云南家鼠鼠疫疫源地人群和指示动物血清鼠疫F1抗体调查

目的 了解云南省家鼠鼠疫疫源地静息期人和指示动物血清鼠疫F1抗体情况,分析鼠疫发生和流行的风险。方法 2019年7——8月,课题组选择云南省家鼠鼠疫疫源地弥勒市、芒市和梁河县作为研究区域,对8个曾经报告2次及以上鼠疫的自然村和8个从未报告鼠疫的自然村的人群及指示动物进行血清采集,每个自然村采集人血清不少于20份,指示动物血清不少于10份。用间接血凝法检测鼠疫F1抗体,并用上转发光法对阳性样本进行再次检测确认。结果 368份人血清中仅有1份鼠疫F1抗体阳性,307份犬血清和12份猫血清鼠疫F1抗体均为阴性。结论 云南家鼠鼠疫疫源地人群鼠疫F1抗体阳性率非常低,但鼠疫F1抗体阳性的自然村需要加强鼠疫监测。指示动物未检测出鼠疫F1抗体,当地发生鼠疫的风险不高。     

基于OMP18的B细胞抗原表位的空肠弯曲菌ELISA检测方法的建立

目的 以OMP18的B细胞抗原表位多肽为包被抗原,建立检测空肠弯曲菌感染的ELISA方法。方法 以不同浓度梯度(0.1,1,10 μg/mL)OMP18的B细胞抗原表位多肽进行包被,以空肠弯曲菌全菌兔抗IgG为一抗,HRP标记的羊抗兔抗体IgG为二抗,检测对原浓度1 mg/mL的不同稀释度(1:10,1:100,1:1 000)抗体IgG水平。分别以空肠弯曲菌感染兔血清、健康兔血清及沙门菌感染兔血清为一抗,1:3 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG为二抗,比较各抗原表位多肽的免疫特异性。结果 OMP18的B细胞抗原3个表位多肽在稀释度在1:1 000、1:4 000、1:16 000、1:64 000时免疫反应性均有明显增高。其中稀释度在1:1 000时增高最明显。OMP18的B细胞抗原表位多肽具有免疫特异性。结论 用OMP18的B细胞抗原表位多肽作为包被抗原对空肠弯曲菌感染的血清进行ELISA检测,免疫反应性高,具有免疫特异性。     

表达鼠疫菌F1抗原的重组芽孢的制备及口服免疫效果观察

目的 利用枯草杆菌芽孢展示外源蛋白的呈递技术,研究表面展示鼠疫菌保守抗原F1蛋白的重组芽孢,分析评价重组芽孢的免疫原性。方法 将枯草杆菌CotB基因构建到pDG1664质粒,再将鼠疫菌保守序列F1蛋白编码基因连接到CotB基因的下游,构建成重组质粒。然后将外源基因CotB-F1同源重组整合到PY-79枯草杆菌基因组中。经PCR、Western Blot方法鉴定重组芽孢中鼠疫F1蛋白的表达。用上述重组芽孢以无佐剂口服方式免疫小鼠。采用ELISA方法检测重组芽孢免疫小鼠的免疫效果。结果 本研究制备出表面表达CotB-F1融合蛋白的重组枯草杆菌芽孢。用重组芽孢和野生型芽孢口服免疫BALB/c小鼠。实验结果表明,重组芽孢免疫组产生了针对鼠疫F1抗原的特异性抗体。重组芽孢免疫小鼠能产生有效的免疫应答。结论 本研究制备出表面展示鼠疫F1蛋白的枯草杆菌芽孢,建立了枯草杆菌芽孢呈递技术方法,为发展口服鼠疫疫苗奠定了基础。     

布鲁氏菌病快速检测试纸条的探索

目的 建立一种操作简单、结果肉眼可视,并具有良好敏感性和特异性的适合现场快速检测布鲁氏菌病的胶体金层析方法。方法 将重组的布鲁氏菌外膜蛋白OMP22和OMP28作为胶体金标记物,抗OMP22单克隆抗体作为质控线,OMP22和OMP28蛋白作为检测线组装试纸条。结果 该试纸条检测牛布鲁氏菌标准阳性血清最大稀释度可达1:128;并且与牛结核、蓝舌病、牛病毒性腹泻、口蹄疫、牛白血病及小反刍兽疫血清无交叉反应;检测牛、羊源血清样品结果与商品化的ELISA检测试剂盒(IDEXX)符合率为95%,与虎红平板凝集试验(RBPT)检测的符合率为97.4%。结论 胶体金层析试纸条在检测布鲁氏菌病方面具有快速、敏感性高及特异性强的特点,适用于布鲁氏菌病动态流行病学调查和临床快速筛查。     

量子点标记免疫层析技术检测布鲁氏菌病的方法研究

目的 通过研究量子点标记免疫层析技术检测布鲁氏菌病抗体,制备量子点免疫层析试纸条,验证快速检测布鲁氏菌病的可行性。方法 将蛋白A和布鲁氏菌全菌蛋白分别作为质控线和检测线喷涂在硝酸纤维素膜上,以量子点标记布鲁氏菌全菌蛋白,稀释后喷涂在玻璃纤维素膜上,最后进行组装、切割制成检测用试纸条。应用该试纸条检测布鲁氏菌病患者样本102例,健康人血清47例,以试管凝集试验为对照,比较两组方法的符合率。结果 建立的量子点免疫层析试纸条性能较好,布鲁氏菌病抗体的检测敏感性为99.0%,特异度为95.8%,两者符合率为98.0%;将阳性血清稀释至128倍,通过荧光检测仪仍可检测到T线荧光值,该纸条重复性好,储存时间30 d内稳定性较好,其变异系数为4.1%。结论 该方法操作简单、快速稳定、灵敏度高、成本低,15 min内完成检测,血清用量低,可实现现场快速检测,在布鲁氏菌病的早期检测中具有良好前景。     

检测鼠疫抗体胶体金免疫层析试纸条的研制

目的建立快速、简易的检测鼠疫F1抗体的胶体金免疫层析法(G ICA)。方法(1)采用胶体金颗粒标记纯化F1抗原,并将标记物喷于玻璃纤维;同时将纯化F1抗原喷线固定于硝酸纤维素膜上,用于F1抗体的捕捉;按常规组装成检测鼠疫抗体免疫层析试纸条。(2)采用该试纸条与血凝法对同一份兔抗F1抗体进行检测,以评价该试纸条的敏感性。(3)采用该试纸条对44株非鼠疫菌的免疫鼠血清进行检测,以评价该试纸条的特异性。(4)采用该试纸条、血凝法及ELISA对607份血清标本进行检测,以评价该试纸条对现场材料的检测效果。结果(1)该试纸条可在15 m in之内完成检测;(2)在敏感性上,该试纸条对同一份免疫兔血清的检测较血凝法高一个滴度;(3)对被试的44株所选菌株的免疫鼠血清的检测均为阴性;(4)在对607份血清标本的检测中,免疫层析试纸条、血凝及ELISA三种方法的符合率中度,而免疫层析试纸条的敏感性分别比血凝与ELISA高111%和90%。结论以纯化的鼠疫F1抗原为基础建立的G ICA检测鼠疫F1抗体的方法特异性强、灵敏度高、简便快速,无需特殊仪器设备,有较大的推广应用价值。     

胶体金免疫层析法快速检测鼠疫耶尔森菌F1抗体

目的建立检测鼠疫耶尔森菌F1抗体的胶体金标记免疫层析方法。方法胶体金标记纯化鼠疫F1抗原,双抗原夹心法原理制成免疫层析检测试纸条,并对兔、羊、人和黄鼠血清进行检测评价。结果用80份不同动物种属的阴性血清进行检测,未出现非特异性反应,对5份恢复期病人血清、13份免疫兔血清和2份免疫羊血清检测也取得阳性结果,对于8份I HA临界阳性(滴度1∶20)的达乌尔黄鼠血清检出阳性6份。结论建立了可以用于现场快速检测鼠疫F1抗体的胶体金免疫层析方法。     

鼠疫耶尔森菌小肽基因sORF34缺失株毒力及短期免疫保护效果评价

目的 探索小肽基因34(sORF34)缺失对鼠疫耶尔森菌毒力影响,并评价sORF34缺失株免疫保护活性。方法 基于鼠疫耶尔森菌201株和鼠疫耶尔森菌EV76疫苗株利用λ-Red一步法构建小肽基因缺失株。比较鼠疫小肽基因缺失株和亲本株之间的毒力差别,并采用皮下免疫方式对小鼠进行免疫,与EV76疫苗株比较,评价体液免疫、保护率等方面的差异。结果 PCR扩增结果证实,小肽基因缺失株构建成功。通过皮下LD₅₀测定、生存曲线测定,表明小肽基因缺失株较亲本株毒力下降。鼠疫201ΔsORF34和EV76ΔsORF34皮下免疫后可刺激机体产生抗F1-IgG,其中鼠疫201ΔsORF34免疫组抗体滴度与EV76疫苗株免疫组差异无统计学意义(P>0.05),EV76ΔsORF34免疫组较EV76疫苗株免疫组抗体滴度低;鼠疫EV76ΔsORF34株可刺激机体产生低滴度抗LcrV-IgG,而EV76和201ΔsORF34株不能刺激机体产生抗LcrV-IgG。初免后42 d使用致死剂量鼠疫201株进行皮下攻毒和滴鼻攻毒,3组保护率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 小肽基因缺失株经皮下途径感染BALB/c小鼠的毒力下降,鼠疫EV76ΔsORF34株较EV76疫苗株残存毒力进一步下降,但保护率差异无统计学意义(P>0.05),EV76ΔsORF34株有作为鼠疫减毒活疫苗候选株的潜力。     

双抗原夹心ELISA法检测登革病毒感染患者血清中的EDⅢ抗体

目的 建立一种检测登革病毒(dengue virus, DENV)特异性抗体的双抗原夹心ELISA方法?方法 利用毕赤酵母系统表达4个血清型登革病毒包膜蛋白Ⅲ区(envelope protein domain Ⅲ, EDⅢ),并采用改良过碘酸钠法对EDⅢ蛋白标记辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP),建立一种可同时检测4个血清型登革病毒EDⅢ蛋白特异性抗体的双抗原夹心ELISA法?并对2014年广州珠江医院门诊和住院确诊的登革热患者血清标本进行检测,并与澳洲Panbio MAC ELISA检测的敏感性进行比较?结果 本研究成功建立了一种检测4个血清型登革病毒EDⅢ蛋白特异性抗体的双抗原夹心ELISA法,该方法能同时检测到4个血清型登革病毒EDⅢ蛋白免疫的小鼠血清和Ⅰ型登革病毒EDⅢ蛋白免疫的兔血清,而与烟曲霉AF-MP蛋白免疫的小鼠血清和兔血清均无交叉反应?对184份健康人血清标本检测全为阴性,而对168份确诊为登革病毒感染患者血清标本检测结果表明,两种诊断方法检测结果差异无统计学意义,P<0.001(57.1% vs 57.7%),联合NS1抗原检测方法,其敏感性提高到97.6%?结论 双抗原夹心ELISA法检测登革病毒EDⅢ特异性抗体具有高度的特异性,但如果能同时联合抗原检测可明显提高登革热的早期诊断率?     

夹心免疫-PCR检测旋毛虫循环抗原的研究(英文)

目的建立以多抗为捕获抗体和单抗为检测抗体的夹心免疫-PCR检测旋毛虫循环抗原。方法利用杂交瘤技术制备抗旋毛虫单抗;旋毛虫抗原免疫家兔,分离纯化兔血清,制备兔抗旋毛虫多抗。多抗作为捕获抗体包被酶标板,单抗为检测抗体,选择适宜多抗和单抗浓度,建立夹心ELISA方法,再利用亲和素和生物素的高结合力连接起标记了生物素的抗体和DNA片段,将抗原抗体特异反应的免疫技术同无限扩增DNA片段的基因检测技术结合,利用PCR反应对DNA片段的扩增能力,提高检测灵敏度。结果制备了兔抗旋毛虫多抗,间接ELISA法筛选出与多种寄生虫抗原无交叉反应的单抗F4C6,夹心ELISA检测旋毛虫抗原最低浓度为0.05μg/ml,免疫PCR方法检测最低浓度为0.1ng/ml。结论首次建立夹心免疫-PCR检测旋毛虫抗原的方法,检测旋毛虫抗原的灵敏度高于传统ELISA方法104倍。     

分泌抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体杂交瘤株的建立

目的应用杂交瘤技术,制备分泌抗鼠疫F1抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法用鼠疫菌F1抗原免疫雌性BALB/c小鼠,检测小鼠血清中的F1抗体,选抗体滴度最高的小鼠用于细胞融合,融合前3天F1抗原经腹腔注射加强免疫1次,然后取其脾脏细胞与处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞混合,50%的PEG作为细胞融合剂,HAT培养液选择培养融合后的细胞,间接ELISA法检测细胞培养上清中的F1抗体,阳性杂交瘤细胞用有限稀释法进行克隆及再克隆。结果获得共计100余株分泌F1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,3株进行了4次克隆化,经8个月保存后抗体分泌稳定。结论应用杂交瘤技术,在云南首次成功制备了3株能稳定分泌抗鼠疫杆菌F1抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,建立了杂交瘤技术的实验程序。     

The specificity of antibodies to the F(ab′)2 fragment of human IgG

The specificity of IgG anti-F(ab′)₂ antibodies was examined in unfractionated sera of patients with rheumatoid arthritis and also with affinity-purified antibody preparations. Examination of the sera by an enzyme-linked immunosorbent assay, using pooled human F(ab′)₂ fragments absorbed to microtiter plates, revealed that IgG anti-F(ab′)₂ antibodies cross-react with human and rabbit IgG and rabbit F(ab′)₂. IgG anti-F(ab′)₂ antibodies were purified by affinity chromatography and, when tested by a fluid-phase inhibition enzyme-linked immunosorbent assay, were found to be of 2 types. One fraction, similar to pepsin agglutinator, reacted with human F(ab′)₂ fragment alone. The other fraction was cross-reactive with human IgG and yet failed to react with idiotopes on Fab or epitopes on Fc fragments. The IgG anti-F(ab′)₂ antibodies we purified had no reactivity toward a human immune complex prepared from tetanus toxoid and antitoxoid.     

The specificity of antibodies to the F(ab')2 fragment of human IgG

The specificity of IgG anti-F(ab')2 antibodies was examined by unfractionated sera of patients with rheumatoid arthritis and also with affinity-purified antibody preparations. Examination of the sera by an enzyme-linked immunosorbent assay, using pooled human F(ab')2 fragments absorbed to microtiter plates, revealed that IgG anti-F(ab')2 antibodies cross-react with human and rabbit IgG and rabbit F(ab')2. IgG anti-F(ab')2 antibodies were purified by affinity chromatography and, when tested by a fluid-phase inhibition enzyme-linked immunosorbent assay, were found to be of 2 types. One fraction, similar to pepsin agglutinator, reacted with human F(ab')2 fragment alone. The other fraction was cross-reactive with human IgG and yet failed to react with idiotopes on Fab or epitopes on Fc fragments. The IgG anti-F(ab')2 antibodies we purified had no reactivity toward a human immune complex prepared from tetanus toxoid and antitoxoid.     

放射免疫沉淀试验检测鼠疫FI抗体的研究——Ⅰ.特异性与敏感性

试验证明,用放射免疫沉淀试验(RIP)检测鼠疫抗体时,将被试血清与相应的阴性对照血清的结合比定为≥3作为反应标准是适宜的;用RIP检测假结核,小肠结肠炎菌等抗血清30份,这些抗血清在1:10到1:100的各种稀释度中与~(125)I-鼠疫FI抗原均无交叉反应,从非鼠疫疫区收集的2196份哺乳动物血清,亦未发现阳性反应,说明该法特异性强。由于RIP是用分离剂沉淀鼠疫抗原-抗体复合物,故能检出不完全抗体,检出率不仅高于常规的间接血球凝集试验(IHA)和酶联免疫吸附试验(ELISA),且滴度往往高十几倍、几十倍,乃至几百倍。所以用RIP检测潜在性鼠疫疫源地、考核灭源效果以及在科研中用于检测微量鼠疫抗体具有重要意义。加之该法自动化程度高,测试信息以数字显示,因而指标客观,容易分析,适于大规模现场调查。     

对常规制备的鼠疫F1抗原、抗体组分及免疫交叉反应的观察

目的对常规方法制备的鼠疫菌F1抗原、抗体的组分进行分析,并观察其免疫交叉反应。方法采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术分析抗原、抗体的组分;应用蛋白印迹观察其与相关细菌的免疫交叉反应。结果常规方法制备的鼠疫F1抗原、抗体组分复杂,混杂有其他多种蛋白;假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌的全膜蛋白与F1抗体存在交叉反应。结论常规方法制备的鼠疫F1抗原、抗体不纯,影响鼠疫免疫学诊断的特异性。     

丙型肝炎病毒F蛋白抗原性及患者血清F抗体流行率的研究

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白的抗原性及患者血清F抗体的流行率。方法利用11条引物延伸获处HCV f基因,以此为模板经聚合酶链反应扩增得到截短型f65基因片段,定向克隆至pET32a(+),重组子转化大肠杆菌Plyss菌株,异丙基β半乳糖苷诱导后用镍离子树脂纯化HCV F65蛋白。以F65蛋白为抗原,酶联免疫吸附法检测HCV感染者血清中F抗体。应用F65蛋白免疫新西兰大白兔制备多克降F抗体,再用葡萄球菌A蛋白树脂纯化兔血清中F抗体。结果成功构建了pET32a(+)f65重组子,表达并纯化了分子量为3．2×10~4的HCV F65蛋白。30份HCV患者血清F抗体的A_(450)为0．125+0．061．F抗体阳性率为63．3%。获得了兔源性F抗体,该抗体与HCV F65蛋白发生特异性结合反应,滴度为1：30000。结论HCV F65蛋白具有抗原性,可用来检测血清中F抗体。HCV患者血清中存在F抗体。兔源性F抗体可用来检测HCV F蛋白。     

Prompt laboratory diagnosis in timely containment of a plague outbreak in India

A focal outbreak of pneumonic plague occurred in a hamlet of village Hatkoti, district Shimla, Himachal Pradesh in the first fortnight of February, 2002. A total of 16 cases with 4 deaths were reported. Diagnosis of plague was confirmed by the laboratory in 10 (63%) cases. Y. pestis was isolated from clinical samples of 3 cases and confirmed by bacteriophage lysis. Molecular tests confirmed the presence of Y. pestis specific pla and F1 genes in 4 cases; DNA fingerprinting had identity with the known sequence of plague bacilli. Paired samples from 5 cases showed more than 4 fold rise and 1 case showed more than 4 fold fall in antibodies against F1 antigen of Y. pestis. The present communication emphasises that timely and systematic laboratory investigations give confirmatory diagnosis in shortest possible time which forms the backbone of the outbreak control in a timely fashion and prevents confusion and controversy.