杭州地区单核细胞增生李斯特菌食品分离株分子型别研究

目的研究杭州地区单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)食品分离株的分子分型情况,了解当地流行株的型别特征。方法用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)的方法对单核细胞增生李斯特菌进行分子分型。PFGE结果进行聚类分析,并绘制MLST数据的最小生成树。结果 6个血清型组成的133株杭州食品分离株共获得19个MLST型别,并发现1个新的ST型ST767。ST9和ST121是数量最多的型别。用AscI和ApaI酶切分别获得33和45个PFGE带型。结论杭州地区单核细胞增生李斯特菌食品分离株分子型别分布广泛,大部分菌株是可引起人李斯特菌病的Lineage I和Lineage II菌株。食品中单核细胞增生李斯特菌的污染比较严重,应加强监测与管理以防食源性疾病的发生。     

广东省猪链球菌2型菌株毒力基因及分子分型分析

目的 掌握广东地区猪链球菌2型菌株毒力因子及分子分型情况,为诊断、治疗和制定防控措施提供科学依据。方法 选取荚膜多糖(cps2J)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、溶血素(sly)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、胞外因子(ef)等5个猪链球菌2 型主要毒力基因,分别设计引物对分离自病人、病猪的22株猪链球菌2 型菌株进行PCR检测,并对菌株进行MLST分型分析。结果 22株菌分为5种毒力基因型,其中cps2J+/mrp+/sly+/gdh+/ef+型别为病人及病猪菌株所共有,cps2J+/mrp+/sly-/gdh-/ef+、cps2J+/mrp+/sly-/gdh+/ef+为病人菌株所特有,cps2J+/mrp-/sly+/gdh+/ef+、cps2J+/mrp-/sly-/gdh+/ef-为病猪菌株所特有;MLST分型结果显示,22株分为ST1、ST7和ST28三个型别,其中ST1、ST7型为病人和病猪菌株所共有,均同属于ST1克隆复合物,ST28型为病猪所特有。结论 广东地区病人、病猪的猪链球菌2 型菌株毒力基因型及MLST分子分型均呈现多样化,且部分型别为两者所共有,为阐明猪传染给人提供了直接的证据。     

北京市一些地区生肉标本中单增李斯特菌的分离及其分子流行病学特征分析

目的 了解北京市一些地区生肉中单增李斯特菌的污染情况及其分子流行病学特征。方法 采用北欧食品分析标准(NMKL)对北京市一些地区采集的340份牛、羊、猪、鸡和鸭生肉标本进行单增李斯特菌的分离鉴定,并对分离菌株进行血清学分型(Serotyping)、脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)分型及多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing, MLST)分析。结果 生肉标本中单增李斯特菌污染率为6.2%(21/340)。分离菌株含3种血清型(1/2a,1/2b和1/2c),以1/2c为优势血清型(占47.6%)。PFGE分析中,使用内切酶AscI酶切电泳将21株单增李斯特菌分为12个型别,可聚类为3个群。MLST分析将21株单增李斯特菌分为7个ST型,其中 ST9型最多(10株)。结论 北京市一些地区的生肉类食品中存在6.2%的单增李斯特菌污染率,这些单增李斯特菌以家系II菌株占据绝对优势(80.1%),其中1/2c型,GX6A16.CN0004和ST9型分别为血清型、PFGE带型以及MLST序列型的优势型别,与我国食源性单增李斯特菌的优势菌群特征一致。     

马鞍山市志贺菌福氏4c亚型毒力基因检测及分子分型研究

目的了解马鞍山市志贺菌福氏4 c(ShigellaF4c)分离株的毒力基因的流行模式及分子分型的特点,掌握Shi-gellaF4c在该市的流行状况。方法使用常规法进行菌株分离培养、使用全自动微生物鉴定系统进行生化鉴定,鉴定为志贺菌的阳性菌株使用PCR检测ShigellaF4c的ipa H、ial、set、sen四种毒力基因及应用PFGE进行分子分型。结果 ipa H、ial、set、sen四种毒力基因在76株ShigellaF4c的携带率分别为100%、97.4%、96.1%、90.8%,其中67株ShigellaF4c四种毒力基因全为阳性,占88.2%;本地区ShigellaF4c携带毒力基因模式分成五大类型,Ⅰ型是主要毒力基因模式。PFGE电泳条带图谱显示,ShigellaF4c中100%相同的菌株数较少;100%相同的都为同一年代,91%相同的菌株出现跨年度;不同年代分离株无完全相同基因型,地域方面没有明显联系。结论马鞍山地区S.F4c分离株携带ipa H、ial、set、sen四种毒力基因普遍存在,毒力强是本地区ShigellaF4c主要特征之一;ShigellaF4c在本地区无显著的流行迹象,属于散在发病。     

24株停乳链球菌似马亚种的分子鉴定和基因分型

目的 探讨停乳链球菌似马亚种(Streptococcus dysgalactiae subspecies equisimilis,SDSE)感染的临床分布特点及分子特征。方法 收集SDSE感染患者的临床资料及相应分离菌株,分离株经全自动微生物分析系统、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)及PCR扩增16S rRNA和链激酶前体基因等3种方-法进行鉴定。对SDSE菌株进行M蛋白基因(emm)分型和多位点序列分型(Multilocus sequence typing, MLST),并通过BioNumerics 6.6软件进行聚类分析。结果 24株停乳链球菌似马亚种主要分离自咽拭子、皮肤、血液,分别占58.33%、20.83%、8.33%;24株SDSE被分为5种emm类型,以stCNSRT2.0(n=16,66.7%)占优势,其次是stG840.0(n=3,12.5%)。通过MLST分型,共有6种ST型别,以ST44(n=17,70.8%)为主,ST605为新定义的ST型。结论 本研究中SDSE分离株具有分子多样性,ST605为首次报告的MLST型别。     

84株沙门菌耐药特征及分子分型结果分析

目的分析广东省第二人民医院2012-2014年临床常见沙门菌耐药特性及分子分型特征。方法对分离的84株沙门菌进行血清分型、药物敏感试验。选取不同菌株来源、血清型和耐药谱的51株沙门菌,按照美国PulseNet标准进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型。应用BioNumerics软件对电泳图谱进行分析,确定菌株间的相关性。结果84株菌分为20种血清型,沙门菌前3位血清型构成比从高到低分别为:鼠伤寒沙门菌占42.86%(36/84)、肠炎沙门菌占15.48%(13/84)、斯坦利沙门菌占8.33%(7/84)。本次分离沙门菌对头孢类抗生素敏感率达84.21%以上,对于环丙沙星与氯霉素的敏感性在66.67%以上,对于甲氧苄啶与庆大霉素的敏感性在50.88%以上,但仍存在多株多重耐药现象。51株沙门菌经过聚类分析可分为 42个PFGE型,表现为较大的遗传多样性。结论临床治疗时,应根据药敏试验结果指导临床,合理使用抗生素,以提高治疗效果。沙门菌耐药谱与 PFGE分型无明显关联。     

浙江省首例14型猪链球菌人源分离株鉴定及分子特征分析

目的 对浙江省首例14型猪链球菌菌株进行综合鉴定与分子分型特征研究。方法 对目标菌株进行镜检、生化、血清学玻片凝集试验、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI TOF MS)鉴定,同时利用聚合酶链(PCR)技术检测该菌株链球菌属(tuf)、猪链球菌种(16S rRNA)、猪链球菌血清型基因以及毒力基因,另采用脉冲场凝胶电泳技术(pulsed-fieId gel electrophoresis, PFGE)、多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)以及最小核心基因组群(minimum core genome groups, MCG群)方法分别对菌株进行分子分型检测。结果 传统细菌学方法和质谱鉴定技术以及核酸检测均将这株人源分离株鉴定为14型猪链球菌;25种毒力基因检测,除salKR与89K PAI基因检测为阴性,其它均为阳性;分子分型检测该菌株为高致病性ST1及MCG Group1型,PFGE检测结果表明此菌株同浙江省主要流行毒力株在同一主分支,相似性达94.95%。结论 本次检出14型人源猪链球菌强毒力株,属高致病基因型ST1/MCG G...     

无锡市腹泻病人沙门菌的病原学特征及分子分型研究

目的分析无锡市腹泻人群中分离的沙门菌的流行特征;同时比较主要血清型菌株间的脉冲场凝胶电泳(PFGE)带型差异,为沙门菌感染的防控提供实验数据。方法收集2015年无锡市腹泻病人的粪便标本,分别进行沙门菌的分离鉴定、药敏试验、血清型分型以及PFGE分型分析。结果 756份粪便标本中共分离到32株沙门菌,阳性率为4.23%;检出时间主要集中在5~10月份,感染人群以老年人为主。药敏试验说明无锡地区的沙门菌对氨苄西林的耐药率最高,达56.25%;对环丙沙星和头孢他啶的耐药率最低,均为6.25%。32株沙门菌共鉴定出11种血清型,以肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌为主,分别占31.25%和21.88%。对这2种血清型的沙门菌进行PFGE分析,显示肠炎沙门菌所有带型的相似度均在85%以上,鼠伤寒沙门菌的带型各不相同。结论无锡市沙门菌的感染具有明显季节和年龄分布差异性,流行的优势血清型为肠炎沙门菌。无锡市需同时加强对食品和环境中沙门菌的监测。     

海南地区类鼻疽伯克霍尔德菌PFGE分子分型及同源性分析

目的通过对海南地区类鼻疽伯克霍尔德菌分离株进行脉冲场电泳(PFGE)分子分型分析,探讨海南地区类鼻疽伯克霍尔德菌之间的同源性,了解海南地区类鼻疽流行和分布特征。方法对海南地区2006年7月~2013年4月临床分离的97株类鼻疽伯克霍尔德菌采用PFGE方法进行分子分型,用BioNumerics软件进行聚类分析和同源性比较。结果 97株类鼻疽伯克霍尔德菌分布于海南省18个市县中的14个市县,其中东方市所占比例最高,为17.5%;沿海地区占90.7%(88/97)。感染类型以败血症为主,占61.9%。分离菌的PFGE带型呈现多态性,相似性系数为67.8%。在85%相似度水平以上时,实验菌株分为20个PFGE基因型,其中PFGE12型所占比例最高,占29.8%(29/97),且在本型中有7株菌PFGE条带100%相似,占本型菌的24.1%(7/29)。分离菌中所占比例位于第二和第三的分别是PFGE-9(占18.5%)和PFGE-16型(占14.4%)。结论 PFGE分子分型可较好地对菌株进行同源性分析。海南地区流行的类鼻疽伯克霍尔德菌PFGE型别呈多态性,但存在一些克隆群优势流行。     

徐州地区小肠结肠炎耶尔森菌病原学初步研究

目的了解徐州地区小肠结肠炎耶尔森菌分布及病原学特征。方法对本地区分离到的菌株进行血清学分型、生化、药敏试验,并使用聚合酶链反应(PCR)技术检测毒力基因,同时对致病性血清型(O∶3和O∶9型)菌株进行脉冲场凝胶电泳分析。结果2014份标本中共检出32株(分布17个血清型)小肠结肠炎耶尔森菌,总检出率为1.59%。致病菌株占18.75%,携带ystB基因的占21.87%。32株小肠结肠炎耶尔森菌分为3个生物型别,其中1A型占78.12%,3型18.75%,2型为3.12%。本地区分离的3株O∶3血清型菌株的PFGE带型相同。结论该地区存在致病性小肠结肠炎耶尔森菌以及由此引起的腹泻疾病,尤其O∶3型菌株属于我国O∶3血清型小肠结肠炎耶尔森菌的主要克隆系,本地区应当进一步加强该菌的监测工作。     

2006-2017年四川省临床分离猪链球菌2型的病原学特征

目的 了解四川省2006-2017年临床分离猪链球菌2型的病原学特征。方法 对2006-2017年四川省临床分离的28株猪链球菌2型进行毒力基因检测、药物敏感性分析、脉冲场凝胶电泳分析(PFGE)。结果 28株猪链球菌2型分为2种毒力基因型,1株为cps2J+/mrp-/sly+/gapdh+/ef+型别,其余均为cps2J+/mrp+/sly+/gapdh+/ef+型别;药敏检测结果显示,28株猪链球菌对第三代、第四代头孢菌素类、碳青霉烯类、青霉素、左氧氟沙星、利奈唑胺、万古霉素、氯霉素、达托霉素均敏感,对四环素均耐药。28株猪链球菌中,仅2株对克林霉素、阿奇霉素、红霉素耐药,其余均敏感。PFGE分析结果显示,28株猪链球菌呈现6种PFGE图谱,相似性为76%,其中23株是完全相同的图谱,占82.14%;2006-2007年分离的19株菌呈现完全相同的PFGE图谱,2010年后分离的9株呈现出6种PFGE图谱。结论 2006-2017年四川省临床分离猪链球菌2型流行株的毒力基因型主要为高致病性cps2J+/mrp+/sly+/gapdh+/ef+型别,对β-内酰胺类药物敏感,2006、2007年不同市区临床分离的猪链球菌2型为统一来源,2010年后分离的菌株PFGE图谱相似度较低。     

贵州省一例人感染猪链球菌病例的病原学检测与分析

目的 对贵州省一疑似人感染猪链球菌病患者的血液来源菌株进行鉴定。方法 将患者血液分离菌株接种羊血琼脂平板,经革兰氏染色镜检、血清凝集试验和生化反应后,再用PCR技术检测猪链球菌种特异性基因(16S rRNA)和猪链球菌2型特有的荚膜多糖编码基因(cps2J)以及溶菌酶释放相关蛋白编码基因(mrp)、溶血素基因(sly)和细胞外蛋白因子编码基因(ef)。结果 传统方法和PCR技术将病例来源菌株鉴定为猪链球菌2型,PCR鉴定结果显示该菌株的毒力基因cps2J、mrp、sly和Ef均为阳性。结论 贵州省一例人感染猪链球菌疑似病例来源菌株为猪链球菌2型强毒株。     

猪链球菌基因芯片检测方法的研究

目的建立猪链球菌基因芯片检测方法,实现对猪链球菌种、致病血清型及毒力相关基因的同步检测和鉴定。方法根据GenBank中猪链球菌的相关序列,设计并合成探针,采用点样法制备芯片;检测样本基因组DNA标记后与基因芯片杂交,激光扫描检测信号。结果检测结果显示,针对猪链球菌种、主要致病血清型及主要毒力相关基因设计的寡核苷酸探针可特异地识别对应靶基因,重复性好;而针对不同菌株设计的株特异性探针未获得预期检测效果。结论初步建立猪链球菌基因芯片检测体系,敏感性与特异性高,对于高通量鉴定猪链球菌菌种及其毒力有重要价值。     

湖南省首例猪链球菌14型人源分离株鉴定及毒力基因分析

目的 了解湖南省首例猪链球菌14型菌株的生物学性状及病原学特征。方法 采集患者的关节液接种到血琼脂平板,进行猪链球菌的分离培养,通过镜检、生化和血清凝集试验确认后,用聚合酶链反应(PCR)检测猪链球菌种特异性基因(16S rRNA)、2型荚膜多糖基因(cps2J)、14型荚膜多糖基因(cps14J)以及相关毒力基因:溶菌酶释放相关蛋白(mrp)、溶血素(sly)、纤粘连蛋白结合蛋白(fbps)、胞外因子(ef)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、毒力相关序列orf2基因(orf2)和甘油醛一3一磷酸脱氢酶的编码基因(gapdh)。结果 患者的关节液中分离到猪链球菌14型菌株,种特异性基因16S rRNA阳性,荚膜多糖基因cps2J阴性、cps14J阳性,毒力基因mrp阴性,其余sly、fbps、ef、gdh、orf2、gapdh均为阳性。结论 湖南省已经出现了猪链球菌14型的流行,并携带多种毒力基因,需密切关注其流行趋势。     

Ⅱ型猪链球菌浙江分离株cps2J、ef、mrp基因的克隆及序列分析

目的阐明浙江省猪链球菌分离株的血清型分型,分析其与国内外其他猪链球菌Ⅱ型（SS2）菌株 cps2J、ef、mrp毒力基因的差异。方法参照GenBank上已发表的cps2J、ef、mrp毒力基因序列,设计引物 ,对6株浙江省猪链球菌分离株进行cps2J、ef、mrp全基因克隆及序列测定,并与国内外其他分离株的基 因序列进行比较。结果cps2J、ef、mrp基因的完整开放阅读框（ORF）分别为999bp、2532bp、3771bp,各 自编码333、843、1256个氨基酸。经对cps2J、ef、mrp毒力基因的序列比较与系统进化分析,6株浙江分 离株均分布在SS2发生群中,与国内外其他SS2菌株cps2J、ef、mrp基因核苷酸的同源性均较高,分别为 98.39%～100.0%、99.6%～100.0%和99.4%～100.0%,分离的年代和地区对基因的同源性和系统进化分支影 响不大。结论6株浙江省猪链球菌分离株为2型菌株,cps2J、ef、mrp基因序列非常保守,与GenBank上国 内及欧洲SS2菌株中相应序列有很高的同源性,可能有着相同的起源。     

1株9型猪链球菌全基因组分析北大核心CSCD

目的探索9型猪链球菌基因组功能及遗传关系。方法采用生物信息学方法对1株9型猪链球菌强毒株GD18的全基因组序列进行注释,并与GenBank上的15株猪链球菌进行比较基因组学分析。结果GD18菌株基因组全长2067661 bp,总蛋白1961个,注释到COG、GO、KEGG、CAZy和PHl-base数据库的基因分别占总蛋白的77.05%、71.29%、43.91%、4.49%和3.37%。毒力因子分析表明猪链球菌毒力因子的复杂以及并非所有的猪链球菌菌株都有一套通用的毒力因子。耐药基因分析表明GD18含多种类的耐药基因,且存在丰富的外排系统。蛋白预测结果显示GD18具有114个信号肽蛋白和30个分泌蛋白。16个菌株基因组比较分析发现共有的核心基因为1244个,非共有基因共1685个,特有基因共1417个。进化分析表明GD18与加拿大分离株89-3576-3亲缘关系最近,且国内菌株基本处在不同分支。结论对1株9型猪链球菌分离株的全基因组、基因功能、进化关系等进行分析,为9型猪链球菌基因组整体水平的研究奠定基础和提供数据支撑。     

猪链球菌2型中国强毒株05ZYH33 ofs基因敲除突变株构建及其生物学特性研究

目的探究猪链球菌血清浑浊因子ofs基因在强致病性2型猪链球菌致病过程中的作用。方法利用同源重组基因敲除方法构建中间为壮观霉素抗性基因,两侧为ofs编码基因上、下游同源序列的基因敲除质粒,将构建好的质粒电转化入猪链球菌感受态,同源重组筛选ofs基因敲除突变株,通过组合PCR、Southern杂交和DNA测序对疑似突变株进行验证。生物学功能实验研究比较ofs突变株和野生株05ZYH33在革兰氏染色、菌落溶血活性、生长速率和毒力等方面的差异。结果组合PCR、Southern杂交和DNA测序结果均证实ofs基因敲除突变株05ZYH33Δofs构建成功,体外实验结果显示ofs基因缺失后菌株在革兰氏染色和菌落溶血活性及形态、生长速率等方面未发生改变,但小鼠毒力实验数据结果表明敲除突变株Δofs的毒力降低。结论猪链球菌2型ofs基因与细菌的毒力相关,本实验构建的突变株05ZYH33Δofs为进一步研究猪链球菌2型的致病机理奠定基础。     

一株人血源猪链球菌的分离鉴定与毒力基因检测

目的对北京某医院就诊的一例疑似人感染猪链球菌病患者的血液来源菌株进行鉴定与毒力因子检测分析。方法将患者血液分离菌株接种哥伦比亚血琼脂平板,经革兰氏染色镜检、血清凝集试验、VITEK 2Compact微生物分析仪以及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测后,再用PCR技术检测猪链球菌种特异性基因(16S rRNA)和猪链球菌2型特异性荚膜多糖编码基因(cps2J)以及多个毒力基因:溶菌酶释放相关蛋白(mrp)、溶血素(sly)、细胞外蛋白因子(ef)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、纤粘连蛋白结合蛋白(fbps)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)的编码基因和毒力相关基因orf2。结果传统细菌鉴定方法和蛋白质谱技术以及核酸检测方法将这株患者血源性细菌分离株鉴定为猪链球菌2型,该菌株的毒力基因cps2J、sly、ef、gdh、fbps、gapdh和orf2的PCR检测均为阳性,mrp基因为阴性。结论该株人血源细菌分离株为猪链球菌2型sly+/ef+/mrp强毒株。     

gdh基因在猪链球菌中的分布及重组GDH的抗原性研究

目的了解谷氨酸脱氢酶基因(gdh)在不同血清型猪链球菌(S.suis)中的分布情况,分析重组谷氨酸脱氢酶(GDH)的抗原性,为其应用于S.suis感染诊断和疫苗研究提供实验数据。方法应用PCR方法检测不同血清型S.suis中的gdh;利用45 kD重组GDH制备多克隆抗体,Western blot方法分析S.suis各血清型菌株与多克隆抗体的反应以及实验感染S.suis2型的猪血清与重组GDH的反应情况。结果在S.suis35个血清型标准株中,除了22、26、27、29、32及34型以外,其余包括1、2、1/2、7、9和14型在内的29个血清型、61株国内外S.suis2型分离株全部扩增出目的条带。用重组GDH免疫小鼠,在小鼠血清中均检测到抗GDH的抗体;Western blot结果显示,全部被检菌株与抗GDH血清反应均有单一特异性反应条带,6份实验感染猪血清均能与重组GDH产生反应条带。结论重组GDH具有免疫原性和反应原性,该蛋白有可能作为建立诊断试验的候选抗原,为进一步开展相关的血清学诊断方法和疫苗研究奠定基础。