RseA基因影响耻垢分枝杆菌药物敏感性的生物信息学分析与初步验证

目的 筛选RseA在耻垢分枝杆菌中可能调控药物敏感性的基因或通路,并进行初步验证。方法 利用分子克隆技术构建RseA基因过表达耻垢分枝杆菌组和空质粒对照组;利用转录组测序技术和生物信息学方法筛选2组细菌间的差异表达基因(DEGs),分析其基因本体论(GO)及京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集情况;并构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络。利用结核分枝杆菌复苏促进因子E(RpfE)促使非复制持留菌复苏,测定复苏指数(RI)对筛选出的关键靶向基因或通路进行初步验证。结果 RseA基因过表达后,筛选出2 403个DEGs,其中2 335个表达上调,68个表达下调。GO分析结果表明,DEGs主要参与氮化合物代谢过程的调控、RNA代谢过程的调控、转录因子活性和序列特异性DNA结合过程调控等。KEGG分析结果显示,DEGs主要参与萜类骨架的生物合成、果糖和甘露糖代谢和同源重组等通路。从PPI网络MCODE模块中筛选出前8个hub基因rpsG、rplM、rpsO、rpsT、rpmH、rplS、rpsJ、rplT,并从这些基因的分析结果得知,其主要参与了核糖体通路。使用RpfE促进复苏后,RseA组复苏指数明显低于对照组。 RseA调控了多个靶向基因,参与核糖体的结构组成和核糖体通路,增强耻垢分枝杆菌对抗结核药物的敏感性,为进一步的机制研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv2333c在巨噬细胞内功能的初步研究

目的:在耻垢分枝杆菌内过表达结核分枝杆菌Rv2333c,探究结核分枝杆菌Rv2333c在细菌侵染巨噬细胞过程中所发挥的功能。方法:构建表达Rv2333c基因的重组质粒pSUM-MCS2-Rv2333c,进而得到过表达Rv2333c的耻垢分枝杆菌菌株；用空载菌株(Ms＿Vec)和过表达菌株(Ms＿Rv2333c)感染巨噬细胞，并在不同时间点收集样品。随后进行细菌胞内存活实验，检测乳酸脱氢酶(LDH)含量以分析Rv2333c对巨噬细胞毒性的影响；之后通过提取细胞样品的RNA、上清培养液和细胞沉淀裂解物，利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和蛋白免疫印迹(Western blotting)等技术检测Rv2333c对巨噬细胞内相关细胞因子的分泌，以及核因子激活B细胞的κ-轻链增强(NF-κB)和磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)等通路的影响。结果:实验成功构建了Rv2333c表达载体，并获得过表达Rv2333c的重组耻垢分枝杆菌。Ms＿Rv2333c菌株感染巨噬细胞后，细胞毒性检测LDH结果显示：Rv2333c在侵染巨噬细胞早期(6 h)即对...     

猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建及其表达

目的构建猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗,分析猪带绦虫TSOL18基因在重组耻垢分枝杆菌中的表达情况。方法采用PCR方法从重组质粒pGEX-TSOL18中扩增TSOL18基因,克隆入pMV361载体,构建pMV361-TSOL18穿梭质粒,经酶切和测序鉴定后电穿孔法转化入耻垢分枝杆菌,进行单克隆菌落筛选及PCR鉴定。构建的猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗经热诱导后,以SDS-PAGE分析及Western blot分析TSOL18基因在重组耻垢分枝杆菌中的表达情况。结果成功扩增出TSOL18目的基因,大小约为393 bp,与预期值相符;经酶切验证,pMV361-TSOL18穿梭质粒构建成功;PCR鉴定猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗构建成功。SDS-PAGE电泳检测重组菌表达的目的蛋白TSOL18,相对分子质量为15×10~3与预期相符;Western blot分析该蛋白能被TSOL18兔抗血清识别。结论成功构建了猪带绦虫TSOL18重组耻垢分枝杆菌疫苗,猪带绦虫TSOL18基因在耻垢分枝杆菌中成功表达,表达蛋白具有反应原性,其免疫原性有待进一步研究。     

转录组测序分析FOXD3基因对胃癌细胞调控的分子机制

目的探讨FOXD3在胃癌细胞中可能调控的基因,阐明其在胃癌发生、发展过程中的可能机制。方法通过慢病毒感染技术建立FOXD3基因过表达MKN45细胞系及对照组MKN45细胞系,利用转录组测序技术检测两组细胞的基因表达谱,通过生物信息学方法比较两组细胞间的差异表达基因(DEGs),分析DEGs的基因本体论(GO)功能富集及京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集情况,并构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络。结果 FOXD3基因过表达后,筛选出586个DEGs,其中343个DEGs表达上调,243个DEGs表达下调。GO功能富集结果显示,DEGs主要参与正向调控RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、双向调控细胞增殖、细胞黏附、炎症反应等生物学过程。KEGG通路主要富集在PI3K-Akt信号通路、肿瘤相关通路、焦点粘连等。从PPI网络中筛选出前10个靶向基因AGT、BDKRB2、NMUR2、SAA1、CHRM1、ADRA1B、CXCL1、CXCR4、CXCL8、GNAI1,并揭示这些基因参与了G蛋白偶联受体信号通路、神经活性配体-受体相互作用、钙离子信号通路、趋化因子信号通路等重要途径。结论本研究一定程度上揭示了FOXD3基因可介导多个靶向基因,影响多条通路及生物学过程参与胃癌的发生、发展的可能分子机制,但仍需进一步进行研究验证。     

猪囊尾蚴特异性抗原cC1重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建与鉴定

目的 目的 构建表达猪囊尾蚴cC1抗原的重组耻垢分枝杆菌疫苗。方法 方法 提取pET28a?cC1质粒DNA, 用xho I和 BamH I双酶切, 用Klenow酶补平xho I酶切末端, 同时提取pMV261穿梭质粒载体, 用Hind III和BamH I双酶切, 用Klenow 酶补平Hind III酶切末端, 纯化后的酶切产物通过T4连接酶连接, 构建pMV261?cC1穿梭质粒, 测序验证正确后, 将 pMV261cC1穿梭质粒经电穿孔法转化耻垢分枝杆菌, 构建重组耻垢分枝杆菌, 经热诱导后, 以猪囊尾蚴病患者血清为一抗 进行Western?blotting鉴定。此外, 比较正常耻垢分枝杆菌和重组cC1耻垢分枝杆菌生长状态并绘制生长曲线。结果 结果 构 建的重组穿梭载体经酶切、 测序验证正确。构建的重组耻垢分枝杆菌经热诱导后, SDS?PAGE电泳分析显示, 在40 kDa处 有外源性蛋白表达, 与预期值相符。Western?blotting显示其可被猪囊尾蚴病患者血清识别, 表明cC1抗原基因在耻垢分枝 杆菌中表达成功。重组耻垢分枝杆菌与正常耻垢分枝杆菌的增殖特性无明显差异。结论 结论 成功构建了表达猪囊尾蚴特 异性抗原cC1的重组耻垢分枝杆菌疫苗。     

结核分枝杆菌肝素结合血凝素与人IL12融合基因重组耻垢分枝杆菌的构建及鉴定

目的构建表达肝素结合血凝素与人IL12融合基因的重组耻垢分枝杆菌并对其进行鉴定。方法通过RT-PCR从人淋巴细胞获得hIL12基因模板,采用PCR技术克隆hIL12的P40和P35两个亚基及结核分枝杆菌的HBHA基因,通过酶切鉴定及DNA测序证实连接的基因片段均正确后,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pSMT3-HBHA-hIL12,并用电穿孔法将重组质粒转到耻垢分枝杆菌中。分别用HBHA单克隆抗体和hIL12多克隆抗体检测HBHA和hIL12蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达,并测定重组耻垢分枝杆菌生长状态的改变。结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,通过HBHA单抗和hIL12多抗进行免疫荧光法检测证实HBHA和hIL12均有表达,并且重组的耻垢分枝杆菌的生长速度比正常组有较大的提高。结论成功构建了表达结核分枝杆菌HBHA基因和人IL12的重组耻垢分枝杆菌,为构建一种结核病的候选疫苗提供了实验基础。     

Sigma E基因对耻垢分枝杆菌五种药物敏感性的影响及机制研究

目的 探讨Sigma E (sigma factor E,SigE)基因影响耻垢分枝杆菌对5种药物的敏感性及其作用机制研究。方法 PCR法扩增出耻垢分枝杆菌sigE基因,克隆入质粒pMV261构建重组pMV261-SigE质粒,测序验证。重组质粒电转入耻垢分枝杆菌,Western blot检测SigE的表达。设立含空质粒转化菌为对照组,采用刃天青作为指示剂的微量滴定板法和菌落计数法检测pMV261-SigE重组耻垢分枝杆菌对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、左氧氟沙星和环丙沙星5种抗结核药物的敏感性。采用相应抗生素处理重组耻垢分枝杆菌48 h诱导细菌进入非复制持留状态,随后在含20 ng/mL的结核分枝杆菌复苏促进因子E (resuscitation-promoting factor E, RpfE)的7H9中静置培养2周,计数最大可能数和细菌生长数,测算复苏指数来了解SigE对药物敏感性的影响机制。结果 成功构建pMV261-SigE,经测序鉴定序列正确,Western blot检测到SigE在耻垢分枝杆菌中表达。与对照组相比,表达SigE重组耻垢分枝杆菌组对异烟肼、利福平等5种药物的相对荧光百分比高,敏感性下降。5组抗生素中,异烟肼、乙胺丁醇两种药物作用后pMV261-SigE重组耻垢分枝杆菌复苏指数明显高于对照组。结论 SigE可通过促进耻垢分枝杆菌进入持留状态影响异烟肼和乙胺丁醇作用的敏感性。     

重组耻垢分枝杆菌Msmc^2-CFP10-ESAT6的构建

目的构建能表达结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP10-ESAT6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌。方法采用基因拼接（Gene SOEing）法体外扩增结核杆菌1hp-ESAT6融合基因,插入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pB-CG3000,构建重组穿梭表达质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,电转化耻垢分枝杆菌mc2155,构建耻垢疫苗株Msmc2155-CFP10-ESAT6,热诱导表达CFP10-ESAT6融合蛋白,Western blot分析其免疫原性。结果经PCR、酶切及测序鉴定,证实成功构建重组质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,并在耻垢分枝杆菌中经热诱导表达出分子质量单位约为22 ku的CFP10-ESAT6蛋白,该蛋白可被结核病患者血清、鼠抗ESAT6血清和鼠抗CFP10血清识别。结论结核分枝杆菌lhp-ESAT6融合基因在耻垢分枝杆菌中成功表达。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增结核杆菌ESAT-6基因,并构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-ESAT-6和重组耻垢分枝杆菌。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增结核杆菌ESAT-6基因,克隆入pGEMT载体。然后,构建亚克隆ps3000-ESAT-6大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒,经电转化方法,将ESAT-6基因的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌(Mycobacteri-umsmegmatis mc~2155)中,热诱导此重组耻垢分枝杆菌,用SDS-PAGE电泳观察ESAT-6蛋白的表达,Western blotting鉴定其生物学活性。结果成功扩增了结核杆菌ESAT-6基因;正确构建穿梭质粒ps3000-ESAT-6,用pET表达系统ESAT-6纯化蛋白免疫小鼠的多抗血清通过Western blot证实了该重组耻垢杆菌中有表达并具有生物学活性。结论ESAT-6重组耻垢分枝杆菌构建成功,为下一步表达ESAT-6蛋白的重组BCG(BacilliCalmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Ag85B基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增结核杆菌Ag85B基因,构建大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-Ag85B,并重组耻垢分枝杆菌(Mycobacteriums megmatis mc2155)。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增结核杆菌Ag85B基因,克隆入pGEMT载体;构建亚克隆ps3000-Ag85B大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒,电转化方法将有Ag85B基因的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌中。热诱导此重组耻垢分枝杆菌,用SDS-PAGE电泳观察Ag85B蛋白的表达,Western blot鉴定其生物学活性。结果PCR扩增结核杆菌Ag85B基因片段大小为990bp,构建的穿梭质粒ps3000-Ag85B酶切片段为990bp,与理论值相符。经Western blot检测,该重组耻垢杆菌表达蛋白能被结核病患者血清识别。结论Ag85B重组耻垢分枝杆菌构建成功,为下一步表达Ag85B蛋白的重组BCG(Bacilli Calmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。     

Analysis of susceptibility genes and myocardial infarction risk correlation of ischemic cardiomyopathy based on bioinformatics

BackgroundThe present study was to investigated differential expressed genes (GEGs) in ischemic cardiomyopathy (ICM), and to construct regulation networks, and to study the correlation between myocardial infarction risk.MethodsData sets were downloaded from the Gene Expression Omnibus (GEO) to screen out messenger RNA (mRNA) and long non-coding RNA (lncRNA) differentially expressed between ICM samples and normal samples. Gene Ontology (GO) function analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analysis were performed. Differentially expressed mRNA and lncRNA were analyzed, and bioinformatics methods were used to predict and analyze microRNA (miRNA), and a competing endogenous RNA (Hub gene) regulatory network was constructed. Using the Limma software package in R language, DEGs of ICM were screened with non-heart failure donors as the control group under the conditions that the differential expression ratio was not less than 2 times, and the corrected P value was <0.05. The ClusterProfiler software package was used for GO enrichment analysis and KEGG enrichment analysis. The Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) 11.0 online database was used to screen key genes for protein-protein interaction (PPI) network analysis.ResultsThe GO function analysis and KEGG pathway analysis showed that the DEGs were significantly enriched in metabolic pathways, oxidative phosphorylation, extracellular matrix receptor interactions, and other pathways, and were closely related to fibrosis, collagen catabolic process, and inflammatory response function, and a Hub gene regulatory network related to ICM lncRNA was constructed. Bioinformatics methods were used to effectively analyze the DEGs of ICM, and the Hub gene regulatory network of ICM was successfully constructed.ConclusionsThis study identified a certain risk correlation between ICM susceptibility genes and myocardial infarction.     

乙型肝炎病毒相关肝细胞癌核心差异表达基因生物信息学分析

目的 探索与乙型肝炎病毒（HBV）相关肝细胞癌（HCC）发生发展相关的核心基因,为进一步揭示HBV相关HCC发病机制提供参考。方法 从高通量基因表达数据库（GEO）中下载GSE55092、GSE121248两个数据集,采用R语言筛选HCC组织和癌旁组织间差异表达基因（DEGs）,并绘制可视化火山图。对DEGs基因进行基因本体论（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析,构建蛋白质相互作用（PPI）网络,并用Cytoscape 3.9.0开源平台中分子复合物检测（MCODE）和cytoHubba插件筛选核心DEGs。利用UALCAN和Kaplan Meier-plotter数据库中临床样本数据对筛选出的核心DEGs进行差异表达和生存分析验证。结果 从GSE55092数据集和GSE121248数据集中分别筛选出1 148个和686个DEGs,其中下调表达基因分别为703个和477个、上调表达基因分别为445个和209个;两个数据集共筛选出557个共同表达的DEGs,其中下调表达基因384个、上调表达基因173个。GO富集分析显示,DEGs主要参与细胞分裂、细胞增殖、氧化还原、免...     

DGKZ基因沉默条件下人骨肉瘤细胞芯片的生物信息学分析

目的基于生物信息学方法分析二酰甘油激酶ζ(diacylglycerol kinase zeta,DGKZ)基因沉默的人骨肉瘤细胞芯片并探寻其分子机制。方法从GEO数据库中获取人骨肉瘤细胞芯片,在R软件中筛选DGKZ沉默处理组与对照组的差异基因(differential expression genes,DEGs);DEGs提交至DAVID数据库进行基因功能与通路富集分析;利用STRING数据库和Cytoscape软件构建蛋白互作网络,寻找网络结构中的核心基因并预测其转录因子。结果共筛选出368个DEGs,其中包含105个上调的基因与263个下调的基因。GO富集分析结果表明DEGs主要富集的生物学过程有成骨细胞分化的负调控、血管生成、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的负调控、脂肪细胞分化的正调控、细胞周期和Wnt信号通路;KEGG通路富集分析结果表明DEGs主要涉及的通路有TGF-β信号转导通路、癌症通路、胰腺癌、致癌病毒、MAPK信号转导通路以及代谢通路。经STRING数据库与Cytoscape软件找出度值前10的核心基因有SIRT1、EP300、PTGS2、BMP2、HIF1A、RB1、HIST1H2BO、NT5E、H1F0、HIST1H2AC,核心基因通过iRegulon插件预测的转录因子中标准化富集分数最高的是YY1。结论在DGKZ基因沉默条件下,转录因子YY1及相关靶基因能在骨肉瘤中发挥重要作用。     

弓形虫急性感染小鼠肺组织的转录组分析

目的 本研究旨在了解弓形虫感染小鼠肺组织转录组的变化.方法 取感染和未感染弓形虫的小鼠肺组织提取总RNA并制备cDNA文库,采用BGISEQ-500测序平台对文库进行高通量转录组测序.从测序结果中筛选差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),并随机筛选 10个差异表达基因利...     

综合基因表达谱分析与人类肝胰岛素抵抗相关蛋白分子表达研究*

目的 分析糖尿病患者与正常人肝组织之间的差异表达基因（DEGs）,筛选出肝组织中与可能产生胰岛素抵抗相关作用的蛋白分子。方法 从GEO数据库下载基因芯片数据集GSE23343（包括10例2型糖尿病和7例正常人肝组织的基因表达值）,通过DEGs表达谱分析和功能通路富集分析,构建DEGs对应的蛋白质-蛋白质相互作用网络。结果 分析得到928个显著上调的DEGs（P<0.01）,发现DEGs主要富集在细胞和代谢生物过程中,KEGG通路富集显示DEGs主要集中于信号转导和肿瘤相关通路。经蛋白质相互作用网络构建,筛选出5个关键蛋白分子MDM2、PCNA、CAV1、PIK3R1、NR3C1。结论 系统地筛选出人类肝组织中可能与胰岛素抵抗形成相关的蛋白分子,为进一步实验研究肝胰岛素抵抗产生机制和新的降血糖药物作用靶点提供基础。     

慢性日本血吸虫病肝纤维化差异表达基因的生物信息学分析

目的 筛选慢性日本血吸虫病肝纤维化差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）,并对其功能进行分析。方法 从基因表达综合（Gene Expression Omnibus, GEO）数据库下载慢性日本血吸虫病肝纤维化患者测序表达谱数据集,利用R语言进行DEGs筛选,对其生物学功能进行基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析并构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction,PPI）网络,以筛选关键基因。结果 共鉴定出62个DEGs,其中12个下调表达基因、50个上调表达基因。GO富集分析显示,DEGs主要富集在脂肪酸、硫化合物、酰基辅酶A、硫酯代谢等116种生物学过程,线粒体基质、线粒体外膜、细胞器外膜等19种细胞组分及胰岛素样生长因子结合、氧化还原酶活性等7种分子功能。KEGG通路富集分析显示,DEGs与磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶（phosphatidylinos...     

Identification of differentially expressed miRNAs and key genes involved in the progression of alcoholic fatty liver disease using rat models

BackgroundAlcoholic fatty liver disease (AFLD) is a liver disease caused by prolonged heavy drinking and has a poor prognosis in the clinic. This study aimed to explore the differential miRNAs expression profiles in the AFLD rat model.MethodsThe rat model of AFLD was established by ethanol intragastric administration and was used to explore the differential miRNAs expression profiles. We further analyzed the potential target mRNAs using the bioinformatics technique. GO and KEGG pathway enrichment analyses were carried out to better understand the biological function of differential expression genes (DEGs). We used the human Gene Expression Omnibus (GEO) dataset GSE28619 to further screen the key differentially expressed genes. The integration between the differentially expressed genes from the AFLD model and GEO was conducted and the key genes were identified.ResultsThe serum ALT, AST, TG, and TC levels in the AFLD model group were significantly higher than those in the normal control group. There are 45 miRNAs with significant changes including 26 upregulated and 19 down-regulated miRNAs. GO and KEGG enrichment showed various metabolic processes and signaling pathways were enriched in the progression of AFLD. After integrating the results of GSE28619 and DEGs, we observed that there are 12 genes with significant changes in two data sets, including PSAT1, TKFC, PTTG1, LCN2, CXCL1, NR4A1, RGS1, VCAN, FOS, CXCL10, ATF3, and CYP1A1.ConclusionAFLD showed differentially expressed miRNAs, which may be involved in the occurrence and progression of AFLD. Meanwhile, some signal metabolic pathways may be related to the pathogenesis of AFLD.