四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化肝组织中SHP2表达与在体肝星状细胞活化及增殖的关系

目的 探讨四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化肝组织及在体肝星状细胞(HSC)的含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)表达变化与在体HSC活化及增殖的关系。方法 随机将50只健康雄性SD大鼠分为对照组(10只)、模型组(40只),采用腹腔注射四氯化碳法构建大鼠肝纤维化模型，Masson三色及HE染色检测大鼠肝组织的病理组织学变化，免疫组织化学染色检测大鼠肝组织的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及SHP2表达，SHP2与α-SMA免疫荧光双标记检测大鼠肝组织中活化HSC的SHP2表达。结果 与对照组大鼠肝组织的α-SMA阳性表达积分光密度值(IOD)(0.09±0.01)相比，造模不同时间(2周、4周、6周、8周)大鼠纤维化肝组织的α-SMA阳性表达IOD (0.13±0.01、0.18±0.01、0.24±0.02、0.28±0.02)显著增加(P<0.05),并随着造模时间延长逐渐升高(P<0.05),即在体HSC的活化及增殖逐渐加快(α-SMA是HSC的活化标志)。造模不同时间(2周、4周、6周、8周)大鼠纤维化肝组织的SHP2阳性表达IOD (0.23±0.01、0.2...     

姜黄素预防肝纤维化作用与肝星状细胞的关系

目的观察姜黄素预防大鼠肝纤维化作用及活化肝星状细胞(HSC)的数目、分布、凋亡等变化,并探讨两者间的关系。方法以四氯化碳制作大鼠肝纤维化模型,同时按每100 g体重分别给予20、10、5 mg姜黄素灌胃处理,设立正常对照组、肝纤维化组和阳性对照组;8周后处死大鼠,留取肝左叶行HE、Masson染色,参照肝纤维化半定量计分系统进行肝纤维化程度评分,免疫组织化学方法检测α-平滑肌肌动蛋白以了解活化HSC的数量变化, TUNEL与肌源性特异性标志物结合蛋白(Desmin)免疫组织化学双染法检测HSC凋亡。结果姜黄素可明显改善四氯化碳所致大鼠肝纤维化的病理学改变;α-平滑肌肌动蛋白在肝纤维化时表达明显增多,姜黄素使活化HSC数量减少, }[SC凋亡增加,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0．05),且具有量效关系。结论姜黄素可抑制HSC活化、增殖,诱导HSC凋亡,可能为预防肝纤维化的作用机制之一。     

肝星状细胞SSeCKS的表达及其在肝纤维化中的作用

目的 了解src抑制的蛋白激酶C底物(SSeCKS)在肝星状细胞(HSC)活化中的变化和作用.方法 (1)分离正常大鼠的HSC,以实时定量PCR检测其在体外培养过程中SSeCKS mRNA的表达变化,以蛋白质印迹法和细胞免疫荧光法检测HSC中SSeCKS蛋白的表达变化.(2)制作肝纤维化的大鼠模型,以免疫荧光法检测肝组织内SSeCKS和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达变化及定位.结果 初分离的HSC表达低水平的SSeCKS mRNA,经培养活化后SSeCKS的表达增强.在纤维化肝组织中,SSeCKS阳性细胞增多,阳性细胞多分布于肝窦周围,与α-SMA阳性细胞的分布一致.结论 在体外活化过程中HSC中SSeCKS表达增强.SSeCKS可能参与HSC在肝脏炎症和纤维化中的作用.     

沉默结缔组织生长因子对大鼠肝纤维化的影响

目的 研究结缔组织生长因子(CTGF)小干扰RNA(siRNA)在CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型中的抗肝纤维化作用及其对肝星状细胞(HSC)激活的影响.方法 雄性SD大鼠24只,随机分成4组.模型组:皮下注射CCl4及经门静脉注射等渗盐水,每3 d 1次,连续6周(给药频率与时间,下同);CTGF siRNA干预组:皮下注射CCl4及经门静脉注射CTGF siRNA ;对照siRNA干预组:皮下注射CCl4及经门静脉注射对照siRNA;正常对照组:经门静脉注射等渗盐水.用HE染色和Sirius red染色评估大鼠肝组织学变化,Western blot检测肝组织CTGF及α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,免疫组织化学染色评估肝组织α-SMA阳性细胞数量.对实验数据用单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验分析.结果 模型组及对照siRNA组大鼠肝组织CTGF及α-SMA蛋白表达显著上调,α-SMA染色阳性细胞数量明显增加.与模型组相比,CTGF siRNA组CTGF及α-SMA蛋白表达分别下调95%±2%和86%±11%(F值分别为21.234和12.473,P值均＜0.01);肝组织α-SMA染色阳性细胞数减少76%±9%(F=9.179,P＜0.01);组织学检查显示肝纤维化程度明显减轻.结论 siRNA沉默CTGF基因能显著减轻大鼠实验性肝纤维化,减少活化HSC数量可能是其改善肝纤维化的主要机制之一.     

瘦素在肝纤维化组织中的表达及其与肝星状细胞活化的关系

目的:探讨瘦素(leptin)在肝纤维化组织中的表达及其与肝纤维化过程中转化生长因子(TGF-β1)以及α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的相关性,了解leptin与肝星状细胞(HSC)活化的关系.方法:健康 SD大鼠40R,随机分成正常对照组和CCl4诱导的肝纤维化模型组.于造模2、4、6 wk末分批处死动物,分别采用RT-PCR和Western blot、免疫组织化学方法联合检测leptin、TGF-α1及α-SMA在肝纤维化组织中的表达.结果:正常对照组肝脏组织中leptin、TGF-β1、α-SMA均有微量表达;CCl4注射2wk后,leptin、TGF-β1、α-SMA表达开始增强,2、4、6 wk肝组织中的表达强度呈明显递增趋势(P<0.05).leptin与TGF-β1和α-SMA表达均呈显著相关性(r=0.668,0.570,均P<0.05).结论:leptin的阳性表达随着肝纤维化程度的加重而增强.在肝纤维化过程中leptin可能参与了HSC活化、增殖以及ECM的合成.     

细胞间粘附分子-1表达与肝纤维化关系的研究

目的:探讨细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达与肝纤维化的关系。方法:建立四氯化碳大鼠实验性肝纤维化模型。用链酶蛋白和胶原酶原位灌流,Nycodenz密度梯度离心分离正常大鼠HSC,并进行体外培养,应用免疫组织化学方法分别观察静息或活化状态下的HSC及造模肝组织中ICAM-1的表达。结果:肝纤维化模型组织中,ICAM-1表达明显增加,ICAM-1阳性细胞多分布在汇管区周围,肝小叶内炎性细胞浸润区和坏死灶内,其阳性强度及分布与肝脏炎症、肝纤维化程度和分布相一致;静息的HSC不表达ICAM-1,而活化的HSC表达ICAM-I,且随着培养时间的延长ICAM-1表达量逐渐增加。结论:动物体内实验和体外细胞培养表明,ICAM-1表达与HSC活化、肝脏炎性损伤及肝纤维化的发生有关。     

大鼠非酒精性脂肪性肝纤维化形成过程中骨桥蛋白的表达及其意义

目的 通过观察非酒精性脂肪性肝纤维化形成过程中肝组织内骨桥蛋白(OPN)的变化规律,探讨OPN在非酒精性脂肪性肝纤维化形成过程中的作用. 方法选用纯系Wistar雄性大鼠56只,体质量180～200g,随机分为正常对照组和高脂饮食4、8、12,16、20、24周组(其中每组各8只).肝组织常规进行HE及Masson三色胶原染色,免疫组织化学染色检测肝组织α-平滑肌肌动蛋白的表达,RT-PeR、Western blot观察肝组织中OPN动态变化.结果 与正常对照组相比,高脂饲料组大鼠肝脏内OPN含量明显升高,随着脂肪肝程度的加重,OPN表达逐渐增强,mRNA及蛋白质表达比较,F值分别为7.30和7.15,尸值均<0.01;与α-平滑肌肌动蛋白表达及肝组织胶原纤维面积百分比呈显著正相关(r值分别为0.94和0.82,P值均<0.01).结论 在非酒精性脂肪性肝纤维化形成过程中,OPN在肝组织中表达显著上调,可能在非酒精性脂肪性肝纤维化的形成过程中发挥重要作用.     

过氧化物酶体增殖物活化受体γ配体15d-PGJ2对肝星状细胞增殖活化的影响

目的观察过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)的天然配体15d-PGJ2对HSC增殖及活化的影响,以探讨PPARγ在HSC活化过程中的作用。方法采用MTT法和RT-PCR方法观察5μmol/L及10μmol/L 15d-PGJ2对体外培养的HSC自发活化及血小板衍生生长因子(PDGF)引起的HSC增殖及活化的影响。结果以5μmol/L 15d-PGJ2处理原代HSC 3 d后,可明显抑制HSC活化标志物α-平滑肌肌动蛋白的表达,而PPARγ的表达较未处理组明显增高(0.64±0.03对比0.09±0.01,t=36.0517,P<0.01);15d-PGJ2可剂量依赖性地抑制PDGF引起的HSC增殖;经5μmol/L和10μmol/L 15d-PGJ2预处理后再用PDGF干预,则PPARγ的表达较单用PDGF干预组明显增高(分别为0.03±0.02对比0.60±0.03,t=42.6616,P<0.01;以及0.03±0.02对比0.69±0.04,t=33.83,P<0.01),而HSC的活化指标α-平滑肌肌动蛋白、α1(I)型胶原及单核细胞趋化蛋白-1的表达则受抑制。结论激活PPARγ可调控HSC的促纤维化和促炎症作用,促进PPARγ的表达可能成为抗肝纤维化的新手段。     

Hedgehog通路与肝纤维化及肝星状细胞活化的关系研究

目的:探讨Hedgehog通路与肝纤维化及肝星状细胞(HSC)活化的关系.方法:清洁级SD雄性大鼠20只,均分为模型组和对照组.模型组采用腹腔注射四氯化碳(CCl4)和高脂饮食诱导肝纤维化,对照组予以正常饮食.第8周末取模型组存活大鼠与对照组中大鼠各5只处死,取左叶肝脏组织.HE、Masson染色观察两组肝组织病理变化;逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测纤维化大鼠肝脏中表达Hedgehog通路成员超音速Hedgehog信号通路(Shh)、膜受体patched(Ptc)、smoothened(Smo)和核转录因子Gli表达;实时荧光定量PCR法检测Hedgehog通路成员及HSC活化标志基因α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA在两组大鼠肝脏中的表达差异.体外培养HSC-T6细胞,RT-PCR检测HSC-T6细胞株中Hedgehog通路成员的表达;四甲基偶氮唑盐比色分析(MTT)法检测不同浓度环耙明(Cyclopamine,Cyc)对HSC-T6增殖的影响;分别用0、100/μmol/L的Cye干预HSC-T6,实时荧光定量PCR法检测Shh、Smo、Ptc、Gli-1及αSMA mRNA表达差异.结果:模型组大鼠肝脏有大量脂质及胶原沉积,且肝脏组织中均有Shh、Smo、Ptc、Gli-1表达.荧光定量PCR结果示模型组大鼠Shh、Smo、Gli-1及αSMA mRNA表达均较对照大鼠升高(20.45±3.31、12.78±0.53、10.88±2.41、4.91±2.59比1;P值均<0.05).Cyc在体外对HSC-T6有明显的抑制作用,且抑制作用呈剂量依赖性(F=636.81,P<0.01).荧光定量PCR结果示,用Cyc 100 μmol/L干预的HSC-T6中,Ptc、Smo、Gli-1和αSMA表达量分别为0.20±0.11、0.21±0.08、0.28±0.05和0.27±0.10,与Cyc 0μmol/L干预比较差异均有统计学意义(P值均<0.01).结论:肝纤维化过程中Hedgehog通路成员表达增高,抑制Hedgehog通路可抑制HSC活化,推测Hedgehog通路通过活化HSC促进肝纤维化的发生.     

uPA基因转染骨髓源性肝干细胞移植对肝纤维化大鼠HSC活化的影响

目的:探讨尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)基因修饰骨髓源性肝干细胞(BDLSC)移植对CCl4诱导的大鼠肝星状细胞(HSC)激活的影响.方法:大鼠sc 400mL/LCCl4造模.36只大鼠随机分为4组:(1)正常组:sc等量橄榄油;(2)模型组;(3)BDLSC组;(4)BDLSC-uPA组,每组9只.各组大鼠于第8周处死,留取血清及肝组织.观察大鼠肝功能的变化;采用免疫组织化学法和Western blot法检测大鼠肝组织仅α-平滑肌肌动蛋(α-SMA)蛋白表达变化.结果:与模型组和BDLSC组相比.BDLSCuPA组大鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)和总胆红素(TBIL)水平均有不同程度的降低(86.5±9.7 vs 187.1±14.8,113.5±15.7:11.5±2.1 vs 26.3±3.7,17.94±2.8,均P<0.01),血清透明质酸(HA)和Ⅲ型前胶原(PCⅢ)水平明显降低(47.4±10.1vs148.5±22.4,97.6±14.4:18.9±4.4 vs 39.0±6.1,28.2±4.1,均P<0.01); 肝组织α-SMA表达显著下调(0.0174 0.0048 vs 0.3404 0.0662,0.1080 0.0408,均P<0.01).结论:uPA基因修饰BDLSC移植能有效抑制CCl4诱导的大鼠肝纤维化,改善纤维化大鼠的肝功能,且抑制HSC的活化可能是其抑制肝纤维化的主要机制之一.     

Dynamic expression of extracellular signal-regulated kinase in rat liver tissue during hepatic fibrogenesis

INTRODUCTION Mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway is an important intracellular signal transduction system[1], and extracellular signal-regulated kinase 1 (ERK1) is the critical and classical pathway of MAPK and plays an important role in sever…     

内毒素受体在肝星状细胞的表达及其作用

目的了解内毒素受体在肝星状细胞活化中的变化和作用。方法分离正常大鼠的肝星状细胞，以逆转录聚合酶链反应法检测其在体外培养过程中内毒素受体（CD14和TLR4）mRNA的表达变化。以细胞免疫染色法检测肝星状细胞内毒素受体CD14的表达。制作肝纤维化和肝硬化的大鼠模型，免疫组织化学法动态检测肝组织内CD14和α平滑肌肌动蛋白的表达变化和定位。结果初分离的肝星状细胞表达低水平的CD14 mRNA，不表达TLR4 mRNA，培养活化的肝星状细胞内毒素受体的表达增强，内毒素可上调这种表达。体外培养10d的肝星状细胞表达CD14蛋白，内毒素作用后CD14表达更明显。在肝纤维化的发展过程中，肝组织内CD14阳性细胞增多，阳性细胞多分布于肝窦周围，晚期CD14阳性细胞聚集在纤维隔内，与α平滑肌肌动蛋白阳性细胞的分布一致。结论肝星状细胞在体内外的活化过程中内毒素受体的表达增强，因此，内毒素受体可能参与肝星状细胞在肝脏炎症和纤维化中的作用。     

去甲肾上腺素对大鼠肝星状细胞作用的实验研究

目的 探讨交感神经系统在肝纤维化发生和发展中的作用. 方法采用免疫荧光和RT-PCR检测体外培养的肝星状细胞(HSC)中α1、β2-肾上腺素能受体的表达;用四甲基偶氮唑盐法检测不同浓度的去甲肾上腺素(NE)对HSC增殖活性的影响.同时用RT-PCR检测受NE作用后HSC的活化指标胶原蛋白-1、转化生长因子β(TGF β)及α-平滑肌动蛋白(α-SMA)的表达.用高效液相色谱-电化学法测定活化的HSC中交感神经递质NE的水平. 结果α1和β2-肾上腺素能受体表达于HSC的胞膜和胞质内;NE可呈剂量依赖性地促进HSC增殖,在浓度为100μmol/L时达到最大效应,F=140.464,P<0.05,差异有统计学意义.以NE 100 μmol/L作用细胞24h后,可显著促进反应HSC活化的指标上升,胶原蛋白-1表达为0.3022±0.0610,TGF β表达为2.2080±0.2151,α-SMA mRNA表达为0.5469±0.0108,与对照组胶原蛋白-1(0.1040±0.0556)、TGF β(1.1190±0.0070)、α-SMA mRNA表达(0.0759±0.0449)比较,t值分别为-4.160、-8.763和-17.651,P值均<0.05,差异均有统计学意义.HSC可以合成并释放NE,且受血小板衍生生长因子(10ng/ml)刺激后HSC中NE含量为(14.24±0.21)ng/ml,对照组为(11.34±0.15)ng/ml,两组比较,t=-32.907,P<0.05,差异有统计意义.结论 抑制交感神经系统使HSC活性降低对临床上治疗肝纤维化有一定的指导意义.     

整合素αvβ3在肝星状细胞和肝纤维化组织中的表达

目的 研究整合素avβ3在肝星状细胞和纤维化肝组织中的表达,探讨能反映肝星状细胞活化状态的表型受体.方法 分离大鼠肝星状细胞,体外培养激活.硫代乙酰胺175 mg/kg每周2次,连续12周腹腔注射诱导大鼠肝纤维化.免疫染色观察细胞和组织中整合avβ3和a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)的表达.实时PCR和Western印迹法分析avβ3在星状细胞中、正常和肝纤维化组织中的表达.结果 活化星状细胞中avβ3表达明显上调,与第1天相比,第14天的mRNA和蛋白质水平分别增加18倍和5.2倍.免疫染色整合素avβ3成簇极性表达于活化星状细胞的胞膜.肝纤维化模型中avβ3在mRNA和蛋白水平明显高于正常对照(t=2.39,P＜0.05;t=2.74,P＜0.05),正常肝组织中a-SMA和avβ3局限表达于门静脉周围,肝纤维化组织中a-SMA和avβ3表达于扩大的门管区和纤维间隔.结论 体内外活化星状细胞中整合素avβ3表达水平上调,它是星状细胞活化的表型受体,参与肝纤维化的发生.     

Effects of interferon-alpha on expression of hepatic stellate cell and transforming growth factor-β1 and α-smooth muscle actin in rats with hepatic fibrosis

AIM: To investigate the effect of interferon-α(IFN-α) on preventing or reversing hepatic fibrosis in rat experimental model induced by CCl4.METHODS: One hundred and ten Sprague-Dawley rats were divided into five groups: group A (normal controls,n=18), group B (fibrotic model controls, n=22), group C (IFN-α prevention, n=22) initially treated with intra-muscular injection of IFN-α in saline daily at the doses of 1&#215;105U for 6wk, group D (IFN-α treatment, n=24) treated with intra-muscular injection of IFN-α in saline daily at the doses of 1&#215;105U for 6wk after the first 6wk, group E (0.9% sodium chloride treatment control, n=24) treated with intra-muscular injection of 0.01mL/kg daily for 6wk after the first 6wk. At the end of the experiment, all rats of each group were killed. Samples of the liver obtained by biopsy were subjected to histological, immunohistochemical and electron microscopic studies for the expressions of transforming growth factor-β1(TGF-β1) and α-smooth muscle actin (α-SMA).RESULTS: The expressions of TGF-β1, the number of activated hepatic stellate cells and α-SMA in hepatic tissue of group C were significantly less than those of group B(P&lt;0.01). The degree of fibrosis score in group B was also significantly less than that of group C under light microscope (P&lt;0.01).CONCLUSION: IFN-α can inhibit the production of TGF-β1, decrease HSC activation and stimulate its apoptosis.     

Smad7 prevents activation of hepatic stellate cells and liver fibrosis in rats

BACKGROUND & AIMS: Numerous studies implicate transforming growth factor (TGF)-beta signaling in liver fibrogenesis. To perturb the TGF-beta pathway during this process, we overexpressed Smad7, an intracellular antagonist of TGF-beta signaling, in vivo and in primary-cultured hepatic stellate cells (HSCs). METHODS: Ligation of the common bile duct (BDL) was used to induce liver fibrosis in rats. Animals received injections of an adenovirus carrying Smad7 cDNA into the portal vein during surgery and via the tail vein at later stages. The effect of Smad7 on TGF-beta signaling and activation of HSC was further analyzed in primary-cultured cells. RESULTS: Smad7-overexpressing BDL rats displayed reduced collagen and alpha-SMA expression and reduced hydroxyproline content in the liver, when compared with animals administered AdLacZ. Such a beneficial effect was also observed when Smad7 was expressed in animals with established fibrosis. Accordingly, Smad7 arrested transdifferentiation of primary-cultured HSCs. AdSmad7 infected cells remained in a quiescent stage and retained storage of vitamin A droplets. Smad7 expression totally blocked TGF-beta signal transduction, shown by inhibiting Smad2/3 phosphorylation, nuclear translocation of activated Smad complexes, and activation of (CAGA)(9)-MLP-Luc, resulting in decreased collagen I expression. Smad7 also abrogated TGF-beta-dependent proliferation inhibition of HSC. Smad7 did not decrease expression of alpha-SMA, but immunofluorescent staining with anti alpha-SMA antibodies displayed destruction of the fibrillar organization of the actin cytoskeleton. CONCLUSIONS: In summary, gene transfer of Smad7 inhibits experimental fibrogenesis in vivo. Studies with isolated HSC suggest that the underlying mechanisms involve inhibition of TGF-beta signaling and HSC transdifferentiation.     

甘草次酸靶向肝星状细胞治疗肝纤维化的体内研究

目的观察以6-磷酸甘露糖修饰的白蛋白(M6P26-HSA)作为特异性载体,将甘草次酸(GA) 靶向释放到肝星状细胞治疗肝纤维化的效果。方法用125I记由M6P26-HSA和GA在体外合成新的偶合物GA-HSA-M6P26,观察其在体内的器官分布情况,用双重免疫组织化学的方法观察星状细胞对GA- HSA-M6P26的选择性摄取;选用Sirius红染色观察GA-HSA-M6P26对肝纤维化时胶原沉积的影响,用定量聚合酶链反应检测GA-HSA-M6P26对Ⅰ型前胶原mRNA表达的影响。结果静脉注射后10min,GA-HSA- M6P26选择性地分布于肝脏,摄取高峰可达(5 5.093±5.404)%。双重免疫组织化学染色证实GA-HSA- M6P26主要被星状细胞选择性摄取,GA-HSA-M6P26治疗后肝脏胶原沉积明显减少,Ⅰ型前胶原和α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达明显降低。结论GA-HSA-M6P26可以选择性地分布于肝脏星状细胞,有显著的抗肝纤维化作用。