一项深化和优化实验医学内涵的先进技术——流式细胞术

上世纪70年代,得益于自然科学各分支学科技术的飞速发展,一种集流体喷射技术、激光技术、空气计数、γ射线能谱技术、电子计算机技术和显微荧光光度计于一体的流式细胞术(flow cy-tometry,FCM)问世了,其是一种对液流中的细胞、其他生物微粒(微生物、染色体等)或人工合成的微粒进行多参数定量分析和分选的技术。上世纪80年代初,根据FCM原理设计的荧光激活细胞分检仪(fluorescence activited cell sorting,FACS)即流式细胞仪开始引入我国。早期FACS仅在研究院所和高等院校应用,近年来已进入临床实验部门,上海地区不少二级以上综合性医院…     

荧光激活细胞分离技术在造血干、祖细胞分离纯化中的应用

造血干细胞和造血祖细胞是造血细胞生成及调控的重要阶段.由于造血干、祖细胞的数量极少,且不能在形态上辩认.妨碍了对其生物学特征及调控机制的深入研究.因此.对造血干、祖细胞的分离和纯化具有重要意义.荧光激活细胞分离(FACS)技术是一项重要的细胞分离手段.近年来,FACS的应用愈来愈广泛,有关研究已取得一定进展.     

淋巴细胞的种类

“淋巴细胞的种类”和“淋巴细胞的分类”两文介绍了淋巴细胞亚群的最近研究进展。前一篇着重于概念性知识的介绍,后一篇介绍用一种新的仪器——荧光激活细胞分离器进行淋巴细胞分类的新进展。读者依次进行阅读,可深入了解其全貌。由于本刊篇幅所限,“淋巴细胞的分类”一文将在下一期刊登.     

Hσ与Rh-123流式细胞仪选择分离的长期再生原始造血细胞体内外定性

早期未分化造血干细胞是由不均一的、有不同程度再生能力、系列定向和分化状态的细胞组成。本文应用选择性的密度梯度荧光激活细胞分离仪(FACS)分离极早期造血细胞亚群,可获得浓集的、已清除掉定向干细胞的骨髓原始细胞。这些细胞有母细胞光散射特征,与DNA结合染料H(?)eshst33342(H(?))有低水平结合,与线粒体染料罗丹明(Rh-123)有不同量的结合。这些染料用于顺序单一     

肿瘤浸润淋巴细胞研究进展

肿瘤浸润淋巴细胞(TIL，tumorinfiltraling lymphocyte)是八十年代早期由美国国立癌症研究院(NCI，National CancerInstitute)的Rosonberg等首先分离出的一种特殊类型的淋巴细胞。因为发现TIL抗肿瘤的活性是外周血淋巴细胞(PBL，Peripharal bloodlymphocyte)的50—100倍．被誉为继PBL来源的淋巴因子激活的杀伤(1ymphokine activatedkiller)细胞，即LAK细胞之后的第二代抗肿瘤效应细胞，因而更为人们所重视。     

一项深化和优化实验医学内涵的先进技术——流式细胞术

上世纪70年代,得益于自然科学各分支学科技术的飞速发展,一种集流体喷射技术、激光技术、空气计数、γ射线能谱技术、电子计算机技术和显微荧光光度计于一体的流式细胞术（flow cytometry,FCM）问世了,其是一种对液流中的细胞、其他生物微粒（微生物、染色体等）或人工合成的微粒进行多参数定量分析和分选的技术。上世纪80年代初,根据FCM原理设计的荧光激活细胞分检仪（fluorescence activited cell sorting,FACS）即流式细胞仪开始引入我国。早期FACS仅在研究院所和高等院校应用,近年来已进入临床实验部门,上海地区不少二级以上综合性医院都配有FACS,国内部分城市的仪器拥有量甚至大大高于西方发达国家。     

T淋巴细胞亚群分类及其临床意义

人体免疫活性细胞可分为T淋巴细胞和B淋巴细胞二大系统。B淋巴细胞承担体液免疫,即在抗体刺激下分化成为产生抗体的浆细胞。T细胞又可分为三个亚群,即杀伤性T细胞(T_C细胞),辅助或诱导性细胞(T_H细胞)和抑制性T细胞(T_S细胞)。T_C细胞专司细胞免疫,能杀伤含微生物的细胞、移植细胞、肿瘤细胞等。T_H细胞能辅助T     

大颗粒淋巴细胞克隆性疾病

大颗粒淋巴细胞(LGL)是一种形态上可辨认的淋巴细胞亚群,其形态特点为:胞体较正常淋巴细胞大,胞浆丰富,有明显嗜天青颗粒,颗粒可粗可细,部分细胞无颗粒。这类细胞占外周血单个核细胞的10％～15％,由CD~(3+)和CD~(3-)的两个细胞群体组成:CD~(3+)LGL为激活的细胞毒T淋巴细胞,它介导非主要组织相容性复合物(MHC)限制     

慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在小鼠T淋巴细胞中的表达

本研究构建含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体三质粒系统,并观察其在小鼠T淋巴细胞中的表达情况。应用亚克隆技术将多聚嘌呤通道(PPT)元件、泛醌启动子(PUB)和绿色荧光蛋白基因(GFP)连接至pLO134载体,构建成pTK153载体。之后应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统(包括包装质粒△NRF、转移质粒pTK153和包膜蛋白质粒VSV-G)共转染293T细胞,12小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,72小时收集病毒上清并感染小鼠T淋巴细胞,在荧光显微镜下和应用流式细胞仪(FACS)观察感染情况。结果表明:慢病毒载体的三质粒系统转染293T细胞12小时后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,FACS分析转染效率为(63.04±7.24)%,病毒滴度测定为(3.09±0.61)×106U/ml。感染小鼠T淋巴细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达,FACS分析转导效率为(37.98±6.26)%。结论:成功构建了含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体,对小鼠T淋巴细胞有较高的感染效率。     

冷冻保存对LAK细胞的活性和表面标志的影响

LAK 细胞是免疫治疗中的一种效应细胞,已用于肿瘤治疗。了解冷冻保存对LAK 细胞活性的影响,在免疫治疗、诊断和疗效评价也很重要。但已往实验对冷冻后NK、K 和T 细胞保持细胞毒活性的能力仍有争议。本研究的目的是进一步实验比较冷冻前后经rIL-2激活外周单个核细胞(PBMC)形成的LAK 细胞和不经rIL-2激活的NK 细胞的活性,同时观察在实验过程中细胞表面标记表达的变化。实验方法:利用Cs3000型细胞分离器和Ficoll     

信号转导淋巴细胞激活分子家族的研究进展

人造血干细胞(HSC)和肿瘤干细胞标志物的探寻一直是造血干细胞移植监测、治疗及临床研究关注的焦点,而最近报道的新标志物--信号转导淋巴细胞激活分子(SLAM)家族和侧群(side population,SP)细胞极大地推进了干细胞临床和基础研究.     

信号转导淋巴细胞激活分子家族的研究进展

人造血干细胞(HSC)和肿瘤干细胞标志物的探寻一直是造血干细胞移植监测、治疗及临床研究关注的焦点,而最近报道的新标志物--信号转导淋巴细胞激活分子(SLAM)家族和侧群(side population,SP)细胞极大地推进了干细胞临床和基础研究.     

激活T淋巴细胞对体外造血的抑制

近年来,T细胞在造血调控中的重要性愈来愈引起重视。T细胞不仅是多种造血刺激因子的来源,在造血负调控中也发挥着重要的作用。业已证实,T细胞在一定条件下激活后,可以显著地抑制多种造血祖细胞的生长,而且这种抑制是通过某种不同于γ干扰素的调控因子所介导的。本文旨在对这一现象做一概述一.激活T细胞对体外造血的抑制是通过某种造血抑制因子介导的随着对再生障碍性贫血(再障)发病机制研究的深入,人们发现T细胞介导的免疫抑制可能参与导致了某些再障的发生,提示此种再障患者体内存在某种抑制性T细胞,这种T细胞能够抑制造血细     

肿瘤浸润淋巴细胞过继免疫治疗肺癌

近年来,恶性肿瘤的过继免疫治疗有飞跃的发展,其中肿瘤浸润的淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocytes,TIL)作为一种新的抗肿瘤效应细胞,由于其抗肿瘤特异性强,被认为代表了机体对肿瘤的特异性免疫,研究表明:TIL是继淋巴因子激活的杀伤细胞(Lymphokine activedkiller cell,LAK)之后发现的又一重要免疫活性细胞,较LAK细胞作用强50～100倍,因而TIL在肿瘤的过继免疫治疗中的作用日益受到重视,在肺癌治疗方面有成功报道,本文对此作一简述。     

淋巴细胞功能亢进与造血组织损伤

越来越多的证据表明,淋巴细胞功能亢进与造血组织损伤的关系非常密切。现就该方面研究作一综述。1　淋巴细胞及其功能亢进所致血液系统疾病　1990年Ro magnami等[1 ] 研究证实人类辅助性T细胞(Th)存在辅助性T细胞1(Th1细胞)、辅助性T细胞2 (Th2细胞)两种亚型,分别分泌Ⅰ类细胞因子和Ⅱ类细胞因子。Th1细胞优势分泌γ干扰素(IFN γ)及IL 2 ,以分泌IFN γ为主要特征,主要介导细胞免疫,活化细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或激活CD8 T细胞,进而产生大量凋亡配体[如肿瘤坏死因子(TNF)等];Th2细胞主要产生IL 4、IL 6、IL 10 ,以IL 4的分泌…     

双表达外源性4-1BBL/RANTES的K562细胞活化外周血淋巴细胞的研究

目的探讨K562细胞表达外源性蛋白4-1BBL/RANTES后,对T细胞、NK细胞有无活化作用,为进一步构建人工抗原提呈细胞提供前提。方法采用分子克隆技术,分别将4-1BBL和RANTES基因插入双表达载体pVITRO-2,命名为pV4-1BBL-RANTES。经测序鉴定后,利用脂质体介导的转染及潮霉素筛选,获得稳定双表达4-1BBL、RANTES分子的K562细胞(K562/4-1BBL/RANTES)。经流式细胞仪(FACS)分选后,K562/4-1BBL/RANTES细胞用丝裂霉素C处理,与外周血淋巴细胞孵育24,FACS检测淋巴细胞表面活化性受体CD69的表达;对NK细胞同时检测了活化性受体NKG2D的表达情况。结果受K562/4-1BBL/RANTES细胞刺激后,CD3+T细胞、CD4+T细胞、γδT细胞和NK细胞的活化性受体CD69的表达与未受刺激前相比,均有明显上调;但与单纯K562细胞刺激组相比,无显著差异。另外,CD8+T细胞CD69的表达及NK细胞NKG2D的表达无明显变化。结论将4-1BBL和RANTES共表达于K562细胞,不具备活化淋巴细胞的效应。     

关于年青红细胞收集物中粒细胞/单核细胞集落形成单位数和T淋巴细胞亚群百分比的研究

用于治疗新生儿溶血时换血的红细胞,应尽可能除去里面的白细胞,以防产生移植物抗宿主病(GV-HD)。采用细胞分离器制取的年青红细胞(YRBC)收集物都含有大量的白细胞和血小板,对病人有副作用。鉴于制取YRBC与从外周血获取循环祖细胞的方法相类似,为此作者检查了YRBC中白细胞的性质,以确定现有的二种滤器对祖细胞和某些淋巴细胞亚群是否具有选择性通透和吸附作用,并了解过滤后的YRBC中剩余细胞的数量及其性质。作者采用的细胞分离器为IBM-2997,ACD抗凝,从每个供血者收集600ml富含YRBC血浆(相当于100-150ml全血)。对10名供血者进行采血,有6名成功,故本文研究的血样为6份。     

成人而不是儿童急性淋巴细胞白血病细胞产生T细胞生长因子

对白血病细胞的广泛研究表明,不同类型的急性淋巴细胞白血病(ALL)相当于正常淋巴细胞分化的不同阶段。在儿童ALL,常有ALL共同抗原(CALLA )的ALL细胞可能是B前体细胞。作者研究了7例儿童和3例成人ALL细胞T细胞生长因子(TCGF)的生成及其对TCGF的反应。采用单克隆抗体间接免疫荧光法用流式细胞光度计(荧光激活细胞分类器,FACS)分析细胞表型,证明在这些儿童ALL中有5例子-ALL,4例非T非B型(儿童和成人ALL各2例),裸细胞-ALL 1例(成人)。3例成人白血病细胞均为TdT阳性。正常或病人细胞的TCGF生成,按Gillis法测定;ALL细胞对TCGF的反应则以加入外源性TCGF培养3天后测定~3H-TdR的掺入率为指标。结果表明:不论表型如何,儿童ALL细胞均不能产生TCGF;相反,所有3例成人ALL的细胞都可以生成显著活性的TCGF。提示,TCGF的产生只限于     

T淋巴细胞激活与凋亡的信号转导及其分子机制

研究发现,人T淋巴细胞抗原受体复合物(TCR/CD3)中,TCR负责接受抗原刺激,CD3负责转导抗原刺激信号。抗TCR或抗CD3抗体的刺激不仅可以激活T淋巴细胞,也可以导致胸腺细胞、激活后的或转化的T淋巴细胞凋亡,但其分子机制和信号转导途径还不清楚。本文着重介绍了近年来这方面的研究工作进展。首先,利用人CD3ε过量表达的转基因小鼠发现,CD3ε分子的过量表达可阻断胎鼠的胸腺细胞发育,而在小鼠出生后,促进小鼠胸腺细胞的凋亡,随着年龄增加,胸腺细胞凋亡的数目增多。进而采用基因定点突变和基因转移等分子生物学研究技术,构建了CD8胞外区与跨膜区和CD3ε胞内区的融合分子及其突变分子,转染CD8~-的T淋巴细胞后,建立了细胞凋亡模型。利用此细胞凋亡模型,发现T细胞激活和凋亡的信号转导均是通过CD3ε分子的胞内区免疫酪氨酸受体激活基序(ITAM)中的2个酪氨酸转导的,其中任何1个或2个酪氨酸突变,均可阻断细胞信号的转导;在T细胞凋亡的过程中,立早基因Nur77和细胞凋亡基因fas表达显著增加,但未发现fas配体表达增加;在T细胞激活过程中,3-磷脂酰肌醇激酶P85α亚基与CD3ε-ITAM中的2个酪氨酸特异性地结合,其中任何1个酪氨酸突变,均大大减低P85α与CD3ε-ITAM的结合能力;使用合成的CD3ε-ITAM多肽及其酪氨酸突变了的突变体     

DC瘤苗激活的T淋巴细胞对胃癌细胞的杀伤效应研究

目的评估受DC融合性细胞瘤苗刺激的自体/异体T淋巴细胞的增殖性及其对肿瘤细胞的杀伤效应。方法收集健康志愿者外周血中白细胞层,经分离培养后获得成熟DC,再与SGC7901胃癌细胞经聚乙二醇(PEG)诱导融合,对融合细胞HAT/HT筛选培养,获得纯净的DC融合性细胞瘤苗。应用混合淋巴反应对DC融合性细胞瘤苗激活自体异体T淋巴细胞的增殖能力进行检测。选择DC融合性细胞瘤苗激活T淋巴细胞最强的1组,与SGC7901胃癌细胞混合培养,检测T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效性。结果200ml外周血制成的1U白膜可以获得(3.87±0.31)×107个DC细胞,成熟DC与SGC7901胃癌细胞经PEG诱导融合,可获得纯净DC融合性细胞瘤苗。DC融合性细胞瘤苗可显著刺激T淋巴细胞增殖,与自体/异体T淋巴细胞都是在效靶比10∶1时刺激能力最强,2种T淋巴细胞经DC融合性细胞瘤苗刺激后其增殖效应差异无统计学意义。DC融合性细胞瘤苗激活的自体/异体T淋巴细胞对SGC7901胃癌细胞的杀伤率分别为(77.16±2.76)%和(77.70±3.55)%,2种静息T淋巴细胞的杀伤率分别为(20.45±2.12)%和(21.31±2.86)%,DC融合性细胞瘤苗体外激活T细胞对SGC7901胃癌细胞的杀伤活性显著高于相应对照组(P<0.01)。结论采用健康志愿者DC制备的DC融合性细胞瘤苗在体外表现出对自体/异体T淋巴细胞具有相同的刺激效应,激活后的T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效率相似。