家蝇3龄幼虫抗肿瘤肽促K562细胞凋亡作用及其机制研究

目的观察家蝇3龄幼虫抗肿瘤肽对K562细胞核和线粒体膜电位及K562细胞凋亡蛋白半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的影响,进而探讨家蝇3龄幼虫抗肿瘤肽是否可以影响线粒体膜电位及促进K562细胞凋亡。方法首先采用Hoechst33258荧光标记法,将家蝇3龄幼虫峰5、峰8组分作用于K562细胞,用荧光显微镜检测K562细胞核荧光强度的变化;其次采用荧光探针罗丹明123标记K562细胞,在激光扫描共聚焦显微镜下观察K562细胞中罗丹明123荧光强度,以细胞内荧光强度表示线粒体膜电位大小;最后用caspase-3检测试剂盒和酶标仪测定K562细胞caspase-3的含量。结果采用Hoechst33258荧光标记法,用荧光显微镜观察到家蝇3龄幼虫峰5、峰8组分作用于K562细胞后部分细胞核的荧光强度增强,说明其可以引起K562细胞发生凋亡;用罗丹明123标记,激光共聚焦显微镜观察发现,家蝇3龄幼虫峰5、峰8组分作用组的K562细胞荧光强度值明显低于对照组(t1=21.30,t2=196.23,P<0.05),说明家蝇3龄幼虫抗肿瘤肽可以使K562细胞线粒体膜电位降低;峰5、峰8组分作用组caspase-3的含量明显高于对照组(t1=146.92,t2=189.56,P<0.05),说明3龄幼虫抗肿瘤肽可以促进K562细胞发生凋亡。结论家蝇3龄幼虫抗肿瘤肽峰5、峰8组分对K562细胞核具有损伤作用,可以引起K562细胞发生凋亡,作用机制是通过降低K562细胞线粒体膜电位,激活caspase-3,扰乱其生理功能,促使其凋亡。     

Wortmannin抑制PI3K途径对白血病细胞周期特异性及BCL-2蛋白表达影响的研究

目的探讨Woltmannin抑制PI3K途径对K562、NB4、HL60细胞周期特异性、BCL-2蛋白表达的影响。探明PI3K途径在K562、NB4、HL60细胞周期、细胞凋亡、BCL-2蛋白表达中的不同作用。方法用PI3K特异抑制剂Wortmannin抑制PI3K途径．AraC诱导细胞凋亡，药物作用214h后，细胞经DNA特异性荧光染色，用流式细胞仪(FCM)检测细胞DNA含量、BCL-2蛋白表达。Multicyele Verson 4．00软件分析细胞DNA含量直方图及细胞周期、BCL-2蛋白表达。观察各细胞系增殖周期、细胞凋亡的变化。结果K562、NB4、HL60细胞经Wortmannin、Ara-C、Wortmannin Ara-C作用24h后细胞出现DNA含量低于G1期的亚二倍体峰(亚G1期细胞)这一凋亡细胞的特征性改变，实验组细胞增殖指数(PI)明显低于对照组，凋亡百分比显著增加。Wortmannin可以通过抑制PI3K通路使K562细胞阻滞于G1期。作用24h后细胞实验组细胞BCL-2蛋白表达较对照组降低，说明Wortmannin可促进K562细胞的凋亡。结论Wortmannin可以通过抑制PI3K通路抑制K562细胞的增殖。并可以通过抑制PBK通路使K562细胞阻滞于GI期。Wortmannin可抑制K562细胞的BCL-2蛋白表达，促进K562细胞的凋亡。Wortmannin属于细胞周期特异性药物。     

白藜芦醇对K562细胞增殖凋亡及分化的影响

目的研究白藜芦醇(resveratrol,Res)对人K562细胞增殖、凋亡、分化及血红蛋白合成的影响。方法通过细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)法检测Res对K562细胞增殖的影响,流式细胞分析仪检测Res对K562细胞凋亡率的影响,联苯胺染色及血红蛋白测定检测Res对K562细胞红系分化及血红蛋白合成的作用。结果不同浓度Res作用后可时间和剂量依赖性地抑制K562细胞的增殖,可浓度依赖性地促进K562细胞的凋亡;Res单独作用后未能引起K562细胞联苯胺染色阳性率和血红蛋白含量发生变化。而Res预处理后能增加氯化血红素诱导的细胞联苯胺染色阳性率和血红蛋白含量。结论白藜芦醇能够抑制K562细胞增殖、促进其凋亡,白藜芦醇可增强K562细胞红系分化的能力,但并不能直接引起K562细胞的红系分化。     

家蝇幼虫抗菌肽对K562细胞膜的质量浓度阈值作用

目的探讨家蝇3龄幼虫抗菌肽对K562细胞膜的作用。方法通过针刺感染大肠埃希菌诱导家蝇3龄幼虫大量表达抗菌肽,然后经过研磨、离心、固相萃取、反相高效液相色谱分离纯化家蝇3龄幼虫抗菌肽,采用四甲基偶氮噻唑蓝比色法和光镜观察法筛选对K562有抑制作用的抗菌肽;用不同质量浓度的峰5、峰8处理K562细胞,采用台盼蓝拒染法测定细胞存活率和生长曲线的变化;用光学显微镜和荧光显微镜检测细胞膜形态的变化;用荧光分光光度计检测细胞膜荧光素的渗漏;用激光共聚焦显微镜观察细胞膜的损伤程度。结果低质量浓度(<50μg/ml)对细胞存活率无明显影响,细胞整体形态变化不大,细胞荧光素渗漏较少[(18.95±0.05)～(22.49±0.68)],细胞损伤甚微;高质量浓度(≥50μg/ml)使细胞存活率明显下降,细胞形态变化逐渐增大,细胞荧光素渗漏较多[(62.77±4.08)～(70.81±0.18)],甚至大分子荧光素DextranFITC可以通过。结论家蝇3龄幼虫抗菌肽对K562细胞膜的作用存在质量浓度阈值,低质量浓度时可引起膜通透性增加,高质量浓度时可引起细胞膜严重损伤。家蝇幼虫抗菌肽可能通过直接杀伤作用抑制K562细胞生长,其作用机制首先是通过对膜作用,然后可能进一步对膜作用从而使膜上孔洞不断扩大或者进入细胞后经过其他途径抑制K562细胞生长。     

氯化甲基汞及三氧化二砷对K562细胞凋亡的影响

目的研究氯化甲基汞（MMC）及三氧化二砷（ATO）对K562细胞凋亡的影响。方法K562细胞经1．25、2．5、5、10和20μmol／LMMC或ATO作用24h，采用FITC-“Annexin”V／PI双染法进行细胞凋亡率的检测。结果K562细胞接触不同剂量MMC或ATO 24h，随着剂量增加凋亡率不断增加，5．0μmol／L的细胞凋亡率分别为（31．54±6．35）％和（25．37±7．68）％，与空白对照组（10．36±3．23）％比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论MMC及ATO均能促进K562细胞凋亡，且呈剂量依赖性。     

4-邻氨基酚-4＇去甲表鬼臼酯（ODE）在K562肿瘤细胞凋亡中的作用

目的 研究不同浓度4-邻氨基酚-4＇去甲表鬼臼酯（ODE）对肿瘤细胞生长的影响,探讨ODE诱导肿瘤细胞凋亡的机制.方法 采用MTT法测定ODE对K562细胞生长的抑制作用,透射电镜观察细胞超微结构,免疫细胞化学方法检测K562细胞中 Bcl-2/Bax 比率变化.结果 （1）不同浓度ODE对K562细胞生长有抑制作用,随ODE浓度的增加及作用时间的延长细胞生长抑制率增高（P〈0.05）;（2）透射电镜观察可见凋亡细胞发生;（3）凋亡细胞中Bcl-2灰度较正常细胞染色的灰度低,Bax在凋亡细胞中的灰度较正常细胞高.结论 ODE能够显著抑制K562细胞的生长,其抑制作用随浓度的增加及时间的延长而增强,通过形态学可观察到凋亡细胞的产生,其诱导凋亡可能是通过改变凋亡基因而发挥作用的.     

硒化壳聚糖逆转K562/ADM细胞耐药与PI-3K/Akt信号通路的关系

目的研究硒化壳聚糖对体外培养多药耐药白血病细胞株K562/ADM的耐药逆转作用,探讨其与PI-3K/Akt信号通路的关系。方法 K562/ADM细胞培养于含0.6μg/ml阿霉素的培养液中维持其耐药性,应用MTT法检测硒化壳聚糖对K562/ADM细胞增殖的作用,计算逆转倍数;应用流式细胞法检测细胞凋亡;应用免疫印迹法检测磷酸化Akt(p-Akt)和P糖蛋白(P-gp)表达的改变。结果 K562/ADM细胞对阿霉素(ADM)耐药,硒化壳聚糖可有效抑制K562/ADM细胞增殖,呈一定的剂量和时间效应关系(P0.05,P0.01);硒化壳聚糖能够对K562/ADM细胞耐ADM产生一定的逆转作用,明显增强ADM对K562/ADM细胞的诱导凋亡作用(P0.05,P0.01),下调p-Akt和P-gp水平(P0.01)。结论硒化壳聚糖对耐药白血病细胞株K562/ADM可产生增殖抑制和多药耐药逆转作用,其部分逆转机制可能是通过诱导细胞凋亡,抑制细胞P-gp表达,阻断细胞PI-3K/Akt信号通路而实现。     

藏红花素对K562细胞株及裸鼠移植瘤的抑制作用的研究

目的探讨藏红花素对K562细胞株及裸鼠移植瘤的作用。方法利用MTT法检测不同浓度藏红花素对K562细胞的增殖抑制影响;Annexin V-FITC标记法检测K562细胞凋亡;建立K562细胞Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型,荷瘤小鼠随机分成4组,分别用10、50、100 mmol/L浓度的藏红花素和生理盐水对瘤体进行局部注射,每次0.1 ml,隔日1次,连续7次,观察瘤体变化。结果不同浓度藏红花素对K562细胞均有抑制作用,呈明显的剂量依赖性,抑制率分别为21.5%、55.1%、81.6%(P<0.05);浓度为0.003 2 mol/L的藏红花素诱导K562细胞凋亡作用最显著,浓度为6.4 mmol/L的藏红花素使K562细胞呈中毒反应,凋亡作用不明显;藏红花素组瘤体生长较对照组明显受到抑制,不同浓度的藏红花素抑瘤率分别为18.5%、79.2%、91.6%。结论藏红花素具有显著抑制K562细胞增殖及促凋亡的作用,能有效抑制K562细胞Balb/c裸鼠移植瘤的生长。     

1，25-二羟基维生素D3对K562细胞周期及凋亡的影响

目的观察1，25-二羟基维生素D3[1，25（OH）2D3]对白血病细胞株K562细胞周期及细胞凋亡的作用。方法Western印迹检测维生素D受体（VDR）在K562细胞的表达；四噻唑蓝法（MTT）、AO／EB、流式细胞仪分析细胞生长抑制率、细胞凋亡率及细胞周期。结果（1）K562细胞核阳性表达VDR；（2）0-10^-6mol／L浓度的1，25（OH）2D3呈浓度依赖性抑制K562细胞增殖，10^-8mol／L 1，25（OH）2D3明显抑制K562细胞增殖，促进凋亡，细胞周期阻滞主要发生在G2期或M早期，凋亡率从4．1％（对照组）增至26．5％（P〈0．01）。结论1，25（OH）2D3可明显抑制K562细胞增殖，促进细胞凋亡。     

LSC-DC-CIK对慢性粒细胞白血病干细胞杀伤作用的体外试验研究

目的 研究慢性粒细胞白血病(CML)患者来源的干细胞体外扩增诱导生成树突细胞(DC),与同来源的细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养,对慢性粒细胞白血病细胞株K562干细胞的杀伤作用.方法 提取CML患者的骨髓单个核细胞(BMMC),利用流式细胞术(FCM)分选纯化白血病干细胞(LSC)CD34+CD38-CD44+,体外扩增诱导生成LSC-DC.取同一患者骨髓的BMMC诱导出CIK.LSC-DC与CIK共培养,用光学显微镜观察细胞形态,FCM分析LSC-DC和CIK细胞免疫表型,荧光原位杂交(FISH)检测BCR/ABL融合基因在LSC及LSC-DC中的表达,FCM检测LSC-DC-CIK对慢性粒细胞白血病细胞株K562干细胞的杀伤及凋亡情况.结果 白血病干细胞能成功诱导为LSC-DC,其DC成熟免疫表型CD40、CD80、CD83、CD86及受体(HLA-DR)的表达均高于诱导前;共培养后CIK表面标志CD3、CDs、CD56的表达率高于单独培养CIK,差异有统计学意义(P＜0.01).LSC-DC与CIK共培养后对慢性粒细胞白血病细胞株K562干细胞的杀伤率(66.94％)明显高于单独培养的CIK(31.89％),差异有统计学意义(P＜0.01).LSC-DC-CIK可诱导K562细胞凋亡,凋亡率为52.28％±3.71％,与CIK组(37.51％±1.89％)相比,差异有统计学意义(P＜0.01);但对其中白血病干细胞无明显的诱导凋亡作用.结论 CML来源LSC-DC保留有干细胞特征,其与CIK共培养能杀伤慢性粒细胞白血病细胞株干细胞,但无明显的诱导干细胞凋亡作用.     

Wortmannin抑制PI3K途径对bcr/abl基因介导的白血病细胞增殖和凋亡抗性影响的研究

目的探讨磷酰肌醇-3激酶(PI3K)途径在K562、NB4和HL60细胞增殖和凋亡抗性中的不同作用。方法用磷酰肌醇-3激酶(PI3K)特异抑制剂Wortmannin(WT)抑制PI3K活性,经细胞生长曲线测定、半固体集落形成实验、流式细胞膜联蛋白V(Annexin-V-Flous)标记技术检测细胞凋亡百分比和凋亡指数。观察K562、NB4和HL60细胞增殖能力及凋亡抗性的变化。结果K562、NB4和HL60细胞在24、48、72h的增殖抑制率分别为41.33%、57.46%、65.85%和26.29%、5.51%、2.10%及32.14%、17.14%、13.14%。生长曲线显示WT抑制PI3K途径可显著抑制K562细胞的增殖,对NB4和HL60细胞增殖无明显影响。K562、NB4和HL60细胞加和不加WT,培养14d后的集落形成率分别为16.15%和7.60%,5.90%和6.10%,6.60%和6.40%。集落形成抑制率为52.94%、3.39%和3.03%。K562、NB4和HL60细胞加WT、AraC、WT+AraC作用24h后的凋亡细胞百分比分别为(17.27±1.94)%、(23.25±14.12)%、(17.60±1.27)%;(17.00±3.36)%、(20.55±8.57)%、(22.07±5.62)%;(27.60±4.36)%、(17.56±9.28)%、(20.50±7.97)%。凋亡指数分别为(6.88±2.66)、(7.79±2.75)、(3.03±0.56);(8.91±3.86)、(9.35±4.19)、(3.79±0.93);(13.39±4.49)、(7.61±6.35)、(5.27±2.69)。结论WT可以通过抑制PI3K通     

Synthesis and induction of G0-G1 phase arrest with apoptosis of 3,5-dimethyl-6-phenyl-8-(trifluoromethyl)-5,6-dihydropyrazolo[3,4-f][1,2,3,5]tetrazepin-4(3H)-one

The multistep synthesis of 3,5-dimethyl-6-phenyl-8-(trifluoromethyl)-5,6-dihydropyrazolo[3,4-f][1,2,3,5]tetrazepin-4(3H)-one 15 has been carried out. The compound showed antiproliferative and apoptotic effects against K562, K562-R (imatinib mesilate resistant), HL60 and multidrug resistant (MDR) HL60 cell lines. Compound 15 showed a pro-apoptotic activity against HL60 and K562 resistant cell lines markedly higher than etoposide and busulfan, respectively. Flow cytometry studies carried out on K562 cells allowed to establish that 15 induces G0-G1 phase arrest followed by apoptosis.     

急性淋巴细胞白血病患儿骨髓间充质干细胞对K562细胞株药物耐受性的影响

目的 研究急性淋巴细胞白血病患儿骨髓间充质干细胞（MSCs）对K562细胞药物耐受性的影响,并初步探讨其机制.方法 从白血病患儿骨髓中分离、培养并鉴定MSCs;建立K562细胞株与MSCs共培养的体系,观察MSCs对K562细胞生长的影响;AnnexinV-FITC检测一定浓度的阿霉素（ADM）对K562细胞凋亡的影响;流式细胞仪测定不同培养条件下的K562细胞周期;RT-PCR检测K562细胞的Bcl-2和Bax基因.结果 和单独培养的K562细胞相比,与MSCs黏附共培养的K562细胞生长较为缓慢,未见明显的对数生长期.单独培养组细胞早期凋亡率为（9.19±0.53）%,而黏附培养组为（4.00±0.37）%,差异具有统计学意义（P＜0.05）.黏附共培养组K562细胞,G0-G1期细胞比例为（80.95±3.83）%,显著高于单独培养组（50.2±2.26）%（P＜0.05）;而S期细胞比例为（17.40±1.50）%,显著低于单独培养组（37.03±3.50）%（P＜0.05）.相对于单独悬浮培养的K562细胞,黏附共培养的K562细胞Bcl-2基因相对表达明显增强,Bcl-2/Bax显著增高.结论 白血病患儿MSCs能抑制白血病细胞株K562生长,改变细胞周期而逃避药物的促凋亡作用,K562对阿霉素产生耐药性可能与黏附共培养后Bcl-2基因表达增强有关.     

维甲酸诱导肺癌细胞凋亡的研究

[目的]探讨维甲酸(RA)诱导肺癌细胞的凋亡.[方法]采用吖啶橙(AO)荧光染色及透射电镜(TEM)观察RA作用后的肺癌A59细胞株的凋亡改变.[结果]RA(10-5M/L)作用6 d后,A59细胞由2×104/L下降为0.9×104个/L,AO荧光染色后RA处理组较对照组有更多的凋亡细胞及凋亡指数,P＜0.05,(TEM)亦观察到在RA处理组中有明显的凋亡改变.[结论]RA能够抑制肺癌细胞的增殖并诱导该肿瘤细胞出现凋亡改变.     

三氧化二砷联用华蟾素对K562细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究三氧化二砷联用华蟾素对K562细胞增殖和凋亡的影响,为三氧化二砷和华蟾素联合应用于临床提供理论依据.方法 细胞增殖采用细胞生长及活力测定;细胞凋亡采用细胞形态、Annexin-V/PI双染实验、DNA的PI染色及DNA电泳等方法 测定.结果 在三氧化二砷和华蟾素作用下K562细胞生长受抑伴随活力下降,1.0 μmol/L As2O3、0.125μg/rnl华蟾素、0.25 μg/ml华蟾素、1.0 μmol/L As2O3＋0.125μg/ml华蟾素、1.0 μmol/L As2O3＋0.25μg/ml华蟾素作用K562细胞24 h和48 h后,增殖抑制率分别为（24±1.3）%、（21±1.5）%、（38±3.1）%、（57±2.7）%、（66±3.3）%及（49±2.9）%、（48±2.7）%、（61±2.1）%、（77±3.8）%、（82±4.2）%,细胞凋亡率分别为（4.8±0.5）%、（5.6±0.7）%、（9.8±0.6）%、（11.9±1.2）%、（15.2±1.5）%及（11.0±0.9）%、（12.9±1.1）%、（18.4±1.5）%、（21.0±2.0）%、（28.0±1.9）%,凋亡细胞百分率呈时间剂量依赖关系;基因组DNA电泳出现＂梯＂状条带.结论 三氧化二砷和华蟾素均有抑制K562细胞增殖和诱导该细胞凋亡的作用,两药联用效果更佳.