VITEK MALDI-TOF MS技术在临床分离诺卡菌快速鉴定中的简易流程优化

目的 本研究利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱-VITEK MALDI-TOF MS,对临床分离诺卡菌进行快速、准确、简易的菌种鉴定。方法 对46株临床分离的诺卡菌进行研究,以16S rRNA和gyrB基因测序结果为参考标准,探索VITEK MALDI-TOF MS技术在诺卡菌菌种鉴定程序中的关键步骤,优化鉴定流程。结果 46株诺卡菌共有43(93.5%)株可鉴定至种水平,45(97.8%)株可鉴定至属水平。对分离率最高的盖尔森基兴诺卡菌和鼻疽诺卡菌的鉴定率更是高达100.0%(22/22和7/7株)。结论 实验结果表明,VITEK MALDI-TOF MS技术可以实现对临床分离诺卡菌的快速、准确鉴定,简易鉴定流程为广泛应用于临床微生物实验室提供了重要基础保障。     

产丙酮酸棒状杆菌的鉴定及微生物学性状研究

目的对临床分离于皮脂腺囊肿标本中的菌株进行表型和基因型鉴定,描述该菌株的生物学特性及致病性,为临床诊断提供准确地病原学依据。方法对分离菌株进行革兰氏染色等,并使用VITEK 2Compact全自动微生物分析仪进行鉴定。采用K-B法进行药敏试验。提取分离菌株DNA,采用通用引物对16S rRNA基因进行PCR扩增并测序,将测序结果与GenBank中收录的16S rRNA基因序列进行BLAST同源性对比。结果分离菌株经VITEK 2Compact鉴定为玫瑰色库克菌,后经16S rRNA序列测定方法鉴定,分离菌株为产丙酮酸棒状杆菌。药敏试验显示该菌株对四环素、万古霉素、利福平敏感,对青霉素、红霉素、克林霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明、头孢吡肟、亚胺培南、庆大霉素等均耐药。结论对于表现型不易鉴定或鉴定不准确的细菌,采用16SrRNA序列测定的方法进行鉴定是最准确的。产丙酮酸棒状杆菌是引起患者疾病的致病菌。在完善产丙酮酸棒状杆菌生化反应信息的同时,探索出有效可行的生物学鉴定方法。     

一株人血源猪链球菌的分离鉴定与毒力基因检测

目的对北京某医院就诊的一例疑似人感染猪链球菌病患者的血液来源菌株进行鉴定与毒力因子检测分析。方法将患者血液分离菌株接种哥伦比亚血琼脂平板,经革兰氏染色镜检、血清凝集试验、VITEK 2Compact微生物分析仪以及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测后,再用PCR技术检测猪链球菌种特异性基因(16S rRNA)和猪链球菌2型特异性荚膜多糖编码基因(cps2J)以及多个毒力基因:溶菌酶释放相关蛋白(mrp)、溶血素(sly)、细胞外蛋白因子(ef)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、纤粘连蛋白结合蛋白(fbps)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)的编码基因和毒力相关基因orf2。结果传统细菌鉴定方法和蛋白质谱技术以及核酸检测方法将这株患者血源性细菌分离株鉴定为猪链球菌2型,该菌株的毒力基因cps2J、sly、ef、gdh、fbps、gapdh和orf2的PCR检测均为阳性,mrp基因为阴性。结论该株人血源细菌分离株为猪链球菌2型sly+/ef+/mrp强毒株。     

1株蔬菜源mcr-1阳性多重耐药大肠杆菌特征分析

目的 对蔬菜源mcr-1阳性多重耐药大肠杆菌的菌株特征进行分析。方法 2019年从扬州2个超市采集251份零售蔬菜样品,通过麦康凯平板和含2 mg/L头孢噻肟的麦康凯板进行肠杆菌的分离,PCR和测序检测黏菌素耐药基因mcr-1的携带情况,利用16S rRNA基因扩增和测序对mcr-1阳性肠杆菌进行菌种鉴定,采用微量稀释法测定其对常见16种抗菌药物的敏感性,并通过全基因组测序分析该菌株的特征。结果 共分离得到189株肠杆菌,其中仅在1株分离自生菜的大肠杆菌中检测到mcr-1。该菌株对黏菌素最小抑菌浓度为8 mg/L,多序列位点分型结果为ST359,携带bla_TEM-1b、bla_CTX-M-14、fosA3、oqxAB、tet(A)、strAB、floR、sul2、dfrA12等多种耐药基因,染色体GyrA在第83位(S83L)和第87位(D87N)氨基酸发生突变,ParC在第80位氨基酸(S80I)发生突变。该菌对氨苄西林、头孢唑啉、头孢噻肟、链霉素、四环素、氯霉素、氟苯尼考、奈啶酸、环丙沙星、磷霉素和复方新诺明耐药。mcr-1基因位于IncI2质粒上,与国内外报道的携带mcr-1的IncI2质粒高度相似。结论 已在蔬菜沾染细菌中发现mcr-1基因,且mcr-1基因位于全球流行的IncI2质粒上,应加强对蔬菜中耐药菌的监测。     

129株非结核分枝杆菌采用两种分子检测技术行菌种鉴定的结果分析

目的 分析北京地区3个单位非结核分枝杆菌 (NTM)临床分离株采用芯片杂交法(简称“芯片法”)和16S rRNA基因测序(简称“基因测序”)进行菌种鉴定的结果,为临床分枝杆菌病的快速准确诊断提供科学依据。方法 用芯片法和基因测序进行北京地区3个单位129株NTM临床分离株的菌种鉴定,实验操作者之间采用双盲法,对两种鉴定方法的结果进行比较和评价。结果 129株NTM菌株中,有107株进行分枝杆菌基因测序,其中59株为胞内分枝杆菌(55.1%);29株为堪萨斯分枝杆菌(27.1%);5株为龟分枝杆菌/脓肿分枝杆菌(4.7%);3株为鸟分枝杆菌(2.8%);2株为偶发分枝杆菌(1.9%);2株为戈登分枝杆菌(1.9%);1株为蟾蜍分枝杆菌(0.9%);1株为草分枝杆菌(0.9%);1株为瘰疬分枝杆菌(0.9%);4株为其他NTM(3.7%)。有116株进行芯片法分枝杆菌菌种鉴定,且有96株同时进行芯片法和基因测序法检测,两种方法进行菌种鉴定的符合率为88.5%(85/96)。基因测序发现有3株外来菌株,分别为明尼苏达分枝杆菌、熊本分枝杆菌、提门分枝杆菌(M.temen)。结论 北京3家机构NTM菌种以胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和龟分枝杆菌/脓肿分枝杆菌为主。用芯片法和基因测序对NTM临床分离株进行菌种鉴定的一致率较高。     

16S-23SrDNA间隔区序列PCR扩增及探针杂交用于偶然分支杆菌暴发感染的研究

目的　从基因水平上确认福建省南平市注射后偶然分支杆菌暴发感染的致病菌,并建立PCR结合DNA探针杂交快速鉴定偶然分支杆菌的方案。方法 根据偶然分支杆菌16S-23S rDNA间隔区序列,设计合成一段寡核苷酸探针,采用PCR扩增、RFLP和DNA斑点杂交技术,对29株偶然分支杆菌临床分离株进行鉴定。结果 29株偶然分支杆菌临床分离株均被PCR扩增出一条约470bp的DNA条带,DNA探针杂交也出现特异的杂交斑点。结论 16S23SrDNA间隔区序列PCR扩增及DNA探针杂交在基因水平上确认引起此次注射后暴发感染的致病菌为偶然分支杆菌,该方法具有灵敏、特异的特点。     

24株停乳链球菌似马亚种的分子鉴定和基因分型

目的 探讨停乳链球菌似马亚种(Streptococcus dysgalactiae subspecies equisimilis,SDSE)感染的临床分布特点及分子特征。方法 收集SDSE感染患者的临床资料及相应分离菌株,分离株经全自动微生物分析系统、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)及PCR扩增16S rRNA和链激酶前体基因等3种方-法进行鉴定。对SDSE菌株进行M蛋白基因(emm)分型和多位点序列分型(Multilocus sequence typing, MLST),并通过BioNumerics 6.6软件进行聚类分析。结果 24株停乳链球菌似马亚种主要分离自咽拭子、皮肤、血液,分别占58.33%、20.83%、8.33%;24株SDSE被分为5种emm类型,以stCNSRT2.0(n=16,66.7%)占优势,其次是stG840.0(n=3,12.5%)。通过MLST分型,共有6种ST型别,以ST44(n=17,70.8%)为主,ST605为新定义的ST型。结论 本研究中SDSE分离株具有分子多样性,ST605为首次报告的MLST型别。     

一起聚集性发热伴血小板减少综合征病原S基因分子进化分析

目的 对2020年4月南京鼓楼医院送检的一起疑似聚集性发热伴血小板减少综合征(SFTS)开展病原检测,对其S基因进行测序,分析基因分型和系统发育特征。方法 采用荧光定量PCR法对6例疑似患者血清标本进行新型布尼亚病毒(SFTSV)核酸定性检测, RT-PCR扩增SFTSV S基因片段并测序。分析核苷酸同源性,构建系统进化树。结果 6例血清样本中,SFTSV核酸阳性5例。5例核苷酸高度同源,其中4例S片段基因核苷酸序列同源性100%,1例与其他4例间同源性为99.7%;最大相似株为江苏2014年分离株JS2014-06、2015年分离株JS2015-26,同源性100%。5例均聚集在C2亚型分支上。结论 聚集性疫情SFTSV基因型为C2型,与近年来国内分离株亲缘关系近。需加强监测和宣教,关注病毒的进化与变异。     

野生水鸟感染霍乱弧菌和沙门菌等病原菌的分离和鉴定

目的 从死亡的野生水鸟标本中分离、鉴定病原菌,评估迁徙鸟类传播人兽共患病原菌的风险。方法 采集的组织标本涂布营养琼脂平板,分别在需氧和厌氧的条件下培养。分离的菌株使用Phoenix100全自动微生物鉴定仪和16s rRNA测序的方法鉴定细菌种属,随后通过PCR的方法检测病原菌携带主要毒力基因的情况。结果 从骨顶鸡、鸬鹚和红嘴鸥等鸟类的组织标本中分离鉴定出霍乱弧菌、沙门菌和产气荚膜梭菌等多种肠道感染相关的病原细菌。霍乱弧菌经PCR鉴定不属于O1和O139血清群,无霍乱毒素和毒素相关菌毛的编码基因,但是有溶血素的编码基因。结论 检测的死亡鸟类个体存在多病原细菌的感染。     

新型洛菲不动杆菌的分离与鉴定

目的对从呼吸道感染的分泌物中分离的1株革兰阴性球杆样细菌进行研究,探讨其种系发生及分类学特征。方法利用形态、生理、生化特性等表型性状进行初步鉴定,通过细菌16S rRNA基因测序及基因比对明确其种系来源。结果分离菌为革兰阴性球杆状菌,生化反应不活泼,对环丙沙星耐药;BLAST序列比对显示该分离菌与洛菲不动杆菌的相似度为99.2%,与洛菲不动杆菌标准株不同的是在底物利用试验上有8项结果存在差异。结论根据表型性状和种系发生结果证实该菌为洛菲不动杆菌,鉴于该菌株与模式株在生化特性方面存在一定差异,初步考虑该菌株为洛菲不动杆菌的新亚型。     

Rapid identification of Cardiobacterium hominis by MALDI-TOF mass spectrometry during infective endocarditis

We report a new case of Cardiobacterium hominis endocarditis identified during an acute coronary syndrome. The positivity of the blood cultures was confirmed rapidly (50 h) as a result of improvements to the automated detection system, whereby it is no longer necessary to incubate the vials for long periods of time when Aggregatibacter-Cardiobacterium-Eikenella-Kingella infections is suspected. The phenotype-based VITEK 2 NH identification system is not able to distinguish between the two species of Cardiobacterium, as it does not contain C. valvarum in its library. The method for 16S rRNA gene sequence analysis is able to separate the two species but is not available in all laboratories. We used MALDI-TOF mass spectrometry, as an alternative, to rapidly distinguish between C. hominis and C. valvarum, because both species are contained in the system library.     

贵州省3株钩端螺旋体分离株PFGE分型与基因种鉴定

目的应用脉冲场电泳（PFGE）分型技术和16S rRNA基因测序分析技术分别对贵州省3株动物宿主钩 端螺旋体分离菌株进行分子分型和基因种鉴定,了解贵州省钩端螺旋体的分子流行病学特征。方法应用 DNA限制性内切酶Not I对钩端螺旋体染色体DNA酶切后,用PFGE将DNA片段分离,采用BionumericsV4.0将3 株钩体菌株PFGE图谱与中国15群15型参考菌株进行聚类分析;同时,应用PCR扩增几乎全长的钩体16S rRNA基因片段,并将扩增产物进行双向序列测定,并与GenBank数据库已注册的核酸序列进行同源性比对 、确定基因种、分析亲缘进化关系。结果来自贵州省的3株动物宿主分离钩体菌株PFGE带型命名为LepNot I 002和LepNot I 003,经聚类分析,3株菌株与黄疸出血群黄疸出血型赖株的相似性大于95%。16S rRNA 基因测序和分析表明,3株贵州分离钩体菌株之间的同源性为100%,与致病性钩体问号钩端螺旋体种（L. interrogans）不同血清型参考菌株的同源性达100%。结论3株贵州动物分离钩体菌株经PFGE分型鉴定与黄 疸出血群赖型赖株的相似性大于95%,经16S rRNA基因测序分析鉴定为L. interrogans种,上述两种方法 对贵州省钩体分离菌株的鉴定结果一致,有助于贵州省钩端螺旋体病的主动监测、暴发调查和传染源追踪 。     

Comparative study of MALDI-TOF MS and VITEK 2 in bacteria identification

Background

Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) has recently been introduced in diagnostic microbiology laboratories for the identification of bacterial and yeast strains isolated from clinical samples. This study aimed to evaluate the accuracy of MALDI-TOF MS in clinical microbiology diagnosis by comparing it with commonly-used VITEK 2 or gene sequencing.

Methods

The performances of MALDI-TOF MS and VITEK 2 were compared retrospectively for identifying routine isolates. Discrepancies were analyzed by gene sequencing analysis of the 16S genes.

Results

For 1,025 isolates, classified as 55 species of 25 genera, 1,021 (99.60%) isolates were accurately identified at the genus level, and 957 (93.37%) isolates at the species level by using MALDI-TOF MS. A total of 949 (92.59%) isolates were completely matched by both methods. Both methods found 76 unmatched isolates among which one strain had no definite identification by MALDI-TOF MS and VITEK 2 respectively. However, MALDI-TOF MS made no errors at the genus level while VITEK 2 made 6 (0.58%) errors at the genus level. At the species level, the identification error rates for MALDI-TOF MS and VITEK 2 were 5.56% and 6.24%, respectively.

Conclusions

With a lower identification error rate, MALDI-TOF MS has better performance than VITEK 2 in identifying bacteria found routinely in the clinical laboratory. It is a quick and cost-effective technique, and has the potential to replace conventional phenotype methods in identifying common bacterial isolates in clinical microbiology laboratories.     

某高级中学结核病爆发分离菌株的实验室鉴定

目的鉴定从某中学结核病爆发分离菌株的种属。方法对2006年5—8月,辽宁省某高级中学发生的10例痰检阳性病例中的3份痰标本分离的菌株经表型鉴定方法;传统生化方法;扩增hupB基因、dnaA-dnaN 和NTF-1区;Spoligotyping 以及MIRU基因分型;16S rRNA基因、16S-23S ITS和hsp65基因测序以及hsp65基因限制性酶切分析进行鉴定。结果临床分离株经生化方法初步鉴定1份为结核分枝杆菌复合群和2份为非结核分枝杆菌,随后经表型鉴定和扩增hupB基因、dnaA-dnaN 和NTF-1区;Spoligotyping 以及MIRU基因分型,说明属于结核分枝杆菌复合群的菌株为结核分枝杆菌北京基因型现代株,MIRU基因型为223325173533。经16S rRNA基因、16S-23S ITS和hsp65基因测序以及hsp65基因限制性酶切分析说明属于非结核分枝杆菌的菌株为猪分枝杆菌。结论本次从结核病爆发累及病人的标本中分离出结核分枝杆菌北京基因型现代株和猪分枝杆菌,猪分枝杆菌在暴发流行中的意义尚需进一步研究。     

应用16SrRNA基因序列分析技术鉴定临床非典型细菌的研究

目的将16SrRNA基因序列分析技术应用于传统方法鉴定可靠率低或无法鉴定细菌的分类鉴定，以提高临床诊断的准确性。方法以本院微生物实验室保存的5株标准菌株验证实验方法的准确性后，收集实验事常规方法不能鉴定或鉴定可靠性低的临床分离菌15株（包括革兰阳性球菌，革兰阳性杆菌及革兰阴性杆菌），提取DNA模板，以通用引物PCR扩增16SrRNA目的片段后测序，将测序结果在GenBank数据库中比对分析以确定菌种。结果15株实验细菌中有14株（占93．3％）鉴定到种，包括鼻疽诺卡菌，大肠埃希菌，阿尔莱特葡萄球菌，脆弱拟杆菌，弗氏柠檬酸杆菌，短小芽孢杆菌，河流漫游球菌，极小短小杆菌，伴放线凝聚杆菌，毗邻颗粒球菌；1株菌鉴定到属（占6．7％），归属于垃状杆菌属。结论16SrRNA基因序列分析技术具有准确、快速和方法简便的特点，适用于对临床非典型蔚、少见菌以及新型细菌的鉴定，可作为细菌常规鉴定手段的必要补充。     

MA120微生物鉴定/药敏分析系统在临床微生物鉴定与药物敏感性测定中的效果评价

目的评价国产微生物鉴定/药敏分析系统(MA120)在临床微生物鉴定和药物敏感性测定的效果。方法收集解放军第三〇二医院2013年1月—2014年12月间的临床分离株1803株,包括革兰阴性菌1205株及革兰阳性菌598株,共28个菌属,107个菌种,菌种经16S r DNA测序(测序)鉴定确认。用MA120进行细菌的鉴定与药敏检测,鉴定结果与测序确认结果比较,计算种的鉴定符合率;药敏结果与VITEK 2全自动细菌鉴定/药敏分析系统(VITEK 2)的药敏检测结果比较,计算耐药的符合率。结果 MA120鉴定革兰阴性菌19个菌属67个菌种1205株,与测序结果总体符合率为91.12%;鉴定革兰阳性菌9个菌属40个菌种598株,与测序结果总体符合率为94.31%。MA120药敏卡涵盖常见的抗生素,耐药率与VITEK2的符合率分别为:肠杆菌科89.54%,非发酵菌86.11%,葡萄球菌属94.74%,肠球菌属与链球菌属82.61%。结论 MA120在常见临床微生物的鉴定与药敏中的应用具有较好的效果,鉴定细菌种类涵盖临床常见的致病菌,且具有的药敏抗生素种类齐全,并可根据美国临床和实验室标准协会的建议及临床需求及时完善,应用灵活。     

Design of 16S rRNA gene primers for 454 pyrosequencing of the human foregut microbiome

AIM:To design and validate broad-range 16S rRNA primers for use in high throughput sequencing to classify bacteria isolated from the human foregut microbiome.METHODS:A foregut microbiome dataset was constructed using 16S rRNA gene sequences obtained from oral,esophageal,and gastric microbiomes produced by Sanger sequencing in previous studies represented by 219 bacterial species.Candidate primers evaluated were from the European rRNA database.To assess the effect of sequence length on accuracy of classifica...