异体异位发育睾丸组织的蛋白质组图谱构建及差异蛋白分析*

[摘要] 目的 应用蛋白质组学实验方法对在异体异位生长发育的新生小鼠睾丸组织进行差异蛋白分析,从而对睾丸组织体外移植模型用于生精细胞发育研究的可行性提供进一步的理论依据。方法 以新生小鼠睾丸组织为供体,免疫缺陷小鼠为受体进行组织移植,移植8周后收集移植物组织,采用双向凝胶电泳（2-DE）分离移植物组织总蛋白,同时分离8周正常小鼠睾丸组织总蛋白作对比分析,运用ImageMaster 2D Elite 5.0图象分析软件识别移植物组织与正常组织差异表达的蛋白质点,应用基质辅助电离解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）获取肽质量指纹图谱（PMF）,检索数据库鉴定差异表达的蛋白质点。结果 正常睾丸组织和移植物组织双向电泳图谱的平均蛋白质点数分别为(1 326±15)个和(1 561±20)个,3次重复实验的蛋白质点位置重复性较好。通过比较两者的双向凝胶电泳图谱,得到表达差异量较大的蛋白质点21个。选取6个仅在正常睾丸组织中有表达的蛋白质点进行质谱和生物信息学分析,鉴定出的6种蛋白质,除血红蛋白α1链（Hba-a1）外,其他5种蛋白均为在小鼠睾丸中有较高表达的蛋白质,包括A激酶锚定蛋白结合的精子蛋白(ASP)、磷脂过氧化氢物谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)、精子蛋白(Sp17)、天门冬酰胺酶样蛋白(ASRGL1)和过氧化物氧化还原因子4(Prdx4)。结论 在本实验中,从异体异位生长发育成熟的新生小鼠睾丸组织中检测到5种在睾丸中特异性高表达蛋白质的缺失,这些蛋白质主要在精子运动、精子顶体形成以及精子的受精等功能中发挥作用。     

Plac8l1在小鼠精子发生过程中的表达特征研究

目的：探讨Plac8l1（placenta-specific 8 like 1）基因在小鼠睾丸组织的表达特征,及其与精子发生的相关性。方法：经生物信息学方法初步筛选到一个睾丸特异性表达候选基因Plac8l1,并推测其可能与小鼠精子发生相关;采用半定量RT-PCR和实时定量RT-PCR对Plac8l1表达的时空特异进行了研究;应用原位杂交技术对Plac8l1 mRNA在成年小鼠睾丸中的细胞类群表达特征进行初步研究;通过构建过表达PLAC8L1-EGFP重组蛋白质粒及生物信息学分析进行亚细胞定位研究与功能预测。结果：①Plac8l1是1个睾丸特异性转录基因。②在成年小鼠,Plac8l1只在睾丸和附睾组织发生特异性转录,而且睾丸中的表达水平明显高于附睾[睾丸vs. 附睾=[（1.000±0.000） vs. （0.036±0.018）,P=0.000]。③随着小鼠精子发生的起始,睾丸中Plac8l1转录水平逐渐升高（P=0.000）。④mRNA原位杂交结果显示Plac8l1 mRNA主要定位在成年小鼠睾丸中的间质细胞和精母细胞。⑤经生物信息学分析,PLAC8L1也有着一个类似于PLAC8的功能域,过表达重组蛋白显示PLAC8L1在细胞膜上聚集。结论：Plac8l1是1个睾丸特异性基因,可能与精子发生过程中的精母细胞分化相关;PLAC8L1具有1个富含半胱氨酸的PLAC8结构域,这一结构域可能介导了PLAC8L1在细胞膜上聚集并与其他蛋白相互作用,并可能在精母细胞分化中发挥重要作用。     

醛糖还原酶的分离纯化和性质分析

利用离心，盐析及ＤＥＡＥ－纤维素，羟基磷灰石，葡聚糖－Ｇ１００多步层析法将牛睾丸ＡＲ分离纯化，醛糖还原酶（ａｌｄｏｓｅｒｅｄｕｃａｓｅ，ＡＲ），并利用体外酶动力学方法测定其底物特异性，为寻长有效的醛糖还原酶抑制剂提供线索，结果；纯化的酶经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴定示一单一蛋白条带，牛睾丸ＡＲ，Ｍｒ约为（４００００±１０００）ｕ，ＡＲ底物特异性，按１／Ｋｍ大小依次排列为：Ｐ－硝基苯醛；ＤＬ－甘油醛，Ｄ     

腺嘌呤致大鼠雄性不育的实验研究

目的：探讨腺嘌呤致大鼠雄性不育的可能机制。方法：用含0．5％的腺嘌呤饲料饲喂大鼠30d，在实验第30天活杀取睾丸组织，常规连续病理切片。观察睾丸组织的病理改变情况；免疫组化检测睾丸曲细精管TGF－β1蛋白表达水平，脱氧核苷酸末端转移酶缺口末端标记法（TUNEL）检测生精细胞凋亡。结果：实验组大部分曲细精管退行性变性，各级精细胞变性，数量减少；睾丸间质细胞和Sertoli细胞均可见TGF－β1蛋白表达，而对照组只有睾丸间质细胞可见TGF－β1蛋白表达，且实验组TGF－β1蛋白表达强度较对照组为高（P＜0．01）；睾丸生精细胞凋亡细胞百分率较对照组明显增多（P＜0．01）。结论：腺嘌呤诱导的大鼠雄性不育可能与TGF－β1的抑制生精作用及促进生精细胞凋亡有关。     

醛糖还原酶的分离纯化和性质分析

利用离心、盐析及ＤＥＡＥ－纤维素、羟基磷灰石、葡聚糖－Ｇ１００多步层析法将牛睾丸ＡＲ分离纯化，醛糖还原酶（ａｌｄｏｓｅｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＡＲ），并利用体外酶动力学方法测定其底物特异性，为寻找有效的醛糖还原酶抑制剂提供线索。结果：纯化的酶经ＳＤＳ－ｐＡＧＥ电泳鉴定示一单一蛋白条带，牛睾丸ＡＲＭｒ约为（４００００±１０００）ｕ，ＡＲ底物特异性，按１／ｋｍ大小依次排列为：Ｐ－硝基苯醛，ＤＬ－甘油醛，Ｄ－葡萄糖醛酸，Ｄ－木糖，Ｄ－半乳糖，Ｄ－葡萄糖。     

DNAJB8在小鼠睾丸生殖细胞中的表达定位

目的：探究DNAJB8［DnaJ heat shock protein family（HSP40） member B8］在小鼠精子发生过程中的表达模式。方法：分别采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测小鼠各脏器、不同发育时期睾丸组织以及不同生精细胞DNAJB8的mRNA转录和蛋白表达量;免疫荧光检测DNAJB8在生精细胞中的表达定位。结果：DNAJB8基因在睾丸组织中特异表达,从小鼠出生后21 d（P21）即圆形精子阶段开始DNAJB8 mRNA保持较高的表达,而DNAJB8蛋白在精子变形晚期出生后35 d（P35）才开始表达。DNAJB8蛋白主要定位在晚期精子细胞及精子鞭毛中段。结论：DNAJB8可能参与小鼠精子变形晚期的发育过程。     

重症急性胰腺炎患者血清差异蛋白质的表达

目的：用蛋白质组学技术比较重症急性胰腺炎（SAP）与轻症急性胰腺炎（MAP）患者血清的差异蛋白,探讨SAP特异蛋白的表达。方法：血清标本取自10例急性胰腺炎（AP）患者,其中5例SAP,5例MAP,用双向凝胶电泳检测两类患者的蛋白表达,并将这些差异表达蛋白点进行质谱鉴定,Mascot数据库检索。结果：比较双向电泳图谱发现15个差异表达蛋白点,经质谱分析,成功鉴定出10种蛋白质,在SAP患者其中4种表达上调,6种表达下调。数据库查询结果,4个表达上调蛋白分别为补体4A、结合珠蛋白亚型2、结合珠蛋白和载脂蛋白L1;6个表达下调蛋白分别为四连接素、谷胱甘肽过氧化物酶3、丝氨酸蛋白酶抑制剂亚型F1、丛生蛋白亚型-1、转甲状腺素蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A1亚型2。结论：SAP患者血清有差异蛋白质表达,这可能和SAP发病机制相关。     

人绒毛膜促性腺激素对K9小鼠睾丸间质细胞转醛醇酶活性的影响

目的：观察人绒毛膜促性腺激素（hCG)对K9小鼠睾丸间质细胞（K9细胞）转醛醇酶（transaldolase,TAL)活性的影响。探索哺乳动物中TAL活性与睾酮合成之间的关系。方法：酶联免疫法测定细胞培养液中睾酮分泌量，TAL活性测定，蛋白免疫印迹（Western blotting)分析TAL蛋白变化及RNA印迹法（Northen blotting)分析TALmRNA表达情况。结果：hCG实验组睾酮分泌量及TAL活性比对照组均提高2倍，Western blotting分析TAL蛋白量无明显变化，而Norhen blotting分析TALmRNA表达明显增加。结论：hCG促进K9细胞中睾酮合成的同时TAL活性显著增加，TAL可能与哺乳类K9细胞类固醇激素的合成有关。     

ER81在白消安模型小鼠睾丸和附睾中的表达及其意义

目的：检测Ets家族转录因子ER81在白消安模型小鼠睾丸及附睾中的表达水平,探讨其对精原细胞增殖和分化的影响。方法：成年小鼠腹腔注射白消安10 mg•kg-1,分别在注射后第0、3、5、8、10和18 天取睾丸和附睾,半定量RT-PCR分析ER81 mRNA的相对表达量。结果：在睾丸组织内,与第0天比较,ER81的表达量在第5 天显著降低（P<0.01）,随后基本恢复;在附睾组织内,与第0天比较,ER81表达量于第8 天显著降低（P<0.05）,并随后恢复。结论：转录因子ER81可能对精原细胞的分化有调节作用。     

母鼠长期低剂量锰染毒对子代大鼠睾丸氧化应激状态及生精细胞凋亡的影响

目的 探讨氯化锰长期低剂量染毒对子代大鼠睾丸中氧化应激状态及生精细胞凋亡的影响。方法 健康雌性SD 大鼠32 只随机分为对照组,低、中、高剂量组,每组8 只。锰染毒组分别腹腔注射2、4 和8 mg/kg MnCl2·4H2O,对照组腹腔注射等容生理盐水,1 次/d,5 d/ 周,共8 周。与正常雄性SD 大鼠交配受孕后,雌 鼠在妊娠期和哺乳期继续染毒。每组随机取8 只12 周龄子代雄性大鼠断头处死后取材,HE 染色观察睾丸生精小 管结构;qRT-PCR、免疫组织化学、Western blot 分别检测叉头蛋白转录因子O 3a（FoxO3a）、与Bcl-2 相互作 用的细胞死亡调节子（Bim）、半胱天冬酶9（Caspase-9）mRNA 和蛋白的表达;TUNEL 技术检测生精细胞凋 亡。结果 ① HE 染色可见各锰染毒组睾丸生精小管呈现不同程度的形态学改变。随着锰染毒剂量的增加,生精 细胞层数逐渐减少,各级生精细胞排列紊乱、数量减少或缺如,管腔内成熟的精子数目减少;②中、高剂量组 精子密度、精子活动率降低,而精子畸形率上升（P <0.05）;③各锰染毒组大鼠睾丸组织内超氧化物歧化酶 （SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）活性随锰染毒剂量的增加而降低（P <0.05）; 而睾丸组织内丙二醛（MDA）含量和活性氧（ROS）水平随锰染毒剂量的增加逐渐升高（P <0.05）;④在 mRNA 和蛋白水平,FoxO3a 的表达随锰染毒剂量的增加逐渐上升（P <0.05）;低剂量组Bim mRNA 表达量 未见变化,但在中、高剂量组则降低,而细胞死亡调节因子表达量则随锰染毒剂量的增加逐渐增加（P <0.05）; ⑤ Caspase-9 mRNA 和蛋白表达量在各锰染毒组均升高,且随锰染毒剂量的增加逐渐增加（P <0.05）;⑥各 锰染毒组大鼠均可见生精细胞凋亡,其凋亡指数高于对照组,且随锰染毒剂量的增加而上升（P <0.05）。结论 长期低剂量锰染毒可抑制子代大鼠睾丸内抗氧化酶活性或（和）增加MDA 含量,提高睾丸组织ROS 水平,促 进FoxO3a 和Bim 表达,启动Caspase-9 信号通路,最终导致子代大鼠生精细胞的凋亡。     

2007～2009年铜陵市人民医院产科抗生素应用分析

目的了解产科抗生素的应用情况并评价其合理性以加强临床使用的管理。方法随机抽查铜陵市人民医院2007～2009年产科出院患者病历中的抗生素使用情况,进行回顾性的调查统计分析。结果抗生素使用率达67%,头孢类药物是主要种类,以单独用药情况最多;多数品种DUI接近1。结论该院产科抗生素使用基本合理,但尚须建立有效的监管制度,控制过度使用。     

2005年汕头市登革热定点监测结果分析

目的 通过定点监测为汕头市登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。方法收集监测点的登革热疫情、人群抗体水平和媒介伊蚊等监测资料，用EPI2002软件统计分析。结果2005年汕头市无登革热疫情，抗登革热病毒IgG、IgM阳性率低，伊蚊幼虫孳生密度高峰在6、8、9、10月份，低谷在4、7、11月份，孳生情况随着月平均降水量、平均气温变化而变化；孳生场所以农村、暂时性容器为主。结论汕头市有登革热流行的自然、社会环境条件，人群普遍对登革热易感，8～10月是发动爱国卫生运动，清除伊蚊孳生地，预防、控制登革热流行的适当时机。     

广东高州市2005年医疗机构消毒质量监测分析

目的评价辖区内医疗机构消毒灭菌质量，督促各医疗单位提高消毒灭菌效果，防止医源性感染的发生。方法对辖区内的医疗单位已消毒或灭菌的用品进行抽样检测，将检测结果进行统计学分析。结果这次采集使用中消毒液、无菌器械、物体表面、手术室空气和医务人员手共3556份，检测达卫生标准2955份，符合率为83、10％，不同样品检测达卫生标准百分率依次为97．37％、95．56％、86．25％、75．41％和62、49％。结论高州市医疗机构消毒灭菌质量用卫生指标评价，卫生站的符合卫生标准率低于医院，手术室空气和医务人员手的监测合格率低于使用中消毒液和无菌器械。     

2005年广西流动人口疟疾监测结果分析

目的了解广西流动人员疟疾流行现状,进而提出针对性防治措施。方法收集全区网络直报疫情资料和各级疾病预防控制机构疟疾监测数据进行分析。结果2005年广西流动人口发热病人平均疟原虫阳性率为0·33%。80·62%的病人为本地居民外出到疟疾流行区务工感染所致。以从事护林/砍伐比例最高,占44·19%。结论加强返乡流动人口疟疾监测是巩固广西疟疾防治的关键所在。     

湛江市2007年登革热监测结果

目的分析湛江市2007年登革热监测结果,为登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策提供科学依据。方法收集监测点的登革热疫情、布雷图指数、人群抗体水平和媒介伊蚊等监测资料,用EPI2002软件统计分析。结果2007年湛江市暴发2起登革热疫情,发病205例,男97例,女108例;抗登革热病毒IgG阳性率低,伊蚊幼虫孳生密度高峰在9月份,低谷在6-8月份,阳性容器以永久性容器为主。结论湛江市有登革热流行的自然、社会环境条件,人群普遍对登革热易感,8-9月是发动爱国卫生运动,清除伊蚊孳生地,预防、控制登革热流行的适当时机。     

惠州市车间空气中有毒物检测结果分析

目的 了解惠州市电子、五金、电镀等企业生产车间中有毒物污染情况，以便提出有效的预防措施。方法根据中华人民共和国国家标准中气相色谱法、原子吸收分光光度法、分光光度法对车间空气中有毒物质进行检测。结果2003～2004年共检测车间空气样品3625份，舍格3511份，总合格率为96．8％。其中锰尘舍格率最低，为82．2％；其次是三氯乙烯91．0％，氰化氢93．4％，甲苯97．1％，硫酸97．2％，铅烟98．2％，正己烷99．2％。苯99．3％，二甲苯99．6％，其他合格率为100％。结论惠州市部分电子、五金、电镀企业车间空气中有毒物的浓度较高，应改善生产车间的通风设施，做好工人的个人防护。     

湖南侗族嘴部活体观测

目的　探讨湖南侗族成年人嘴部的形态特征 ,为体质人类学研究积累资料。方法　用活体观测方法对 2 64例成年侗族人嘴部进行活体研究。结果　得出了湖南侗族嘴部 3项观察值和 6项测量值 ,以及口裂高、宽指数及其分型。结论　湖南侗族嘴部有其独特的特征。     

食品中氯霉素测定方法的应用研究

目的探讨ELISA检测法检测食品中氯霉素的可行性。方法采用国际上先进的ELISA检测法和酶标读数仪定量检测，并与高效液相色谱-电喷雾串联质谱法（HPLC—MS／MS）比较。结果氯霉素含量为0．05～0．20ug／kg之间，CV％为2．5％～5％，回收率为85．0％～110．0％，标准曲线r=-0．992～-0．999。结论ELISA法具有灵敏度高，干扰少，测定步骤简便、快速。操作安全，设备投资少，测定结果准确可靠。     

广东省2007年部分地区儿童麻疹免疫水平监测结果分析

目的了解广东地区儿童麻疹免疫水平,客观评价人群麻疹免疫状况,为调整策略并改进工作提供依据。方法采取分层整群抽样法抽取南海、盐田、饶平、乳源、德庆、遂溪6个县4个年龄组1376名儿童,对其麻疹抗体水平进行检测。结果6个地区麻疹IgG抗体总阳性率为96．9％,麻疹IgG抗体总保护率为80．2％,总抗体几何平均浓度（GMC）为1515mIU／ml;不同地区儿童麻疹抗体阳性率、保护率和抗体几何平均浓度（GMC）均有显著性差异;年龄别儿童麻疹抗体阳性率差异无显著性,但麻疹保护率和抗体几何平均浓度（GMC）存在显著性差异;外地与本地儿童麻疹抗体阳性率、保护率和抗体几何平均浓度（GMC）均显示无显著性差异。结论结果显示调查地区抗体总阳性率维持高水平,但珠江三角洲经济发达地区常规免疫工作质量要好于非珠江三角洲经济欠发达地区;麻疹复种工作可有效减少免疫空白儿童,维持人群麻疹高免疫水平;居住时间较长的流动儿童可以获得高的麻疹免疫水平,结合麻疹发病情况,需重点关注居住时间较短的流动儿童免疫状况。     

显色培养基在检测食品中沙门菌的应用研究

目的考核显色培养基对沙门菌的检测效果，以新型快速检测方法。方法按国标（GB4789．4—2003）程序比较几种培养基检测食品中沙门菌的效果。结果以CHROMagar沙门菌显色培养基、HKM沙门菌显色培养基与传统平板DHL对测试菌株和实际样品检测可以达到相近的检测限和灵敏度。HKM沙门菌显色培养基对某些沙门菌的检出灵敏度比CHROMagar沙门菌显色培养基更高。结论用显色培养基检测沙门菌是一种新快速途径，可大大提高检测效率。