血清直接斑点杂交试验检测HBV—DNA及其影响因素的探讨

本文介绍了一种只用5—10uL血清样本的直接斑点杂交试验。并探讨了影响该方法效果的各种因素和临床应用意义。该法灵敏度达0.1pg,特异性好。检测322份样本中HBV-DNA( )116例。HBeAg( )组HBV-DNA( )百分率为88.9%,比抗HBe( )组(17.6%)和HBeAg(-)/抗HBe(-)组(11.0％)高(P<0.005)。本法具有敏感、特异、简便和快速等特点,可用于实验室和临床研究及抗病毒药物疗效的考核     

应用链霉亲和素在ELISA中检测HBe系统

应用链霉亲和素和生物素系统发展成ELISA的改良法,用于检测HBeAg和HBe,取得较为满意的效果。标记SA-HRP吋,两者的重量比以O.5～0.8/1为佳,浓度以7μg/ml时最为理想;SA-HRP的反应时间不同,亦会影响检测结果,其中以30min为适宜;本法、ABC法及普通法进行检测抗-HBe的灵敏度比较,本法相对灵敏度高于后两者。用Abbott试剂作为标准,检测HBeAg100人份、抗-HBe87人份,其阳性符合率、阴性符合率及总符合率均高于ABC法和普通ELISA,BSA法,提高了方法的特异性及灵敏度,在应用上有着广阔的前景。     

免疫金多元层析法快速检测乙肝五项血清学指标

目的 建立免疫多元层析试验用于快速准确检测乙肝五项血清学指标。方法 采用柠檬酸钠还原法制备金颗粒。将乙型肝炎病毒表面抗体(抗—HBs)、乙型肝炎病毒e抗体(抗—HBe)和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg),乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)用点膜器成线状固相在硝酸纤维薄膜上,分别用来检出血清中HBsAg、HBeAg、抗—HBs、抗—HBe,抗—HBc通过金标记单抗或抗原而显色,条带清晰,结果易于判断。结果 用本法与ELISA对比检测115份标本。其中HBsAg 、HBeAg 和抗—HBc 两法阳性符合率为96．3％。HBsAg ,抗—HBe 和抗—HBc 两法阳性符合率为97．4％,五项阴性两法的符合率为100％,重复试验、中和试验证实本法检测结果准确,特异性强,且不需任何仪器设备,整个试验过程仅需5min。最长时间为15min。结论 本法具有简便、快速、准确性、特异性强等特点。有广泛的应用价值。     

低水平血清乙型肝炎e抗原化学发光免疫分析法定量检测分析

目的：探讨低水平血清HBeAg在慢性乙肝患者中的分布和相关乙肝病毒血清标志物的模式特征。方法：采用化学发光免疫分析技术（CLIA）进行HBVM检测,同时与酶联免疫吸附试验（ELISA）检测HBeAg、抗HBe进行比较。结果：低水平HBeAg有5种携带模式,其中以HBsAg（＋）抗-HBs（-）HBeAg（＋）抗-HBe（-）抗-HBc（＋）和HBsAg（＋）抗-HBs（-）HBeAg（＋）抗-HBe（＋）抗-HBc（＋）模式最为多见。采用CLIA进行20次重复测定,平均值为（6.4±1.1） S/CO,对CLIA检测阳性86例HBeAg标本,同时用ELISA检测：结果阳性25例,阴性61例,漏检率70.9％。HBeAg（＋）/抗HBe（-）和HBeAg（＋）/抗HBe（＋）组HBeAg含量明显高于HBeAg（-）/抗HBe（＋）和HBeAg（-）/抗HBe （-）组。结论：CLIA检测血清HBeAg定量是目前临床上评价HBV复制较敏感、较稳定、较可靠的指标。     

长期HBV携带者HBsAg和rHBcAg诱导的抗体表达

本文研究了36例长期HBV携带者PBMC，在体外应用HBsAg和rBHcAg诱导特异体抗体的产生。结果表明：（1）长期HBV携带者中有61％的患者也可产生抗－HBs，其含量与正常对照组比明显低下（P＜0．01），导致抗0－HBs低下的原因可能与过量抗原的抑制，免疫细胞水平的耐受或细胞因子网络平衡失调有关。（2）rHBcAg可以诱导PBMC产生抗－HBc，财时亦可诱导抗－HBc，同时亦可诱导抗－HBe的产生，这可能由于HBcAg和HBeAg在细胞识 水平存在交叉反应。     

慢性乙型肝炎患者干扰素治疗过程中出现HBeAg／抗-HBe双阳性现象的临床分析

目的探讨慢性乙型肝炎（CHB）患者在干扰素治疗过程中出现E抗原（HBeAg）／E抗体（抗．HBe）双阳性现象的临床意义。方法回顾性分析317例CHB患者,观察聚乙二醇化干扰素（PEG．IFN—d）或普通干扰素（IFN—d）治疗过程中HBeAg／抗。HBe双阳性的发生率、持续时间和临床转归。结果HBeAg阳性CHB患者在干扰素治疗过程中,HBeAg／抗．HBe双阳性发生率为25．2％。HBeAg／抗一HBe双阳性时HBeAg滴度中位数（范围）为3．45（1．03～187．54）S／CO,抗．HBe滴度为0．52（0．03～0．99）S／CO,均接近于各自截断值。出现过HBeAg／抗一HBe双阳性患者的HBVDNA阴转率、HBeAg阴转率及HBeAg血清转换率分别为76．2％、62．5％、61．2％,高于未出现者的49．8％、35．9％、29．1％,差异均有统计学意义（P均〈0．05）。二分类Logistic回归显示,HBeAg阳性患者中,男性更易出现HBeAg／抗．HBe双阳性（OR=I．887;95％CI：1．013—3．518）。结论干扰素治疗过程中,CHB患者出现HBeAg／抗一HBe双阳性的现象并不罕见;其最终临床转归显示更易获得HBeAg血清学转换。     

乙肝患者HBVM、HBV-DNA与肝组织HBsAg、HBcAg相关性研究

目的：探讨乙肝血清HBVM、HBV-DNA与肝组织HBsAg、HBcAg表达的相关性。方法：分别应用ELASA和PCR法检测患者血清两对半及HBV-DNA含量，应用SP免疫组化法检测肝组织HBsAg、HBcAg。结果：血清HBsAg、HBeAg、抗-HBc均呈阳性模式，且与肝组织HBsAg、HBcAg呈正相关关系(X^2=9．154、P=0．003及X^2=8．465、P=0．004)。血清HBsAg、抗-HBe、抗-HBc均呈阳性模式，且与肝组织HBsAg无相关性(X^2=0．000，P=0．987)，与肝组织HBcAg呈负相关(X^2=5．506，P=0．019)。血清HBV-DNA与肝组织HBsAg、HBcAg呈正相关(X^2=11．331，P=0．001及X^2=8．848，P=0．003)。结论：血清HBsAg、HBeAg、抗-HBc均阳性模式及HBV-DNA与肝组织HBsAg、HBcAg表达有一致性，抗-HBe阳性病人肝组织HBcAg表达就低。     

阿德福韦联合胸腺肽治疗慢性乙型肝炎疗效观察

目的：观察阿德福韦联合胸腺肽治疗慢性乙型肝炎的疗效。方法：治疗组给予阿德福韦10mg／次，1糊天，疗程一年，前6个月同时给予胸腺肽胶囊15mg／次，2次／天；对照组仅给予阿德福韦10mg口服1次／天，疗程48周。两组均随访6个月。结果：治疗组与对照组在HBV—DNA转阴方面疗效相近，但在血清HBeAg转阴及HBeAg／抗HBe血清学转换率方面，在治疗48周时治疗组高于对照组（P〈0．05）。结论：早期联合用药有助于血清HBeAg转阴及HBeAg／抗HBe血清转换，在改善肝功能方面，ALT复常率各时间段治疗组均高于对照组，有显著性差别。     

259例HBcAg阳性结果分析

乙肝病毒核心抗原(HBcAg)存在于乙肝病毒(HBV)颗粒内部或与乙肝核心抗体(抗HBc)以复合物的形式存在,经开壳处理可检出,它是比乙肝病毒e抗原(HBeAg)更为可靠的HBV复制和传染性的标志。我们搜集了259例HBcAg阳性资料,对其结果进行了分析,并探讨了HBcAg与HBV其它五项指标(HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe和抗HBc)的关系。     

猪干扰素-γ基因表达产物的纯化与复性研究

目的：纯化、复性猪干扰素-γ基因（poIFN-γ）表达产物并分析其抗病毒活性。方法：用异丙基-β—D-硫代半乳糖苷（Isopropylthio—β—D—galactoside,IPTG）诱导原核表达载体pQE30／poIFN-γ,超声裂解包涵体,尿素溶解、Ni—NTA纯化和透析复性后,对所得的蛋白进行抗病毒活性检测。结果：经复性纯化的目的蛋白纯度达95％以上,在PK15细胞上抗滤泡性口炎病毒比活性为6．2×10^5u／mg。结论：获得PoIFN-γ活性蛋白,为进一步研究应用奠定基础。     

人脐带间质干细胞来源的外切体对大鼠肾小管上皮细胞缺氧损伤的干预作用

目的:观察体外缺氧损伤的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)凋亡情况以及分离纯化人脐带间质干细胞来源的外切体(hucMSCs-exosomes)对其干预作用。方法:将体外培养的NRK-52E细胞随机分为对照组、缺氧损伤模型组和hucMSCs-exosomes(0.5,1.0 mg/ml)预处理组。随后进行细胞计数,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2,bax)的表达变化,流式细胞仪检测细胞周期以及凋亡率的变化。结果:与对照组相比,模型组细胞凋亡相关指标均明显升高,细胞计数下降(P<0.01),Bcl-2/bax表达下调(P<0.01),细胞周期S期阻滞以及凋亡细胞比例明显增多。而hucMSCs-exosomes预处理组可明显改善缺氧损伤时的细胞活力,上调Bcl-2/bax的表达,改善细胞周期和凋亡细胞的比例(P均<0.05)。结论:NRK-52E在缺氧损伤时有明显的细胞凋亡,而hucMSCs-exosomes预处理可能通过抗凋亡途径减轻缺氧时细胞的损伤。本实验可为进一步研究hucMSCs-exosomes在组织损伤修复中的生物学功能和相关机制提供实验基础。     

丙型肝炎病毒E2蛋白的高效表达及其临床应用

目的：在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ）Ｅ２ 包膜蛋白,并对其进行初步纯化。用纯化的包膜蛋白检测ＨＣＶＲＮＡ 阳性血清中Ｅ２ 抗体,研究其检测Ｅ２ 抗体的敏感性和特异性。方法：将ＨＣＶＥ２ 蛋白基因克隆到原核表达载体中,并转化大肠杆菌。用ＩＰＴＧ 诱导细菌表达Ｅ２ 蛋白,经离子交换层析纯化蛋白。用纯化的包膜蛋白包被微孔板,经ＥＬＩＳＡ方法检测ＨＣＶＲＮＡ阳性血清中的Ｅ２ 抗体。结果：在大肠杆菌表达了相对分子质量为４５ ０００ 的可溶性Ｅ２ 蛋白,占细菌总蛋白量的２１％ ,纯化后,蛋白纯度为８５％ 。用其检测ＨＣＶ 患者血清１７１ 例,Ｅ２ 抗体的检出率为６３％ 。在Ｅ２ 抗体阳性的血清中,部分为抗ＨＣＶ 阴性。结论：Ｅ２ 蛋白的表达及初步纯化的成功,可能用于临床检测。各基因型ＨＣＶＥ２ 包膜蛋白的抗体之间有交叉反应,在目前的抗ＨＣＶ 诊断试剂中加入可溶性、非融合Ｅ２ 包膜蛋白,可以改善抗ＨＣＶ 诊断试剂的特异性和敏感性。     

HBcAg肽特异性CD8^＋T细胞抑制乙型肝炎病毒的体外实验研究

摘要目的观察HBV感染者的HBcAg肽特异性CD8^＋T细胞体外抑制乙型肝炎病毒（HBV）的作用和探讨非溶细胞机制清除病毒的效应分子。方法以HepG2．2．15细胞为靶细胞。用HLA—A匹配的HBcAg肽特异性CD8^＋T细胞克隆（效应细胞）与靶细胞（效靶比例1：50）共同培养,于24h、48h和72h收集培养上清,通过检测其中HBV产物的变化,观察CD8^＋T克隆对HBV的抑制作用。用抗体中和法观察CD8^＋T细胞分泌的IFN-γ被封闭后HBV抑制的变化。结果HBV特异性CD8^＋T克隆与靶细胞共育后,培养上清可检出高水平IFN-γ。共育后对HBsAg、HBeAg和HBV—DNA的最高抑制率分别为54．55％、50．36％和74．55％,均在72h。IFN-γ被抗体封闭后,对HBVDNA的抑制率显著下降,24h和48h分别为6．22％和17．48％。细胞毒活性最高见于24h,15．66％。结论①病毒特异性CD8^＋T细胞对靶细胞中HBV的清除既有溶细胞机制,也有非溶细胞机制参与;②IFN-γ是非溶细胞机制清除病毒的主要效应分子。     

氧化苦参碱对大肠埃希菌的体外药敏试验

目的：：观察氧化苦参碱对大肠埃希菌标准株的体外药敏情况。方法：采用二倍稀释法,用0.9%氯化钠注射液将苦参碱胶囊分别稀释为8000、4000、2000、1000、500、250、125、62.5 mg/L的药液,按药液：MH琼脂=1：9的比例分别配制含药培养基,每个浓度各3个,并设空白和0.9%氯化钠注射液组为对照。大肠埃希菌复苏后,配制菌液备用,接种环取菌液一环接种于各培养基内,置36℃的培养箱内,培养24 h,观察结果。结果：各个含药培养基大肠埃希菌生长良好,与对照组相比无明显差异。结论：氧化苦参碱对大肠埃希菌的生长无影响。     

软肝饮对HBV转染细胞表达功能抑制的实验研究

目的 :观察软肝饮对HBV转染细胞表达功能的影响。方法 :本研究以乙型肝炎病毒 (HBV)转染细胞 (2 2 15细胞系 )作为筛选抗HBV药物的细胞模型 ,观察了纯草药方软肝饮对 2 2 15细胞分泌HBV表面抗原(HBsAg)和HBVe抗原 (HBeAg)的影响 ,并以抗病毒药物无环鸟甘为对照。结果 :软肝饮对 2 2 15细胞无明显毒性作用 ,同时显著抑制HBsAg成分。结论 :提示软肝软在体外有一定的抗病毒作用。     

真核表达载体pcDNA3.0-Cx43的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的：构建携带间隙连接蛋白connexin43(Cx43)cDNA的真核表达载体,转染骨髓基质干细胞,观察间隙连接蛋白Cx43在骨髓基质干细胞中的过量表达．方法：目的基因Cx43 cDNA在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体pcDNA3．0,转染大鼠骨髓基质干细胞,用G418筛选得到Cx43基因高表达的细胞;对照组为pcDNA3．0直接转染骨髓基质干细胞．结果：酶切电泳结果显示按设计构建的载体pcDNA3．0-Cx43,经G418筛选得到不同抗性的骨髓基质干细胞,免疫细胞化学显示有Cx43蛋白的表达．结论：Cx43可以在骨髓基质干细胞中表达．     

HBV体外感染人胎肝细胞的鉴定方法研究

目的通过HBV体外感染22周龄原代培养人胎肝细胞,比较常用检测指标的敏感性和特异性.方法利用HBV阳性血清感染体外培养的原代人胎肝细胞.应用ELISA法检测培养上清中的HBsAg和HBeAg,免疫组化法检测细胞核中的HBcAg,荧光定量PCR法检测上清和细胞中HBV DNA,巢式PCR法检测细胞中cccDNA.结果胎肝细胞核中的HBcAg于感染后第2天出现阳性,培养上清和细胞中HBVDNA定量自第4天起检出,上清中HBsAg和HBeAg于第5～6天出现阳性;细胞中HBV cccDNA自第8～9天出现阳性.结论HBV在原代培养人22周龄的胎肝细胞中能够稳定复制和表达,各种检测指标的灵敏性和特异性不一,免疫组化法检测细胞核中的HBcAg敏感性好,特异性可.     

丁香多总皂对HBV转染细胞表达功能的影响

目的：观察丁香多总皂对HepG2．2．15细胞分泌HBeAg和HBsAg的影响．方法：采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测培养上清中HBeAg和HBsAg表达的变化并以抑制率来表示．结果：丁香多总皂对HBeAg和HBsAg的分泌具有抑制作用，该作用呈现剂量依赖性和时间依赖性。结论：丁香多总皂对HBeAg和HBsAg分泌的抑制作用提示其在体外具有抗乙型肝炎病毒的作用。     

慢性乙型肝炎合并肝癌患者树突状细胞负载乙型肝炎病毒抗原后表型和功能的研究

目的研究慢性乙肝合并肝细胞癌(HCC)患者外周血髓样树突状细胞(mDC)负载乙型肝炎病毒(HBV)抗原后表型和功能的变化。方法用成分血分离机采集21例肝细胞癌患者和4名健康人的外周血单核细胞(PBMC),用无血清AIMV培养基加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)和白细胞介素(IL)4等因子诱导mDC分化、发育和成熟,同时加入HBcAg或HBsAg致敏mDC,通过流式细胞仪分析mDC表面分子的表达,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测mDC培养上清中IL12、IL10的含量,通过自体混合淋巴细胞反应(AMLR)比较抗原致敏后mDC刺激淋巴细胞增殖的能力。结果在肝细胞癌患者中,(1)经HBcAg致敏的mDC表面分子CD80、CD86、CD40、HLADR的表达率(55%±26%、80%±13%、70%±13%、73%±24%)明显高于无抗原致敏组mDC(29%±25%、35%±18%、44%±26%、45%±23%,P<005);经HBsAg致敏的mDC仅HLADR的表达率(63%±15%)高于无抗原致敏组(45%±23%,P<005),其他表面分子差异无统计学意义。(2)在AMLR中经HBV抗原致敏的mDC刺激淋巴细胞增殖的能力明显高于无抗原致敏组(P<005),而且HBcAg的致敏效果优于HBsAg的致敏效果(P<005)。(3)经HBcAg致敏的mDC分泌IL10和IL12的量(236pg/ml±95pg/ml,733pg/ml±212pg/ml)明显高于经HBsAg致敏的mDC(35pg/ml±9pg/ml,135pg/ml±63p