线粒体抗病毒信号蛋白MAVS真核表达质粒的构建及表达

目的:构建线粒体抗病毒信号蛋白(mitoehondrial antiviral signaling protein,MAVS)真核表达质粒.方法:从人胚肾细胞系HEK293T细胞的总RNA中经过逆转录和PCR获得MAVS的全长cDNA双链片段.经过酶切后连接到真核表达载体pcDNA3/flag中,挑选出转化生成的阳性克隆进行测序,将序列正确的重组质粒命名为pcDNA3/flag-MAVS.借助脂质体转染peDNA3/flag-MAVS质粒到HEK293T细胞中,用Westem印迹检测目的蛋白的表达.同时用β干扰素的荧光素酶报告基因(IFN-β-luc)检测MAVS蛋白活性.结果:Western印迹实验证明pcDNA3/flag-MAVS可以在HEK293T细胞中表达MAVS,并且能使IFN-β报告基因活性明显增强.结论:构建了重组质粒peDNA3/flag-MAVS,在细胞中表达MAVS后具有刺激IFN-β转录的生物活性.     

真核表达载体PCMV4-hTGFβ1的构建及鉴定

转化生长因子β（ＴＧＦβ）是一大类多功能的细胞增殖、分化调节蛋白,它参与了体内多种的病理、生理过程,如细胞外基质调节、胚胎发育、骨的形成与重建;而且在创伤愈合、免疫抑制、骨髓保护、肿瘤抑制等方面,具有广阔的应用前景〔１、２〕。因此,ＴＧＦβ的研究具有...     

与凋亡相关的斑点样蛋白在大鼠急性胰腺炎中的作用机制

目的 研究大鼠发生急性胰腺炎时,与凋亡相关的斑点样蛋白(ASC)在胰腺组织的表达及其与caspase-1和IL -1β的关系,为评价 ASC在大鼠急性胰腺炎时的作用机制提供实验依据.方法 (1)将20只健康、成年的SD大鼠随机分成2组,一组进行急性胰腺炎造模,另一组作为正常对照组.造模24 h后处死大鼠,取大鼠新鲜血清,测定血清淀粉酶活性及IL-1β含量.取大鼠胰腺组织,用免疫组化技术检测ASC和caspase-1在胰腺组织中的表达情况.(2)RT-PCR法扩增大鼠胰腺组织中ASC mRNA.结果 (1)急性胰腺炎组血清淀粉酶和IL-1β水平较正常对照组水平均显著升高,两者间差异有统计学意义(P<0.01).(2)免疫组化检测、分析发现:ASC和caspase-1在正常对照组大鼠胰腺组织中少量表达,在急性胰腺炎组表达显著增加,两组间差异有统计学意义(P<0.01).(3) RT-PCR检测发现:急性胰腺炎组大鼠胰腺组织中ASC mRNA的含量明显多于正常对照组.结论 当发生胰腺炎时,大鼠胰腺组织中ASC的表达上调并调节caspase-1的活化,导致IL-1β的分泌增加,引起炎症反应,从而证明ASC在胰腺炎的发病中起重要作用.     

rhGM-CSF基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞和小鼠体内的表达

将ｈＧＭＣＳＦ基因克隆至真核表达质粒ｐＣＤＳ中，构建成重组质粒ｐＣＧ１。用电穿孔法将质粒ｐＣＧ１导入ＣＯＳ７细胞和直接注射小鼠骨骼肌内，ＥＬＩＳＡ检测显示质粒ｐＣＧ１转染ＣＯＳ７细胞后４８、７２、９６ｈ和肌注质粒ｐＣＧ１后ｄ１０、ｄ１５、ｄ２０、ｄ２５小鼠体内均有ｈＧＭＣＳＦ的表达。生物学活性检测显示含肌注ｐＣＧ１的小鼠血液有维持ＴＦ１细胞生长的作用，表明重组质粒ｐＣＧ１表达分泌的ｈＧＭＣＳＦ具有生物学活性     

微丝相关蛋白hHBRK1突变体的构建、表达及纯化

目的：构建微丝相关蛋白hHBRK1截短体和突变体原核表达载体，并表达及纯化融合蛋白。方法：采用常规PCR并结合定点突变技术，对hHBrkl基因进行缺失和点突变；利用限制性内切酶将PCR产物克隆至原核表达载体pGEX-4T；IPTG诱导融合蛋白表达，通过谷胱甘肽一琼脂糖纯化技术分离纯化GST融合蛋白。结果与结论：构建了包括氨基端缺失截短体hHBRK1-AN、羧基端缺失截短体hHBRK1-AC和点突变蛋白hHBRKl-S^56G^57在内的原核表达质粒，分离获得较高纯度的重组hHBRKl突变体融合蛋白，Western杂交证实纯化蛋白为GST融合蛋白。本实验为进一步研究hHBRK1的相互作用蛋白及其可能的结合位点提供了基础。     

电离辐射对EL-4细胞Caspase-3蛋白表达的影响

Caspase-3（cysteinyl aspartic acid protease-3）是人类白细胞介素1β转化酶家族的重要成员之一,是细胞凋亡过程中的重要激酶.在凋亡的执行阶段,Caspase-3负责对全部或部分关键性蛋白的酶切（激活或灭活）.许多凋亡调节因子最终作用于下游效应器Caspase-3,形成凋亡特征性改变[1].电离辐射可诱导多种正常组织和肿瘤组织发生凋亡.笔者采用流式细胞术系统研究了不同剂量X射线对Caspase-3蛋白表达的影响,从而为探讨电离辐射引起细胞凋亡机制提供一定的科学依据.     

PINCH-1蛋白的功能及与疾病的关系

PINCH蛋白(particularly interesting new cysteine-histidinerich protein)是LIM家族成员,包括PINCH-1[1]和PINCH-2[2]两个成员.PINCH-1在整合素和生长因子信号等的传导中起着十分重要的接头联结作用,与相关疾病,特别是肿瘤的发生、发展有一定的关系;PINCH-2则是PINCH-1的一个新发现的同源分子,它与PINCH-1在分布和功能上有很大重叠.本文主要就PINCH-1蛋白的相关研究情况作一综述.     

人表皮细胞生长因子基因真核表达质粒pcDNA3-hEGF的构建

目的 :构建人表皮细胞生长因子 (hEGF)基因真核表达质粒 ,为深入研究hEGF在组织修复中的分子调节机制及临床应用提供物质基础。方法 :含hEGFcDNA的pUC18-hEGF质粒于大肠杆菌JM10 9内扩增 ;提取及纯化pUC18-hEGF质粒 ;经DNA序列分析其所含hEGFcDNA ;限制性酶切hEGFcDNA片段 ,连接酶连接到真核表达质粒pcDNA3 -neo内 ,克隆出真核表达质粒pcDNA3 -hEGF ;再经限制性酶切鉴定hEGF表达质粒。结果 :提取及纯化的pUC18-hEGF质粒含有大小正确的hEGFcDNA碱基片段 ,其碱基序列为编码目的基因的正确序列 ;凝胶电泳结果证明已将此片段克隆到pcDNA3 -hEGF内。结论 :成功地构建了hEGF基因的真核表达质粒pcDNA3 -hEGF。     

基质金属蛋白酶-1shRNA真核表达载体的构建

目的 构建基质金属蛋白酶-1(MMP-1)特异的RNA干扰质粒载体.方法 根据GenBank 数据库提供的MMP-1基因核苷酸序列,选择设计能转录短发夹状RNA (Short hairpin RNAs,shRNA) 的DNA 序列,并与pWH1质粒载体连接,用酶切的方法 进行鉴定;将构建成功的特异性表达载体(pWH1-MMP1)稳定转染至人腺样囊性癌ACC-M细胞系后,应用RT-PCR、免疫组织化学及Western Blot对细胞MMP1的表达进行检测.结果 在成功转染pWH1-ACC-M表达载体的ACC-M细胞中,MMP1 mRNA和蛋白的表达明显降低.结论 成功构建了MMP1特异性shRNA表达载体,可有效地沉默MMP1基因,为进一步研究MMP1表达与腺样囊性癌增殖和转移的相关性奠定了一定的实验基础.     

人血管生成素-1真核表达载体的构建与表达

目的构建人血管生成素-1的真核表达载体,真核表达人血管生成素-1蛋白并进行纯化。方法通过聚合酶链反应（PCR）将人血管生成素-1基因片段插入B7载体中构建真核表达载体,通过转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞进行真核表达。结果成功构建了B7Ang-1真核表达载体,在CHO细胞中进行了稳定表达,获得了纯化的人血管生成素-1蛋白。结论真核系统表达的人血管生成素-1蛋白具有良好的抗原性,为进一步的生物活性研究和临床应用奠定了基础。     

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达

目的 构建人中性粒细胞多肽1(HNPl)基因真核表达载体,为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础。方法 从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNPl基因cDNA片段,将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接,经酶切鉴定及测序确证,将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中．用脂质体转染CA3S-7细胞,用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达。结果 从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致,并在COS-7细胞中获高效瞬时表达。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1,为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础。     

小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体，并检测其在COS-7细胞中的表达。方法：将目的基因4-1BBL克隆人pUCl9载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定。亚克隆入真核质粒pIRES2-EGFP，构建真核表达载体pIRES2-EGFP-m4-1BBL。用脂质体法将重组质粒转入COS-7细胞，以RT-PER和观察细胞内荧光的方法检测m4-1BBL的表达。结果：酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人4-lBBL全长cDNA编码序列，转染实验表明4-lBBL基因能在COS-7细胞中表达。结论：鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS-7中的表达均获成功，为进一步研究奠定了基础。     

人MCHR2基因shRNA真核表达载体构建及鉴定

目的 构建针对人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)的shRNA真核表达载体,并在人胚肾293(HEK293)细胞中观察其对MCHR2基因表达的影响.方法 根据MCHR2基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,并将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定.用脂质体将重组质粒转染到HEK293细胞中,观察其在mRNA和蛋白水平对MCHR2的影响.结果 通过酶切鉴定和序列测定,成功构建四条表达短发夹RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到HEK293细胞株中.四条shRNA真核表达载体在mRNA水平对MCHR2抑制率分别为54.9%、66.4%、56.9%、45.8%;在蛋白水平对MCHR2抑制率分别为62.0%、81.0%、73.3%、44.2%.结论 针对人MCHR2的shRNA真核表达载体成功构建及鉴定为进一步研究MCHR2功能奠定了良好的基础.     

丙型肝炎病毒NS3区7个抗原表位融合基因载体的构建及在真核细胞的表达

目的 建立丙型肝炎病毒非结构蛋白3（NS3）区7个辅助T细胞抗原表位融合基因的真核表达载体,并在真核细胞中表达产物,为进一步研究应用HCV NS3序列进行预防HCV感染的DNA免疫的研究创造条件。方法合成3对相互重叠的寡核苷酸引物,涵盖NS3区7个辅助T细胞抗原表位,细胞通过重叠延伸PCR方法,将它们拼接在一起构建了一个多肽融合基因,经克隆测序后,插入真核表达载体pEGFP-N3和pBuDCE中,用构建的pEGFP-DR4质粒分别转染293T和B淋巴细胞系046W,用pBuDCE-DR4质粒转染293T细胞,用Western印迹和流式细胞仪检测其表达。结果经测序证实成功的将丙型肝炎病毒NS3区7个辅助T细胞抗原表位基因序列拼接成融合基因,构建的pEGFP-DR4质粒在293T和B淋巴细胞系046W中均表达了预期的融合蛋白36kD。构建的pBuDCE-DR4质粒在293T细胞中可观察到预期的13kD的多肽融合蛋白。结论本研究建立了能够在真核细胞表达HCVNS3区7个辅助T细胞抗原表位融合基因的细胞系。     

PRDX3真核表达载体构建及亚细胞定位

目的：构建带FLAG标签的过氧化物还原酶3（peroxiredoxin3,PRDX3, PRX3）的真核表达载体,并对其在人舌癌SCC15细胞中的定位进行检测。方法以乳腺文库为模板,PCR扩增带有FLAG标签的PRDX3基因片段,并将扩增产物插入到PCDH空载体中,构建成PCDH－FLAG－PRDX3,质粒测序正确后瞬时转染入人胚肾293T细胞, Western免疫印迹检测克隆载体的表达情况,细胞免疫荧光实验检测PRDX3的亚细胞定位。结果双酶切和测序结果表明,PCDH－FLAG－PRDX3真核表达载体构建成功,转染293T细胞后成功表达了FLAG－PRDX3融合蛋白;细胞免疫荧光显示FLAG－PRDX3蛋白定位于舌癌SCC15细胞的细胞质中,不存在于细胞核内。结论成功构建了带FLAG标签的PRDX3真核表达载体,并检测其定位于舌癌SCC15细胞质中,为进一步明确PRDX3在舌癌发生发展中的功能及分子机制奠定基础。