89.66±2.76,与对照组及其他用药纽比较差异具有统计学意义(P值均＜0.05);p75的mRNA和蛋白在对照组和各用药组的表达分别为0.64±0.04、55.16±3.10、0.77±0.04、78.46±3.86、1.01±0.09、105.02±6.61、1.18±0.09、111.10±6.08、0.51±0.04、42.74±±5.20,各用药组与对照组比较差异具有统计学意义(P值均＜0.05).结论 TrkB、TrkC在给药后早期有一过性表达增强,后期表达下降同时听力损失明显,p75在给药后表达逐渐增强.TrkB、TrkC可能参与顺铂中毒性螺旋神经节损伤后的修复过程;p75可能参与顺铂对螺旋神经节细胞的毒性作用,介导神经元凋亡.     

银杏叶提取物对顺铂耳蜗毒性的拮抗作用

目的 研究银杏叶提取物对顺铂耳毒性的拮抗作用。方法 杂色健康豚鼠27只，随机分为生理盐水组、顺铂（CDDP）组、银杏叶提取物（Egb CDDP）组，动态观察动物听阈变化及耳蜗外毛细胞形态学改变，并在损伤6天后，观察外毛细胞损伤率、耳蜗毛细胞凋亡情况。结果 CDDP组听阈及外毛细胞损伤率显著性升高，凋亡现象明显；Egb CDDP组外毛细胞的损伤率及听阈损伤均明显减轻，仅出现早期凋亡表现；生理盐水组各项指标均无明显变化。结论 Egb对顺铂所致的耳毒性具有明显拮抗作用。     

顺铂作用下沙鼠耳蜗螺旋神经节神经元和Corti器细胞的凋亡

目的　探讨顺铂是否可引起沙鼠耳蜗螺旋神经节 (spiralganglion ,SG)神经元和Corti器细胞的凋亡。方法　对沙鼠进行顺铂连续腹腔注射 ,每日 4mg kg体重 ,分别于健康对照组及给药 4、5、6、7d各处死沙鼠 12只 ,取左侧耳蜗 ,每组动物取 10只耳蜗做平行蜗轴的石蜡切片 ,另 2只耳蜗做底回蜗轴及基底膜超薄切片。通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术 (terminaldeoxynucleotidyltransferase mediateddUTPnickendlabelingmethod ,TUNEL)及透射电镜检测连续用药不同时间后底回SG及Corti器的细胞凋亡情况。结果　连续应用顺铂 5～ 7d ,在透射电镜下可以观察到底回SG神经元及外毛细胞中出现凋亡特征性病理改变 ,TUNEL标记的石蜡切片中可见给药 5d后SG和Corti器出现的阳性细胞明显高于健康对照组 ,给药 6～ 7d阳性细胞进一步增加。结论　细胞凋亡是顺铂损伤沙鼠SG神经元和Corti器细胞的重要方式     

硫酸庆大霉素对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响

为观察硫酸庆大霉素对培养的小鼠耳蜗螺旋神经节细胞（SGC）的细胞生存数和细胞突起长度的影响，在单离培养的出生1～5d的NIH小鼠SGC培养液中，加入不同浓度的硫酸庆大霉素（25，50，100mg／L）。培养14d后，标本用4％多聚甲醛固定，甲苯胺蓝染色，在光镜下计数SGC生存数，目镜测微尺下测量细胞突起长度。结果显示，实验组与对照组间、不同浓度实验组间的细胞生存数及细胞突起长度无明显差异（P＞0．05）。提示硫酸庆大霉素对小鼠耳蜗SGC的生存和生长无明显影响，氨基糖甙类抗生素对SGC的影响可能是继发性的。     

应用膜片钳技术对螺旋神经元放电类型的初步研究

目的：研究原代培养新生鼠螺旋神经元的放电类型。方法：应用膜片钳技术全细胞构型从原代培养的螺旋神经元获得电流钳记录。结果：从螺旋神经元记录到动作电位，螺旋神经元具有不一致的放电特征。结论：螺旋神经元具有快适应和慢适应两种放电特征，多数神经元为快适应神经元。     

小鼠耳蜗螺旋神经节细胞电压依赖性离子通道的研究

目的了解小鼠耳蜗螺旋神经节细胞电压依赖性离子通道的特性。方法采用耳蜗螺旋神经节细胞与耳蜗基底膜整体培养和膜片钳全细胞记录方法。结果采用出生后0至5d的C57BL/10J小鼠(n=30)，耳蜗螺旋神经节细胞与基底膜一道取出，培养8～48h后，基底膜内侧和周围散落的螺旋神经节细胞贴壁良好，便于进行生理学记录。螺旋神经节细胞根据在电流钳记录下有无动作电位来鉴别，健康的细胞在刺激电流的起始端和结束端均可记录到动作电位。细胞平均静息电位(     

N-acetylcysteine and N-nitroarginine methyl ester attenuate Carboplatin-induced ototoxicity in dissociated spiral ganglion neuron cultures

Objectives

Carboplatin, a platinum-containing anti-cancer drug used to treat a variety of cancers, induces ototoxicity. Since, reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO) seem to be responsible for this toxicity, the antioxidant, N-acetyl-L-cysteine (L-NAC), and NO synthetase inhibitor, N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) were predicted to have protective effects against carboplatin ototoxicity. The aim of this study was to test for the protective effects of L-NAC and L-NAME on cochlear hair cells and spiral ganglion neurons (SGNs).

Methods

Cochlear organotypic cultures and dissociated spiral ganglion neuron cultures, from mice postnatal day 5 cultures were used in this study. The cultures were treated with carboplatin alone or in combination with L-NAC or L-NAME, and carboplatin-induced damage was monitored.

Results

Treatment with carboplatin induced a significant loss of outer hair cells, while inner hair cells were preserved in the cochlear organotypic cultures. Addition of L-NAC or L-NAME reduced the amount of carboplatin-induced hair cell damage; the differences did not reach statistical significance. However, carboplatin significantly decreased the number of surviving SGNs in dissociated cultures. The toxic effects were significantly reduced by addition of L-NAC or L-NAME. In addition, carboplatin induced the loss of neurites from the SGN somata, and this was not blocked with L-NAC or L-NAME.

Conclusion

The results of this study suggest that ROS and NO are involved in carboplatin-induced damage to hair cells and SGNs, and administration of L-NAC/L-NAME can be used to attenuate the toxicity.     

庆大霉素对小鼠螺旋神经节神经元电生理特性的影响

目的 探讨庆大霉素对小鼠耳蜗螺旋神经节神经元细胞电生理特性的影响及其意义。方法 应用全细胞电压钳技术研究庆大霉素对急性酶分离小鼠螺旋神经节神经元细胞膜上的钾、钠离子通道电流的峰值的影响．与细胞外液中庆大霉素浓度的关系，以及庆大霉素洗脱后电流的恢复情况。结果 庆大霉素能抑制电压依赖性钾通道，但不能抑制电压依赖性钠通道，其钾通道抑制作用与细胞外液中庆大霉素的浓度呈剂量依赖性，庆大霉素洗脱后电流恢复不完全。结论 庆大霉素通过抑制螺旋神经节神经元细胞的钾离子通道而产生耳毒性。     

Chlorogenic acid alters the voltage-gated potassium channel currents of trigeminal ganglion neurons

Chlorogenic acid（5-caffeoylquinic acid, CGA） is a phenolic compound that is found ubiquitously in plants, fruits and vegetables and is formed via the esterification of caffeic acid and quinic acid. In addition to its notable biological functions against cardiovascular diseases, type-2 diabetes and inflammatory conditions, CGA was recently hypothesized to be an alternative for the treatment of neurological diseases such as Alzheimer＇s disease and neuropathic pain disorders. However, its mechanism of action is unclear.Voltage-gated potassium channel（Kv） is a crucial factor in the electro-physiological processes of sensory neurons. Kv has also been identified as a potential therapeutic target for inflammation and neuropathic pain disorders. In this study, we analysed the effects of CGA on the two main subtypes of Kv in trigeminal ganglion neurons, namely, the IK,Aand IK,Vchannels. Trigeminal ganglion（TRG）neurons were acutely disassociated from the rat TRG, and two different doses of CGA（0.2 and 1 mmol·L21） were applied to the cells.Whole-cell patch-clamp recordings were performed to observe alterations in the activation and inactivation properties of the IK,Aand IK,Vchannels. The results demonstrated that 0.2 mmol·L21CGA decreased the peak current density of IK,A. Both 0.2 mmol·L21and1 mmol·L21CGA also caused a significant reduction in the activation and inactivation thresholds of IK,Aand IK,V. CGA exhibited a strong effect on the activation and inactivation velocities of IK,Aand IK,V. These findings provide novel evidence explaining the biological effects of CGA, especially regarding its neurological effects.     

对灰鼠延迟性神经元死亡模型中螺旋神经节细胞缺损的评估

目的探索观察耳蜗螺旋神经节细胞的简便定量研究方法 ,并在灰鼠延迟性螺旋神经节细胞死亡动物模型中验证本方法的实用性和可靠性。方法 15只成年灰鼠平均分为3组,第1组用于正常对照;第2组一次性同时肌肉注射庆大霉素（125mg/kg）和静脉注射利尿酸钠（40mg/kg）,并在用药后2个月处死;第3组接受与第2组同样的药物注射,但在用药后4个月处死。耳蜗样品被常规应用环氧树脂包埋并制作成耳蜗中轴半薄切片,计数耳蜗各回蜗轴螺旋管腔切片截面内的螺旋神经节数量并进行统计分析。结果灰鼠耳蜗底回起始端的蜗轴螺旋管腔比耳蜗底回中部和耳蜗中回大,因此耳蜗底回起始端蜗轴螺旋管内的螺旋神经节细胞数量多于耳蜗底回中部和耳蜗中回。耳蜗毛细胞被彻底破坏后2个月,与正常灰鼠耳蜗各回蜗轴螺旋管腔切片截面内的螺旋神经节细胞数量相比,耳蜗底回蜗轴螺旋管切片截面内的螺旋神经节细胞减少数量比耳蜗中回严重,提示延迟性螺旋神经节细胞死亡可能遵循着从耳蜗底回向顶回扩展的规律。耳蜗毛细胞被彻底破坏后4个月,全耳蜗蜗轴螺旋管内的螺旋神经节细胞基本上丧失殆尽。结论计数耳蜗中轴切片各回蜗轴螺旋管腔切片截面内的螺旋神经节细胞数量是一种简便可靠的定量分析方法 。     

豚鼠耳蜗单离外毛细胞外向钾电流的特性

目的：探讨豚鼠耳蜗单离外毛细胞（ＯＨＣ）钾电流（Ｉｋ）的正常值及其特性。方法：应用膜片钳全细胞记录技术及多种辅助方法,测试在不同细胞内、外液和电压刺激条件下的Ｉｋ、钾尾电流（Ｉｋｔａｉｌ）和反转电位。结果：Ｉｋ具有明显的电压依赖性和时间依赖性,在２０ｍｓ内达峰值,平均激活电压约为－３２．７ｍＶ,从激活电压至０电压时Ｉｋ增长最快,在４０ｍＶ时接近饱和。正常条件下Ｉｋ无明显“ｒｕｎ－ｄｏｗｎ现象”。细     

Cisplatin induces cytoplasmic to nuclear translocation of nucleotide excision repair factors among spiral ganglion neurons

Genomic DNA is a high-affinity target for the antineoplastic molecule cisplatin. Cell survival from cisplatin DNA damage is dependent on removal of cisplatin-DNA adducts by nucleotide excision repair (NER) pathways. The rate-limiting steps in the NER pathways are DNA damage identification and verification. These steps are accomplished by xeroderma pigmentosum complementation group C and A (XPC and XPA) and RNA polymerase II. Unlike RNA polymerase II, XPC and XPA have no known cellular function beyond DNA repair. Cisplatin is known to damage spiral ganglion neurons at the basal coil of the cochlea therefore it was posited that cisplatin may target their DNA and mobilize XPC and XPA. Female Fisher344 rats were given two, four day cycles of cisplatin (2 mg/kg) or saline, separated by a 10 day rest period. A 2 × 3 × 2 factorial design, consisting of two treatment conditions (cisplatin and saline treatment), three survival times (5, 19 and 22 days) and two analysis methods (quantitative RT-PCR and immunohistochemistry) was employed to evaluate the expression and distribution of XPC and XPA. Quantitative RT-PCR revealed statistically significant differences in cochlear XPC and XPA mRNA levels after cisplatin treatment at all times except day 22 for XPA. Immunohistochemistry revealed that a proportion (50%) of spiral ganglion neurons in control rats showed cytoplasmic expression of XPC and XPA. After cisplatin treatment, a similar proportion (50%) of spiral ganglion neurons showed increased nuclear expression of XPC and XPA, which appears to represent translocation from the cytoplasm. Basal coil spiral ganglion neurons translocated XPC and XPA at later treatment cycles and with less magnitude than apical coil neurons after cisplatin treatment. Therefore, it is suggested that cisplatin treatment induces nuclear translocation of NER proteins among spiral ganglion neurons and that this nuclear translocation is less efficient at the base relative to the apex.     

快速老化小鼠的听功能和耳蜗螺旋神经元的增龄性变化

目的探讨快速老化小鼠听觉功能和耳蜗螺旋神经元的增龄性变化。方法选取1、3、5、7、9月龄的快速老化小鼠亚系1( Senescence accelerated mouse/prone 1, SAMP 1)作为实验组,而同龄抗快速老化小鼠亚系1(Senescence accelerated mouse/resistance 1, SAMR 1) 作为SAMP 1的正常对照组。分别观察其8kHz短纯音听觉脑干反应阈值、耳蜗螺旋神经节细胞透射电镜形态学、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记［terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT) dUTP nick end labeling］ TUNEL免疫组化染色等方面的增龄性变化。结果① 听功能检测。第7、9个月龄SAMP 1小鼠跟同龄SAMR 1小鼠比较听觉脑干反应阈值差异有统计学意义;② 耳蜗螺旋神经节细胞形态学检测。第7、9个月龄SAMP 1小鼠可见螺旋神经元凋亡,而同龄SAMR 1小鼠罕见螺旋神经元凋亡;③ 耳蜗中轴位切片TUNEL染色。第7个月龄SAMR 1小鼠SGN细胞核基本上不着色［TUNEL染色阳性率为（2.27±2.43）%］,第7个月龄SAMP 1小鼠部分SGN胞核着色［染色阳性率为（11.36±4.96）%］,两者的染色阳性率差异有统计学意义。结论SAMP 1小鼠随月龄增长耳蜗螺旋神经元凋亡、听功能减退,7月龄SAMP 1小鼠即出现明显的听功能老化特征,可作为老年聋动物模型用于耳聋的相关研究。