顺铂诱导鼻咽癌 CNE-2Z细胞凋亡并降低其线粒体膜电位

鼻咽癌是我国华南地区高发的恶性肿瘤，放疗是其治疗的基本方法，由于中晚期鼻咽癌治疗后有较高的远处转移率及局部复发率，化疗具有十分重要的作用。到目前为止，国内外研究报道均认为鼻咽癌化疗方案中以含有顺铂（ cisplatin,cDDP）的联合化疗方案疗效较好 [1]。本文以人鼻咽癌低分化上皮细胞株 CNE-2Z为体外模型，经 cDDP处理后，通过荧光染色、流式细胞仪等检测手段发现， cDDP能诱导鼻咽癌细胞凋亡，同时伴有线粒体膜电位的降低。     

顺铂诱导鼻咽癌CNE-2细胞自噬和凋亡的体外研究

目的:研究顺铂在体外应用对人鼻咽癌CNE-2细胞凋亡与自噬的影响,并探讨其可能机制。方法:采用流式细胞术检测细胞周期分布、细胞凋亡率和MDC阳性率;RT-PCR法检测Mcl-1、Bcl-2、Bad、Bax、Caspase-3、Beclin1和LC3 mRNA表达。结果:在实验浓度范围内,顺铂作用CNE-2细胞48h后,2、4、8μg/ml各干预组总凋亡率分别为(8.71±1.03)%、(11.34±1.17)%、(15.30±2.24)%;MDC阳性率分别为(5.36±0.48)%、(7.52±0.32)%、(10.65±0.70)%;与0μg/ml组比较,G2/M期阻滞率分别增加45.97%、73.99%、267.34%;Bcl-2和Mcl-1 mRNA表达剂量依赖性降低,Bax、Bad、Caspase-3、Beclin1和LC3 mRNA表达剂量依赖性增加,且4μg/ml和8μg/ml与0μg/ml组比较,以上研究指标差别均有统计学意义(P<0.05)。结论:顺铂可诱导鼻咽癌CNE-2细胞发生G2/M期阻滞、细胞凋亡和自噬性细胞死亡,对CNE-2细胞具有杀伤作用,其分子机制可能与Bcl-2表达下调和Caspase-3、Beclin1表达上调有关。     

bcl-x_S增加鼻咽癌细胞对顺铂诱导凋亡的敏感性

目的 :利用bcl xS基因降低肿瘤细胞凋亡阈值 ,促进化疗药物顺铂诱导的鼻咽癌细胞凋亡 ,探索提高顺铂疗效的新途径。方法 :利用脂质体LipofectAmine将含有人bcl xS基因的重组真核表达质粒pcDNA3xS导入人鼻咽癌低分化上皮细胞株CNE 2Z ,G4 18筛选培养后 ,经Westernblot检测bcl xS的表达。以不含有bcl xS基因的pcDNA3质粒转染CNE 2Z作为对照细胞(CNE 2Zneo)。顺铂处理 2种细胞后 ,台盼蓝计数法求得各自的IC50 ,流式细胞仪及荧光染色检测凋亡细胞百分比。结果 :Westernblot检测证实获得稳定表达bcl xS的细胞 (CNE 2ZxS) ,与对照细胞相比 ,其对顺铂的IC50 值明显降低 ,经相同剂量顺铂处理后 ,流式细胞仪及荧光染色检测 ,结果表明 ,其凋亡细胞百分比明显高于对照细胞。结论 :bcl xS能显著增加鼻咽癌CNE 2Z细胞对顺铂诱导凋亡的敏感性     

bcl—xs增加鼻咽癌细胞对顺铂诱导凋亡的敏感性

目的：利用bcl-xs基因降低肿瘤细胞凋亡阈值,促进化疗药物顺铂诱导的鼻咽癌细胞凋亡,探索提高顺铂疗效的新途径。方法：利用脂质体LipofectAmine将含有人bcl-xs基因的重组真核表达质粒pcDNA3xs导入人鼻咽癌低分化上皮细胞株CNE－2Z,G418筛选培养后,经Western blot检测bcl-xs的表达,以不含有bcl-xs基因的pcDNA质粒转染CNE－2Z作为对照细胞（CNE－2Zneo)。顺铂处理2种细胞后,台盼蓝计数求得各自的IC50,流式细胞仪及荧光染色检测凋亡细胞百分比。结果：Western blot检测证实获得稳定表达bcl-xs的细胞（CNE－2Zxs),与对照细胞相比,其对顺铂的IC50值明显降低,经相同剂量顺铂处理后,流式细胞仪及荧光染色检测,结果表明,其凋亡细胞百分比明显高于对照细胞。结论：bcl-xs能显著增加鼻咽癌CNE－2Z细胞对顺铂诱导凋亡的敏感性。     

奥沙利铂对人鼻咽癌细胞株CNE-2细胞生长抑制和凋亡作用的研究

目的:观察奥沙利铂对人鼻咽癌细胞株CNE-2细胞的生长抑制和凋亡作用,为其临床应用提供理论依据.方法:将浓度为0、10、20、40、80μg/ml的奥沙利铂与CNE-2细胞作用24、36、48h,用SRB法检测奥沙利铂对CNE-2细胞的生长抑制率,流式细胞仪分析细胞周期的变化、检测细胞凋亡率,荧光显微镜观察细胞形态学变化.结果:奥沙利铂对CNE-2细胞的生长抑制率随药物浓度和作用时间的增加而增大.流式细胞仪分析显示奥沙利铂主要将CNE-2细胞阻滞于G2/M期.奥沙利铂浓度为80μg/ml 作用48小时,CNE-2细胞生长抑制率为(97.46 ± 1.76)%,CNE-2细胞的早期凋亡率为(4.48 ± 1.23)%、晚期凋亡和继发坏死率为(9.48 ± 2.30)%.荧光显微镜下观察用药组有凋亡细胞存在.结论:奥沙利铂能够抑制人低分化鼻咽癌细胞株CNE-2细胞的增殖,能使CNE-2细胞阻滞于G2/M期,可诱导CNE-2细胞发生一定的凋亡.     

顺铂等化疗药物对胃癌细胞端粒酶活性的影响

目的：探讨端粒酶作为化疗敏感性指标的可行性。方法：选择IC50剂量的顺铂，丝裂霉素C，阿霉素及5－氟脲嘧啶和甲酰四氢叶酸处理胃癌细胞，采用半定量TRAP－银染法检测药物处理前后胃癌细胞端粒酶活性。并应用流式细胞学检测细胞周期和细胞凋亡率。结果：顺铂，丝裂霉素C和阿霉素在诱导两细胞凋亡的同时，下调端粒酶活性，且其抑制作用呈时间依赖关系；5－氟脲嘧啶和甲酰四氢叶酸对胃癌细胞端粒酶活性无明显抑制作用，结论：化疗前后细胞端粒酶活性的变化，可作为化疗敏感性指标。     

顺铂对人肺癌SPCA-1细胞端粒酶活性的影响

目的 观察顺铂(DDP)对人肺癌SPCA-1细胞端粒酶活性的影响。方法 不同浓度的DDP处理体外培养的人肺癌SPCA-1细胞72h，非放射性标记的改良TRAP法测定端粒酶活性，MTT法测定细胞增殖抑制，透射电镜、流式细胞仪观察细胞凋亡。结果 DDP可抑制SPCA-1细胞端粒酶活性，随DDP浓度增大，端粒酶活性抑制增强。MTT结果显示DDP抑制SPCA-1细胞增殖且抑制率有浓度依赖性。透射电镜可观察到典型的细胞凋亡形态学，流式细胞仪结果表明DDP诱导SPCA-1细胞凋亡在一定浓度范围内呈剂量依赖性。结论 端粒酶活性的抑制可能是DDP发挥抗肺癌活性的作用机制之一，端粒酶活性可作为评价DDP抗肺癌化疗效果的指标之一。     

抗端粒酶核酶质粒的构建筛选及其对CNE-2Z细胞增殖与凋亡的影响

背景与目的:已证实端粒酶(telomerase,TLMA)对肿瘤的进展和肿瘤细胞的无限增殖起着重要的决定作用。核酶是具有特殊核酸内切酶活性的反义RNA,可序列特异性地与靶RNA分子配对并切割靶基因RNA。有报道人低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞端粒酶阳性,本实验目的是构建抗端粒酶RNA模板区特异性核酶的真核表达载体并用电穿孔法将其导入人低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞,研究该核酶对CNE-2Z细胞增殖、凋亡的影响。方法:设计合成针对端粒酶RNA模板区的锤头状核酶基因teloRZ作为端粒酶抑制剂,构建3种带有绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)报道基因和嘌呤霉素(puromycin)抗性基因的teloRZ真核表达质粒pGFPuro-teloRZ2.1、pGFPuro-teloRZ7.1、pGFPuro-teloRZ7.7,这3种质粒的不同点在于teloRZ基因和puromycin抗性基因按3种不同方向设计,然后将上述3种质粒及载体质粒pPAT-GFP电转染CNE-2Z细胞,用荧光显微镜检测GFP表达情况;用流式细胞仪、荧光染色法检测细胞增殖指数及凋亡等指标。结果:CNE-2ZGTR7.1细胞(转染目的基因质粒pGFPuro-teloRZ7.1的CNE-2Z细胞)增殖指数(25.100±0.141)%明显低于CNE-2Z细胞(未转染质粒的细胞)的(53.663±16.981)%、CNE-2ZG细胞(转染空载质粒pPAT-GFP的CNE-2Z细胞)的(61.575±5.166)%、CNE-2ZGTR2.1     

顺铂对肝癌细胞凋亡及其细胞周期的影响

目的：探讨顺铂对Hca-F细胞凋亡及细胞周期的影响。方法：采用荧光，透射电镜及流式细胞术分析法检测肝癌细胞凋亡，细胞周期和增殖指数（PI）的变化。结果：CDDP可引起肿瘤细胞凋亡，并随着给药时间的延长，药物浓度的增高，细胞凋亡率随之增高，细胞凋亡形态结构越发典型，表现为核固缩，染色质边集，核小体形成等，同时药物浓度的升高，细胞周期S期比例下降，G0/G1期比例上升，PI增殖指数下降。结论：CDDP可引起细胞凋亡，细胞周期G0/G1期阻滞，使细胞分裂增殖活动受到抑制。     

节拍器化疗对鼻咽癌CNE-1细胞周期和凋亡的影响

目的探讨顺铂节拍器化疗对人鼻咽癌细胞CNE-1细胞周期和细胞凋亡的影响。方法采用MTT方法,检测顺铂对鼻咽癌细胞株CNE-1的半抑制浓度（IC50）,相当于临床中采用6 mg/m^2顺铂小剂量连续化疗的血浆浓度。以低于此浓度的0.10μg/ml作为顺铂节拍器体外化疗参考剂量,采用流式细胞术检测0.10μg/ml顺铂连续作用12 h和96 h细胞周期和细胞凋亡的变化情况。结果MTT法检测顺铂半抑制浓度IC50为0.19μg/ml,0.10μg/ml顺铂作用12 h后检测细胞周期变化,与对照组比较无显著变化;而作用96 h后与对照组相比进入G2/M期细胞比例显著增多,两者差异有统计学意义（P〈0.05）,但作用12 h和96 h后均未检测到明显细胞凋亡现象。结论采用小剂量顺铂作用足够长时间,可以诱导鼻咽癌CNE-1细胞周期发生变化,但是并不能诱导细胞凋亡。细胞周期同步化于G2/M期,为节拍器化疗与放疗的联用提供了可能。     

姜黄素对人鼻咽癌CNE-2Z细胞增殖及 凋亡的影响

 目的探讨姜黄素对人鼻咽癌CNE-2Z细胞增殖及凋亡的影响及其相关的分子机制。方法体外培养的 CNE-2Z细胞经不同剂量姜黄素处理后,用MTT法观察对细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞周期和凋亡 率的改变,Western blot检测姜黄素处理后相关蛋白Bcl-2、Bax表达水平的变化。结果姜黄素对CNE-2Z细 胞的生长和增殖都具有一定程度的抑制作用,阻断细胞于S期和G2/M期。姜黄素处理后CNE-2Z细胞凋亡抑 制基因Bcl-2蛋白表达减少,同时促凋亡基因Bax蛋白表达增加。 结论姜黄素可抑制CNE-2Z细胞增殖并促进 其凋亡。     

Diagnostic Usefulness of Telomerase Activity in Nasopharyngeal Carcinoma

Telomeres are specialized structures at the ends of eukaryotic chromosomes which are composed of simple repetitive G-rich hexameric sequences. Activation of telomerase, a ribonucleoprotein that synthesizes telomeric DNA, is found in most malignant tumors. However, little data is available concerning the correlation between telomerase activity and NPC (nasopharyngeal carcinoma). In this study, telomerase activation was determined using the TRAP (telomerase repeat amplification protocol) assay in 62 nasopharyngeal biopsies (25 NPC, 25 non-malignant nasopharyngeal lymphoid tissues, 12 post-irradiated nasopharyngeal tissues). The results showed that strong telomerase activity was present in both NPC and non-malignant nasopharyngeal biopsies. Post-irradiated nasopharyngeal samples had a significantly lower telomerase activity than NPC and non-malignant nasopharyngeal lymphoid tissues. It is well known that nasopharyngeal tissue is infiltrated by numerous lymphocytes, which might retain telomerase activity. Therefore, the finding that the telomerase activation was lowest in post-irradiated nasopharyngeal tissues is reasonable because of the destruction of activated lymphocytes and NPC by radiation. NPC biopsies with positive lymph node involvement exhibited higher levels of telomerase compared to those without lymph node involvement. Our data indicate a positive association between telomerase activity and tumor potential for lymphatic spreading in limited local tumors. In addition, telomerase activity may be useful as a diagnostic marker in the detection of tumor cells in recurrent NPC, but not in primary NPC.     

5-Aza-C对人鼻咽癌细胞hTERT基因表达及端粒酶活性的影响

目的 研究去甲基化药物5-氮杂胞嘧啶核苷（5-Azacytidine, 5-Aza-C）对鼻咽癌细胞亚端粒区D4Z4甲基化状态、hTERT基因表达及端粒酶活性的影响。方法 常规培养鼻咽癌CNE, CNE1,CNE2及5-8F细胞系。5-Aza-C处理鼻咽癌细胞后,甲基化测序聚合酶链反应（MSP）法检测亚端粒区D4Z4甲基化;RT-PCR检测hTERT mRNA水平;端粒重复序列扩增法（telomeric repeat amplification protocol,TRAP）法检测端粒酶活性。结果 5-Aza-C处理后,四种鼻咽癌细胞系的亚端粒区D4Z4序列的甲基化水平较处理前明显下降。2.5 μmol/L 5-Aza-C处理后,四种鼻咽癌细胞hTERT mRNA的表达明显下调,端粒酶活性显著抑制。 结论 在鼻咽癌的发生中,亚端粒区的DNA甲基化水平紊乱起了一定的作用,去甲基化药物5-Aza-C能下调hTERT表达,抑制端粒酶活性。探讨鼻咽癌细胞中hTERT表达与亚端粒区CpG岛甲基化状态之间的关系,可能为亚端粒区染色体结构异常在鼻咽癌发生中的作用提供深刻见解。     

鼻咽癌组织端粒酶各组分基因表达的研究

目的：探讨端粒酶各组分基因在鼻咽癌（nasopharynegal carcinoma,NPC)组织及鼻咽慢性炎症粘膜（chronic inflammation of nasopharyngeal epithelium,CINE)组织中的表达情况。方法：利用RT-PCR方法检测鼻咽癌组织及鼻咽慢性炎症粘膜组织端粒酶各组分基因（hTR、TP1mRNA和hRNA)的表达情况。方法：利用RT-PCR方法检测鼻咽癌组织及鼻咽慢性炎症粘膜组织端粒酶各组分基因（hTR、TP1mRNA和hTERTmRNA)的表达。结果：43例NPC组织中,hTR、TP1mRNA和hTERTmRNA表达阳性率分别为90.7%、88.4%和16例CINE组织中,hTR、TP1 RNA和hTERTmRNAmRNA表达阳性率为87.5%、87.5%和0%;仅hTERTmRNA在鼻咽癌组织中的表达显著高于鼻咽慢性炎症粘膜组织中的表达,而hTR或TP1mRNA在鼻咽癌组织中的表达和鼻咽慢性炎症粘膜组织中的表达。结论：hTERTmRNA可能在端粒酶活性调节中起重工作用;hTERTmRNA的表达水平,可作为鼻咽癌诊断指标之一。     

雌、孕激素对子宫内膜癌细胞端粒酶活性及细胞周期的影响

 目的　研究雌、孕激素对子宫内膜癌HHUA细胞端粒酶活性及细胞周期的影响。方法　用TRAP ELISA法和实时荧光定量PCR技术检测雌、孕激素作用前后HHUA子宫内膜腺癌细胞系端粒酶活性及hTERT RNA的表达 ,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡的变化。结果　雌激素对HHUA细胞端粒酶活性和hTERT的表达有明显增强作用 (P <0 .0 5 ) ,而孕激素对其影响不显著。孕激素作用下 ,G1期细胞比例明显增高 ,S期及G2 ～M期细胞比例明显降低 (P <0 .0 5 ) ;细胞的分裂、增殖受到明显抑制 ;凋亡细胞比例明显增加。雌激素的作用则相反。结论　雌激素能增强子宫内膜癌细胞端粒酶活性和hTERT的表达 ,促进其分裂和增殖 ,降低凋亡细胞比例 ,孕激素的作用相反     

口虾蛄提取物对人鼻咽癌CNE-2Z细胞的抑制作用

目的研究口虾蛄乙酸乙酯提取物对人鼻咽癌CNE-2Z细胞的抑制作用及可能机制。方法于细胞培养镜下观察细胞形态学改变和计数法测定生长曲线;采用3H-脱氧胸苷掺入法测定对DNA合成的影响,采用MTT比色法检测给药后鼻咽癌细胞的增殖抑制情况。结果口虾蛄乙酸乙酯提取物作用后,癌细胞生长延缓并萎缩,胞质粗糙,有大量颗粒状物堆积,而且药物浓度越大,形态学改变越明显;生长曲线测定、3H-脱氧胸苷掺入法及MTT比色法实验结果显示,口虾蛄乙酸乙酯提取物对CNE-2Z细胞的增殖和生长有显著抑制作用,并呈明显的时间-剂量依赖关系,当提取物浓度为400μg/mL以上时,其对CNE-2Z细胞的掺入抑制率和增殖抑制率均高于阳性对照药5-Fu组。结论口虾蛄乙酸乙酯提取物对鼻咽癌CNE-2Z细胞具有细胞毒作用,其机制可能通过干扰细胞代谢,改变细胞外衣的性质抑制CNE-2Z细胞增殖。     

顺铂诱导人结肠癌细胞凋亡的实验研究

 采用细胞培养方法，通过AO染色，DNA微电泳及电镜观察顺铂作用下结肠癌细胞凋亡过程。实验结果表明：结肠癌SW1116细胞在不同浓度的顺铂作用2小时后，呈现不同程度的凋亡。电镜观察到凋亡的细胞表现为细胞核皱缩，核内染色质结块状，趋边缘性分布；DNA微电泳呈拖尾现象，提示凋亡细胞内DNA片断化；凋亡细胞AO染色呈阳性反应，其阳性率随顺铂的浓度增高而递增，与对照组相比，差异有显著意义（P＜0．05）。因此认为顺铂可诱导和促进结肠癌细胞凋亡，这一现象可能是顺铂抗癌作用之一。     

GFP报道基因在鼻咽癌细胞系CNE-2Z中的表达

目的　观察GFP报道基因在鼻咽癌细胞系CNE 2Z中的表达。方法　将带有GFP报道基因的载体质粒pPAT GFP和 3种带有GFP报道基因及目的基因抗端粒酶核酶基因teloRZ的不同质粒 pGFPuro teloRZ 2 .1、pGFPuro teloRZ 7.1、pGFPuro teloRZ 7.7,转染到鼻咽癌CNE 2Z细胞系中 ,用荧光显微镜及流式细胞仪检测转染细胞在固定后的活细胞中GFP基因的表达情况。结果　GFP基因在活细胞中有表达 ,而在固定后无表达 ,且目的基因的插入影响GFP基因的表达。结论　GFP基因在转染了含目的基因质粒的鼻咽癌CNE 2Z细胞中稳定表达 ,可以在CNE 2Z细胞株和抗端粒酶模板区核酶的研究中作为质粒转染和基因表达的报道基因     

口虾蛄提取物对人鼻咽癌细胞明胶酶分泌及活性的影响

目的研究口虾蛄提取物对人鼻咽癌细胞（CNE-2Z）明胶酶分泌及活性的抑制作用。方法采用明胶酶谱法,检测口虾蛄提取物对CNE-2Z细胞明胶酶分泌及活性的影响。结果口虾蛄提取物能以量效方式抑制CNE-2Z细胞明胶酶B分泌及其活性。结论口虾蛄提取物可能通过抑制明胶酶B分泌和活性,从而降低CNE-2Z细胞侵袭能力。