不同接种方法构建组织工程化椎间盘纤维环细胞支架复合体的对比研究

目的 在以脱矿脱细胞骨基质环为支架以纤维环细胞为种子细胞构建组织工程化椎间盘纤维环细胞支架复合体过程中,探索最佳的构建复合体方法.方法 分别使用纤维蛋白凝胶接种技术和传统的直接接种技术一静置法构建技术构建组织工程化椎间盘纤维环细胞支架复合体.对构建产物进行倒置显微镜观察、扫描电镜观察和细胞计数,比较两方法的效果.结果 纤维蛋白凝胶接种技术构建的细胞支架复合体.细胞粘附更多、增殖更迅速.结论 纤维蛋白凝胶接种技术在以脱矿脱细胞骨基质环为支架以纤维环细胞为种子细胞构建组织工程化椎间盘纤维环细胞支架复合体过程中,比静置法效果更好.     

脱细胞软骨基质来源的多孔支架复合山羊髓核细胞体内初步构建组织工程髓核的实验研究

[目的]探讨脱细胞软骨基质多孔支架复合PKH26标记的山羊髓核细胞体内异位构建组织工程髓核的可行性.[方法]制备脱细胞软骨基质来源的多孔支架,扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察、天狼星红染色、HE染色观察、MTT毒性检测;分离山羊髓核细胞,通过倒置显微镜观察、番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色进行鉴定;将PKH26标记的山羊髓核细胞接种支架上,体外培养3d后进行LIVE/DEAD活性染色,将细胞支架复合物置入裸鼠皮下,培养6周,病理切片,荧光显微镜下观察,进行番红O、Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组化染色.[结果]扫描电镜观察支架孔隙相连通且分布均匀,天狼星红染色支架呈黄绿相间色,HE支架淡染,MTT检测细胞增殖曲线无统计学差异(P＞0.05);P1代髓核细胞呈软骨样细胞形态,番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色均阳性,PKH26标记后的细胞呈红色荧光;体外LIVE/DEAD染色细胞呈绿色荧光,体内培养6周后,带红色荧光的细胞填满支架孔隙,番红O、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,Ⅰ型胶原免疫组化染色弱阳性.[结论]以脱细胞软骨基质多孔支架复合山羊髓核细胞在体内能够形成组织工程髓核样组织.     

离心力下构建组织工程纤维环的实验研究

目的 探讨离心力对体外构建组织工程纤维环的影响. 方法 取兔胸腰段椎间盘纤维环组织,经胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化后细胞原代培养,体外扩增至第3代,5×10<'7>/mL的细胞悬液种植于聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)无纺网支架上.实验组在离心力下培养(相对离心力:85.86×g,每天2次,每次离心15min),对照组静态培养.每组5个标本,培养4周后取出纤维环细胞与支架复合物,行大体标本观察,组织学和免疫组织化学染色,检测Ⅰ型胶原分泌情况. 结果 体外培养4周后,实验组与对照组均为类纤维环样组织,实验组纤维环厚度和组织弹性均优于对照组,Ⅰ型胶原免疫组织化学染色,实验组阳性染色面积为(45.39±6.78)%,对照组为(33.53±4.58)%,两者差异有统计学意义(P<0.01).实验组细胞排列较对照组更具方向性. 结论 离心力刺激纤维环细胞增加Ⅰ型胶原的分泌,有利于在体外构建组织工程纤维环.     

脱矿脱细胞骨基质环细胞支架的物理化学性能研究

目的 探讨脱矿脱细胞骨基质环物理化学性能是否适合用于构建组织工程椎间盘纤维环细胞支架.方法 取兔股骨近端骨制成环状,经脱矿脱细胞处理并对材料的外形、组织结构、孔隙率、吸水力、平均孔径、体外生物降解性能等支架性能指标进行检测.结果 该材料为环状,质地柔韧,多孔结构;HE染色光镜观察显示支架材料为嗜酸性,为不均匀的多孔结构:扫描电镜观察发现支架材料为相互沟通的多孔结构,支架材料的平均孔径为(246±113)μm.平均孔隙率为(77.8±2.8)%.吸水力平均为(72.5±5.9)%.支架材料与松质骨体外生物降解率无明显差异(P>0.05).支架材料最大载荷为(0.61±0.28)N,与正常椎间盘比较P<0.05,有显著差异.可拉伸长度为(17.2±2.3)%,与正常椎间盘纤维环比较P>0.05,差异不显著.结论 脱矿脱细胞骨基质环的物理化学性能适合作为组织工程椎间盘纤维环细胞支架材料.     

兔纤维环细胞复合KLD-12多肽纳米纤维凝胶体外三维培养的实验研究

目的探讨兔纤维环细胞复合KLD-12多肽纳米纤维凝胶体外培养的可能性,寻找修复椎间盘退变的理想种子细胞和支架。方法胰蛋白酶消化法提取6月龄新西兰大白兔纤维环细胞,培养至第3代,复合于KLD-12多肽制备KLD-12多肽/纤维环细胞凝胶。倒置显微镜观察凝胶内细胞形态变化;细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测细胞增殖活性;钙黄绿素(Calcein-AM)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)双荧光染色观察凝胶内活、死细胞,计算活细胞比率;阿尔新蓝法检测培养基中糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)含量;免疫荧光染色观察Ⅱ型胶原分泌情况;实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-q PCR)检测纤维环细胞Ⅱ型胶原及蛋白聚糖(Aggrecan)基因表达情况。结果复合于凝胶中的纤维环细胞呈圆形,少部分在凝胶边缘处贴壁的细胞呈多角形。CCK-8结果显示,细胞增殖活性随培养时间延长呈增加趋势,培养14 d活性显著高于其余各时间点(P0.05),且各时间点活性均显著高于空白凝胶对照组(P0.05)。Calcein-AM/PI双荧光染色观察示,培养5、14 d凝胶内细胞活细胞比率分别89.32%±8.58%和97.81%±1.09%,比较差异无统计学意义(t=—1.962,P=0.097)。GAG检测示,细胞中GAG含量随培养时间延长逐渐增加,8 d达峰值,之后逐渐下降;培养5、8、11 d时GAG含量显著高于2、14 d时(P0.05)。免疫荧光染色示细胞中Ⅱ型胶原正常分泌。RT-q PCR检测示,培养5、14 d凝胶内纤维环细胞均可见Ⅱ型胶原和Aggrecan基因表达,14 d时基因相对表达量均显著高于5 d时(P0.05)。结论纤维环细胞能够在KLD-12多肽纳米纤维凝胶中正常生长增殖,主要细胞外基质成分可正常表达,细胞生物活性良好。     

来源于长管状骨的组织工程纤维环支架的理化特性及细胞生物学相容性研究

[目的]以来源于长管状骨的骨基质明胶(bone matrix gelatin,BMG)为材料制备纤维环支架,并检测其理化特性及细胞生物相容性.[方法]以猪股骨近端松质骨为材料,制备外径为1 cm、内径为0.5 cm的中空环,经脱钙脱细胞处理后制成纤维环支架.支架行Hoechst 33258、HE、Ⅰ型胶原免疫荧光、天狼星红染色,扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察并计算孔径,同时进行生物力学测定.四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazoly tetrazolium,MTT)检测支架不同浓度浸提液的细胞毒性,取P1代山羊纤维环细胞,用注射器将细胞接种至支架上,体外培养48 h,通过活/死细胞染色(LIVE/DEAD cells staining)、扫描电镜(SEM)、HE染色评价支架与细胞的生物相容性.[结果]大体观察支架表面光滑,呈乳白色,扫描电镜支架孔隙分布较均匀且相连通,支架孔径为(401.4±13.1) μm,Hoechst 33258、HE染色均未见细胞残留,Ⅰ型胶原免疫荧光阳性,天狼星红染色支架红染,支架压缩弹性模量为(47.75±6.32) kPa.四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测各组间细胞增殖差异无统计学意义(P＞0.05),活/死细胞染色示细胞在支架上呈绿色荧光,扫描电镜和HE染色示细胞粘附在支架孔隙表面及周围,有基质分泌.[结论]以来源于长管状骨的骨基质明胶为材料制备的中空环形支架脱细胞彻底,具有合适的孔径结构,在机械性能、组成方面与正常纤维环相接近,具有良好的生物相容性,符合组织工程纤维环支架载体的条件.     

椎间盘纤维环细胞的培养

目的　通过对椎间盘纤维环细胞的培养 ,观察细胞的演变 ,为研究椎间盘纤维环细胞的生物学特性、退变机理、组织工程、基因治疗等提供方法和体外模型。方法　采用胰蛋白酶、胶原酶分离大鼠椎间盘纤维环细胞 ,选择DMEM(体积分数 2 0 %的小牛血清 )培养基体外培养 ,行HE染色 ,甲苯胺蓝 ,免疫细胞化学染色分析细胞的生物学特性 ,透射电镜观察细胞的超微结构。结果　采用粗品胶原酶能充分消化纤维环组织 ;在含体积分数为 2 0 %小牛血清的DE TA培养液中细胞生长良好 ;原代纤维环细胞多为梭形 ,有伪足伸出 ,甲苯胺蓝染色 ,胞浆染为深蓝色 ;透射电镜下纤维环细胞内多见长条状粗面内质网 ,部分囊池扩张。线粒体较少 ,可见平行于细胞膜方向的微丝。免疫细胞学方法检测表明纤维环细胞有Ⅰ、Ⅱ型胶原表达。结论　本实验为椎间盘纤维环细胞的培养提供了简单、有效的方法 ,为进一步研究椎间盘纤维环细胞生物学功能和调控研究打下了基础。     

白介素-1受体拮抗剂对椎间盘纤维环胶原纤维代谢的影响

目的 探讨白介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)对双后肢大鼠椎间盘纤维环胶原代谢的影响.方法 建立双后肢大鼠模型36只,随机分为试验组和对照组,每组18只.试验组从造模当天即予腹腔注射IL-1Ra(50ng/kg体重),隔天重复注射至处死;对照组18只不予任何处理.于造模后1、3、6个月每组分别处死6只,完整取出L3～4椎间盘固定、切片,予SABC法进行免疫组化,使用图像分析系统对髓核中Ⅰ、Ⅱ型胶原染色进行面积扫描,并使用扫描电镜观察纤维环胶原纤维超微结构.结果 术后第1个月试验组与对照组椎间盘纤维环中Ⅰ、Ⅱ型胶原面积差异无显著性(P＞0.05),第3个月及第6个月试验组与对照组Ⅰ、Ⅱ型胶原面积相比差异有显著性(P＜0.01).结论 IL-1Ra对双后肢大鼠椎间盘纤维环中Ⅰ、Ⅱ型胶原的代谢有重要的作用.     

椎间盘灌注培养条件下压应力频率对纤维环细胞基质合成的影响

目的:观察压应力频率对椎间盘纤维环(AF)细胞基质合成的影响。方法:获取4~6月龄巴马香猪胸腰段椎间盘72个后,随机分为无应力对照组和应力组(分别为0.1Hz组、0.5Hz组、1Hz组、3Hz组、5Hz组),每组12个样本,将各组椎间盘置于生物反应器中进行灌注培养。无应力对照组不施加应力刺激,各应力组每天施加对应频率的应力刺激2h。灌注培养5d后分离全层纤维环组织行HE染色、阿利新蓝染色、胞外基质基因Aggrecan、CollagenⅠ、CollagenⅡ定量PCR、糖胺多糖(GAG)含量和羟脯氨酸(HYP)含量的检测。结果:培养5d后,各组纤维环组织仍保持天然的层状叠加结构。与对照组比较时,除5Hz组外其他应力组(0.1Hz、0.5Hz、1Hz、3Hz)纤维环组织阿利新蓝染色强度增强、各胞外基质基因的表达得到维持(0.1Hz)或上调(0.5Hz、1Hz、3Hz)、GAG和HYP的含量也维持在同等水平(0.1Hz)或显著升高(0.5Hz、1Hz、3Hz)。然而各应力组组间比较时,5Hz组纤维环组织阿利新蓝染色强度、胞外基质基因的表达水平及GAG和HYP的含量比其他应力组(0.1Hz、0.5Hz、1Hz、3Hz)都下调(P0.05)。结论:椎间盘体外灌注培养条件下,压应力刺激频率影响纤维环细胞的基质合成,低频率(0.1~3Hz)的应力刺激增加基质合成,高频率(5Hz)的应力刺激减少基质合成。     

人肋软骨细胞体外培养中生长代谢及功能的变化

目的　通过检测体外培养的人肋软骨细胞老化过程中Ⅰ、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖(aggrecan)的表达变化 ,为组织工程软骨构建的种子细胞选择适宜的回植时机。方法　取体外培养的P1 ～P5人肋软骨细胞 ,通过观察细胞形态 ,细胞增殖率 ,Alcianblue法定量检测每代Aggrecan中GAG含量 ,免疫组化蛋白水平观察Ⅰ、Ⅱ型胶原表达及RT PCR从mRNA水平分析Ⅰ、Ⅱ型胶原及Aggrecan基因表达量。结果　人肋软骨细胞从第 3代起逐渐向成纤维样细胞形态转换 ;每代软骨细胞Aggrecan中GAG含量随传代次数逐渐降低 ,第 3代后处于较低水平 ;Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达在蛋白水平及mRNA水平基本一致 ,第 2代以前Ⅱ型胶原表达较强 ,Ⅰ型胶原表达较弱 ,之后随传代Ⅱ型胶原表达减弱 ,Ⅰ型胶原表达逐渐增强 ;而Aggrecan在第 3代以前表达较高 ,从第 4代后明显下降。结论　人软骨细胞体外培养老化过程中综合细胞扩增及细胞功能因素 ,第 2代的软骨细胞 (体外扩增约 18 32 6倍 )可作为构建人组织工程软骨的种子细胞。