线粒体抗病毒信号蛋白MAVS真核表达质粒的构建及表达

目的:构建线粒体抗病毒信号蛋白(mitoehondrial antiviral signaling protein,MAVS)真核表达质粒.方法:从人胚肾细胞系HEK293T细胞的总RNA中经过逆转录和PCR获得MAVS的全长cDNA双链片段.经过酶切后连接到真核表达载体pcDNA3/flag中,挑选出转化生成的阳性克隆进行测序,将序列正确的重组质粒命名为pcDNA3/flag-MAVS.借助脂质体转染peDNA3/flag-MAVS质粒到HEK293T细胞中,用Westem印迹检测目的蛋白的表达.同时用β干扰素的荧光素酶报告基因(IFN-β-luc)检测MAVS蛋白活性.结果:Western印迹实验证明pcDNA3/flag-MAVS可以在HEK293T细胞中表达MAVS,并且能使IFN-β报告基因活性明显增强.结论:构建了重组质粒peDNA3/flag-MAVS,在细胞中表达MAVS后具有刺激IFN-β转录的生物活性.     

感觉神经元特异性受体rMrgD基因的克隆与表达

目的克隆rMrgD基因并于HEK293细胞中表达。方法利用聚合酶链反应技术,从总RNA中扩增出目的基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,构建真核表达rMrgD载体,瞬时转染人胚肾293细胞得到重组质粒表达细胞株。通过免疫荧光和Western印迹检测对表达产物进行鉴定。结果直接和间接免疫荧光实验皆表明rMrgD主要定位于细胞膜上,Western印迹检测证实rMrgD在HEK293细胞主要以单体和二聚体形式存在。结论含有rMrgD基因的重组质粒在人胚肾293细胞中获得表达,主要定位于细胞膜上。本研究为进一步探究rMrgD受体的功能奠定了基础。     

人转化铁受体基因的克隆和表达

目的探讨人转化铁受体基因（hTfR）克隆和高效表达的方法及临床意义。方法用RT-PCR法从人胚肝、肺组织中克隆hTfR基因，构建重组表达质粒pcDNA3-hTfR和pEGFP-C1-hTfR，转染人胚肾上皮HEK293细胞。用Western印迹法检测pcDNA3-hTfR转染HEK293细胞后hTfR蛋白的表达情况；用荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜观察重组pEGFP-C1-hTfR质粒转染HEK293细胞后hTfR蛋白的表达水平及亚细胞定位。结果经过DNA测序证实，克隆的hTfR基因为全长cDNA序列（2332bp）。Western印迹法检测到转染细胞能有效表达190×10^3的hTfR蛋白，荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白（GFP）-hTfR融合蛋白主要定位于细胞膜。结论从人胚肝、肺组织中可以成功克隆hTfR基因，该基因转染HEK293细胞后可获得hTfR蛋白的高效表达。hTfR主要定位于细胞膜。     

感觉神经元特异性受体rMrgE基因的克隆与表达

目的 克隆感觉神经元特异性受体rMrgE基因并于HEK293细胞中表达.方法 利用聚合酶链式反应技术,从大鼠背根神经节总RNA中扩增出目的基因rMrgE,克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-hisB中,构建真核表达rMrgE载体,瞬时转染人胚肾293细胞得到重组质粒表达细胞株.采用RT-PCR、免疫荧光和Western印迹检测对表达产物进行鉴定.结果 与结论含有rMrgE基因的重组质粒在人胚肾293细胞中获得表达,主要定位于细胞膜上.本研究为进一步探究rMrgE受体的功能奠定了基础.     

外源表达人CPNE5诱导细胞内质网应激反应

目的:探讨外源表达人CPNE5诱导细胞发生内质网应激反应的机制.方法:分别转染空载体pcDNA4和人CPNE5编码区序列的真核表达质粒pcDNA4-CPNE5至HEK293细胞,48 h后收集细胞,通过RT-PCR、Western印迹检测基因mRNA及蛋白的表达.结果:外源表达人CPNE5蛋白可以上调内质网应激特征分子GRP78、CHOP、JNK1基因的表达.结论:外源表达人CPNE5可以诱导HEK293发生内质网应激反应.     

GRP78在HepG2细胞的亚细胞定位及真核表达

目的 构建GRP78的真核表达载体以检测GRP78在HEK293细胞中的表达和定位.方法采用激光共聚焦显微镜观察GILP78在HepG2细胞中的定位,用RT-PCR方法从HepG2细胞中扩增GRP78 cDNA序列,构建真核表达载体peDNA3.1-GRP78,转染HEK293细胞,分别用Western blotting和激光共聚焦显微镜检测GRP78在HEK293细胞中的表达和定位.结果 GRP78在HepG2细胞的胞膜和胞质均有表达,GRP78在细胞膜上均匀分布.双酶切鉴定和核酸序列分析证实pcDNA3.1-GRP78真核表达质粒构建成功,该表达质粒转染HEK293细胞后可以瞬时表达GRP78蛋白.结论 正常状态下,GRP78在HepG2细胞胞膜和胞质均有表达.pcDNA3.1-GRP78转染HEK293细胞后能瞬时表达GRP78蛋白,为进一步研究GRP78的功能提供了重要工具.     

人野生型和突变型CITED2真核表达质粒的构建与表达

目的 构建人转录辅助因子CITED2突变型(c.573-578del6)及野生型真核表达质粒并检测两种重组质粒CITED2蛋白的表达情况.方法 分别以健康儿童和CITED2基因突变的先天性心脏病患儿血细胞DNA为模板,PCR定向克隆扩增野生型和突变型CITED2编码链,分别T/A克隆至pMD19-T simple质粒上,筛选出野生型和突变型CITED2的T载体重组质粒.应用DNA重组技术将T载体重组质粒上的CITED2基因片段亚克隆入真核表达载体pEGFP-C1,构建pEGFP-C1-wtCITED2和pEGFP-C1-mtCITED2真核表达质粒,并分别转染至HEK293细胞,24h后在荧光显微镜下观察质粒转染情况,48h后应用流式细胞仪检测转染效率,Western blotting检测CITED2蛋白的表达.结果 成功构建了人野生型pEGFP-C1-wtCITED2和突变型pEGFP-C1-mtCITED2真核表达质粒.转染至HEK293细胞后24h,在荧光显微镜下可观察到各转染组EGFP的表达,转染后48h流式细胞仪检测转染效率为50％ ～ 60％,Western blotting检测可见CITED2蛋白与EGFP的融合表达.结论 成功构建了人转录辅助因子CITED2突变型及野生型真核表达质粒,并检测到CITED2蛋白的表达.     

人β-防御素3基因在COS-7细胞中的表达

目的：构建人β—防御素3(hBD3)的真核表达载体，建立稳定表达hBD3的细胞株。方法：用EcoR Ⅰ酶切合有hBD3全长基因的pGEM-hBD3重组质粒，获得其编码区全长序列，将其连接入EcoR Ⅰ预处理过的pcDNA3中。转化大肠杆菌，酶切鉴定筛选出插入方向正确的转化子。采用脂质体转染法将重组pcDNA3-hBD3真核表达载体导入COS-7细胞，用G418进行抗性筛选，用RT-PCR和Western印迹检测目的基因hBD3的mRNA和蛋白表达水平。结果与结论：构建的pcDNA3-hBD3真核表达载体转染COS-7细胞后可稳定表达hBD3的mRNA和蛋白，且蛋白主要以分泌形式存在于培养上清中。     

小鼠ATP酶β亚单位真核表达载体的构建和细胞内定位研究

目的构建小鼠ATP酶β亚单位(ATPaseβ)真核表达载体,并观察其在哺乳动物细胞中的表达定位情况。方法取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,反转录为cDNA,以cDNA为模板PCR扩增得到ATPaseβ编码序列,将其连接到pMD18-T载体上,然后以pMD18-ATPaseβ为模板扩增得到ATPaseβ编码序列,再将其克隆到真核表达载体pcDNA3/HA上。采用脂质体转染法转染NIH 3T3细胞及293细胞,在荧光显微镜下观察结果。结果 PCR、双酶切和测序结果表明,重组质粒pcDNA3/HA-ATPaseβ构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH 3T3细胞中表达,表达产物主要定位于细胞质,细胞膜上也有表达,而在293细胞中只表达于细胞质。结论成功构建了带有HA标签的小鼠ATPaseβ真核表达载体,该载体能够在哺乳动物NIH 3T3及293细胞中有效表达并正确定位,为进一步研究ATPaseβ的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。     

人源5-羟色胺转运体稳定表达细胞系的建立及其功能探究

目的建立人源5-羟色胺转运体（human serotonin transporter,hSERT）稳定表达细胞系,并对细胞系hSERT的结合活性和重摄取功能进行初步研究。方法采用脂质体转染法将hSERT转染于母细胞,即人胚胎肾（human embryo kidney,HEK）293细胞,应用抗生素G418（800μg/ml）压力筛选,并采用RT-PCR和Western印迹法在基因和蛋白水平对HEK293-hSERT细胞系进行鉴定和稳定性验证;采用放射性配体结合实验检测其与氚标西酞普兰（[3H]-citalopram）的结合活性,并检测其对[3H]5-HT的重摄取功能。结果 RT-PCR和Western印迹结果表明,所建立的HEK293-hSERT细胞系在15代内（P1,P5,P10,P15）均稳定表达hSERT;放射配体结合实验表明,HEK293-hSERT细胞系与[3H]-西酞普兰具有明显的特异性结合;并且在100 nmol/L[3H]5-HT条件下,具有明显的5-HT重摄取功能,这一作用可被10μmol/L的氟西汀所阻断,而母细胞HEK293无此功能。结论本研究所建立的HEK293-hSERT细胞系可稳定表达SERT,并且具有内源性SERT的结合和重摄取功能,是一种稳定表达功能性hSERT的细胞系。     

miR-1抑制SDF-1表达和分泌调控HMSC-bm向肝癌细胞迁移

目的 明确肿瘤抑制性micro RNA-1（miR-1）能否通过抑制SDF-1的表达和分泌,调控骨髓间充质干细胞（HMSC-bm）向肿瘤组织的转移.方法 （1）分别利用miR-1表达质粒pSuper-miR-1和miR-1反义寡核苷酸,在肝癌细胞系HepG2中过表达或下调miR-1,Western blot和酶联免疫吸附实验分别检测肝癌细胞蛋白裂解物和培养上清液中SDF-1的表达和分泌水平;（2）构建融合SDF-1 3UTR的pGL3重组萤光素酶报告基因载体,将其与pSuper-miR-1共转染HEK293细胞,利用双萤光报告基因检测系统检测重组萤光素酶的表达情况.（3）利用pSuper-miR-1或miR-1反义寡核苷酸转染接种于Transwell下层小室的HepG2细胞过表达miR-1或下调miR-1水平,检测TransweH上层小室HMSC-bm向下层小室HepG2肝癌细胞的迁移情况.结果 （1）在肝癌细胞,HepG2过表达miR-1能够显著抑制SDF-1蛋白表达和分泌,而下调miR-1水平则能够诱导SDF-1的表达和分泌.（2） miR-1能够抑制携带SDF-1 3UTR的pGL3重组萤光素酶报告基因活性.（3）在Transwell下层小室的HepG2细胞中过表达miR-1后,上层小室中HMSC-bm向下层小室迁移细胞数量显著减少,而下调下层小室HepG2细胞中miR-1表达水平,则明显增加HMSC-bm向HepG2肝癌细胞的迁移.结论 miR-1能够直接抑制肝癌细胞SDF-1的表达和分泌,并藉此降低肝癌细胞对HMSC-bm的趋化作用.     

重组人sIL-2Rα在HEK293细胞中的分泌性表达与鉴定

目的在HEK293细胞瞬时表达带有组氨酸标签的重组人sIL-2Rα的胞外功能区片段,并进行纯化与鉴定。方法对GenBank中IL-2Rα膜外区基因序列进行优化,并在3′端融合组氨酸标签序列的基因,人工合成该基因并将其克隆到表达载体pL-293;转染HEK293细胞瞬时表达sIL-2Rα;表达产物His标签纯化;SDS-PAGE和Western印迹对表达产物进行鉴定。结果表达产物中在相对分子质量为48 000处可见与目的蛋白相对分子质量相符的条带,该条带可被sIL-2Rα单克隆抗体识别。结论构建的重组sIL-2Rα质粒能够在HEK293细胞瞬时表达,表达量为1~1.5 mg/L。     

串联MS2衣壳蛋白和MS2特异结合RNA表达载体构建及应用

目的构建体内研究RNA-蛋白相互作用的表达载体。方法利用MS衣壳蛋白可与MS2结合位点（MS2bs）RNA特异性结合的特点,通过设计特异引物,构建pcDNA3．0-Flag．2XMS2和pcDNA3．0—12XMS2％s表达载体,以及表达MEG3非编码RNA的表达载体pcDNA3．0-EG3V1—12XMS2bs。共转染细胞,进行RNA免疫沉淀,所得RNA进行实时定量PCR分析验证。结果成功构建了pcDNA3．0-Flag-2XMS2和pcDNA3．0．12XMS2bs表达载体,实时定量PCR结果表明,与对照相比能明显富集MEG3V1非编码RNA分子。结论成功构建了体内研究RNA-蛋白质相互作用的表达载体,为RNA一蛋白相互作用研究提供了新的技术方法。     

稳定转染小鼠IL-17全长基因的乳腺癌细胞株的建立及基因转染对4T1细胞的影响

目的建立稳定转染小鼠IL-17基因全长的小鼠乳腺癌4T1细胞株,并进行鉴定。方法脂质体法将携带小鼠IL-17基因全长的真核表达载体pcDNA3．1转染小鼠乳腺癌细胞4T1,经G418筛选出稳定表达IL-17的细胞株;镜下观察细胞形态,RT-PCR法、Western印迹和激光共聚焦法检测目的基因和蛋白的表达;收集转染和未转染IL．17的4T1细胞的培养上清,分别与巨噬细胞RAW264．7共培养,ELISA法检测RAw264．7细胞培养上清中IL-6水平;MTS法检测细胞的增殖情况,流式细胞技术检测细胞周期、凋亡以及细胞表面MHCI、MHC11、淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）等分子表达。结果获得1株稳定表达IL-17的4T1细胞,而且其培养上清可刺激小鼠巨噬细胞RAW264．7产生IL-6,证明该细胞可表达功能性IL-17。结论成功建立了稳定转染IL-17基因的小鼠乳腺癌细胞株。     

人MCHR2基因shRNA真核表达载体构建及鉴定

目的 构建针对人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)的shRNA真核表达载体,并在人胚肾293(HEK293)细胞中观察其对MCHR2基因表达的影响.方法 根据MCHR2基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,并将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定.用脂质体将重组质粒转染到HEK293细胞中,观察其在mRNA和蛋白水平对MCHR2的影响.结果 通过酶切鉴定和序列测定,成功构建四条表达短发夹RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到HEK293细胞株中.四条shRNA真核表达载体在mRNA水平对MCHR2抑制率分别为54.9%、66.4%、56.9%、45.8%;在蛋白水平对MCHR2抑制率分别为62.0%、81.0%、73.3%、44.2%.结论 针对人MCHR2的shRNA真核表达载体成功构建及鉴定为进一步研究MCHR2功能奠定了良好的基础.