一株埃可病毒16型510/YN/CHN/2010的全基因组分析北大核心CSCD

目的分析一株埃可病毒16型(Echovirus 16,E16)云南分离株510/YN/CHN/2010全基因组序列及其遗传特性。方法设计针对E16的引物,提取病毒RNA,RT-PCR扩增病毒目的基因并测序,利用BioEdit 7.2.3、MEGA 7.0和Simplot 3.5.1软件分析其全基因组。结果E16510/YN/CHN/2010全基因组核苷酸序列全长7432 nt,是编码含2196个氨基酸的多聚蛋白。其全VP1和全基因组与原型株Harrington的核苷酸和氨基酸同源性分别为80.68%、49.33%和81.26%、97.26%。与其他埃可病毒原型株的全基因组核苷酸和氨基酸同源性分别为75.72%~88.44%和83.01%~87.65%。系统进化分析将E16分为3个基因型,分离株510/YN/CHN/2010和其他中国分离株均属于B基因型。重组分析显示,510/YN/CHN/2010株可能在非结构编码区的P2段重组。结论510/YN/CHN/2010分离株为E16 B基因型,可能为重组株。     

1株9型猪链球菌全基因组分析北大核心CSCD

目的探索9型猪链球菌基因组功能及遗传关系。方法采用生物信息学方法对1株9型猪链球菌强毒株GD18的全基因组序列进行注释,并与GenBank上的15株猪链球菌进行比较基因组学分析。结果GD18菌株基因组全长2067661 bp,总蛋白1961个,注释到COG、GO、KEGG、CAZy和PHl-base数据库的基因分别占总蛋白的77.05%、71.29%、43.91%、4.49%和3.37%。毒力因子分析表明猪链球菌毒力因子的复杂以及并非所有的猪链球菌菌株都有一套通用的毒力因子。耐药基因分析表明GD18含多种类的耐药基因,且存在丰富的外排系统。蛋白预测结果显示GD18具有114个信号肽蛋白和30个分泌蛋白。16个菌株基因组比较分析发现共有的核心基因为1244个,非共有基因共1685个,特有基因共1417个。进化分析表明GD18与加拿大分离株89-3576-3亲缘关系最近,且国内菌株基本处在不同分支。结论对1株9型猪链球菌分离株的全基因组、基因功能、进化关系等进行分析,为9型猪链球菌基因组整体水平的研究奠定基础和提供数据支撑。     

浙江省1株犬源狂犬病病毒全基因组序列测定及细胞分离鉴定北大核心CSCD

目的了解浙江地区狂犬病分子流行病学现状,为浙江地区狂犬病防控提供相关数据。方法使用RT-PCR扩增浙江狂犬病病毒街毒株核苷酸并进行全基因组序列测定,与32株中国狂犬病病毒街毒株基因序列进行比对分析;使用Neuro-2a细胞进行病毒分离,测定不同代次全基因组序列并比较核苷酸突变情况。结果获得了全长为11782 bp的全基因组序列,经过比对分析后发现该毒株属于ChinaⅠ型,与全部参考基因Ⅰ型病毒核苷酸序列一致性为97.10%~99.31%;通过Neuro-2a细胞成功分离到狂犬病病毒,连续三代培养后病毒滴度最终达到5.71×10^(7)FFU/mL,子代之间序列一致性在99.9%以上,其中F3代较F1代核苷酸序列发生了7个位点突变,氨基酸未发生改变。结论新狂犬病病毒分离毒株(ZJSX-2021)属于ChinaⅠ型,与以往分离毒株属同一基因型,表明狂犬病病毒近年在浙江地区仍持续传播。细胞分离后病毒序列并无明显变化。     

不同毒力EV71济南分离株全基因组序列比较分析

目的研究EV71济南分离株的基因特点,寻找潜存的EV7l毒力决定位点。方法将6株EV71济南分离株（JN200803、JN200804、Jinanl002、Jinanl004、Jinan1005和Jinan1006株）分别接种1d龄BALB／c小鼠,确定其对小鼠的致病性程度。对6株EV71全基因组核苷酸、氨基酸序列进行比较,对非编码区进行RNA二级结构的预测和分析,对VPl区进行遗传进化分析。结果通过动物实验可将6株EV71济南分离株分为强、中、弱毒力株。小鼠感染强毒株（JN200804、Jinan1002、Jinanl004、Jinanl005株）的主要症状为后肢麻痹并死亡,感染弱毒株（Jinanl006株）的主要症状为后肢麻痹但能自愈,感染无毒株（JN200803株）未引起明显症状。不同毒力EV71分离株全基因组序列比对发现,共有40个核苷酸位点的差异,导致编码区8个氨基酸突变,其中第937位氨基酸（位于2A片段）在强毒株、弱毒株和无毒株间发生了连续突变（937aa：S→C→G）。非编码区RNA二级结构预测表明,5’UTR第115位核苷酸突变对内部核糖体进入位点（IRES）的结构有较大影响。遗传进化分析显示,与同内2003年以后的流行毒株相同,6株EV71济南分离株均属C4亚型的C4a进化分支。结论全基因组序列比较分析发现不同毒力EV71济南分离株之间存在差异位点,为采用反向遗传学方法鉴定EV71毒力决定位点奠定了基础。     

武汉重症手足口病EV-A71分离株全基因组特征分析北大核心CSCD

目的分析武汉重症肠道病毒A71型(Enterovirus A71,EV-A71)病毒株全基因组特征。方法自湖北武汉2例手足口病Ⅱ期患儿咽拭子中分离EV-A71,利用overlap-PCR扩增EV-A71全基因组的6个首尾重叠的基因片段,利用生物信息学软件DNAStar5.0、MEGA-Ⅹ和SimPlot3.5.1分析基因组特征。结果获得2株EV-A71分离株wh064和wh170的全基因组序列,二者核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.95%和99.86%。2株EV-A71病毒株属于C4a2亚型。系统进化分析和遗传距离计算发现,在P1区域,2株病毒株与C基因型EV-A71位于同一进化分支,遗传距离最小;在P2区域,2株病毒株与B基因型EV-A71和CVA16位于同一分支,与B基因型EV-A71之间遗传距离最小(C4亚型除外);在P3区域,2株病毒株与B3亚型EV-A71和CVA16位于同一分支,与B3亚型EV-A71和CVA16之间遗传距离较小。基因重组分析发现,2株分离株P1区域与C基因型EV-A71相似度最高,P2区域与B基因型EV-A71、CVA4、CVA5、CVA14和CVA16原型株的相似度高于C基因型EV-A71,P3区域与B3亚型EV-A71、CVA4、CVA14和CVA16原型株相似度高于其他病毒株,重组断点位于2A-2B连接处和3C处。此外,2株病毒株基因组中突变位点5’UTR-61T、VP1-27S(L)、VP1-98K和3D-396S亦存在于武汉其他重症和死亡病例EV-A71分离株。结论武汉2株EV-A71是重组病毒株,可能由C基因型和B3亚型EV-A71病毒株重组而来,亦或由C基因型EV-A71和CVA4、CVA14、CVA16重组而来。某些位点突变可能影响EV-A71毒力。     

不同来源金黄色葡萄球菌的全基因组序列分析北大核心CSCD

目的了解不同来源金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)的全基因组序列基本特征,探究菌株的分子分型、耐药基因型、毒力及其遗传进化关系。方法应用solexa高通量测序技术对10株医源性和食源性代表株金葡菌进行全基因组测序,以此进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、金葡菌a蛋白(Staphylococcus aureus protein A,spa)基因分型分析,并比较分析不同菌株基因组中携带耐药基因和毒力因子,筛选核心基因,构建系统进化树。结果10株金葡菌染色体基因组大小相似,均为2.7Mbp,包含有2486~2648个基因不等,平均长度约为887bp。耐药基因注释分析显示9株甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)携带的耐药基因少于另一株耐甲氧西林金葡菌(MRSA)。尽管在不同菌株基因组之间的毒力因子数量无显著区别,但不同菌株存在的毒力因子却不同,食品来源金葡菌基因组携带1~4种数量不等的肠毒素基因。进化树分析显示不同来源金葡菌位于不同进化分支,2株为ST8型的MSSA和MRSA进化亲缘性较高,属于同一进化分支内。结论获得10株不同来源金葡菌的全基因组序列数据,并证实食源性或医院来源金葡菌为了适应不同生存环境,通过不同分子进化机制,获得不同耐药基因和毒力因子,形成菌株特定的分子遗传特征,可为金葡菌的分子流行病学和致病性机制研究提供参考依据。     

不同来源粪肠球菌的比较基因组学分析北大核心CSCD

目的分析不同来源粪肠球菌全基因组特征及其分子进化规律。方法对收集的不同来源粪肠球菌进行全基因组序列测序,利用比较基因组学分析粪肠球菌的基因特征、耐药基因和毒力基因携带情况,并以此进行泛基因组和核心基因组分析,构建系统发育树,进行系统进化分析。结果6株不同来源粪肠球菌染色体全基因组序列全长为2450754~2731452 bp,共含有2669~3085个基因,基因组的平均GC含量为38.0%。粪肠球菌具有开放型泛基因组,而核心基因组为稳定型。不同来源菌株基因组中均含有3~14种耐药基因和8~17种毒力基因。基于核心基因系统进化树分析显示,不同来源的粪肠球菌分子进化均匀分布,相互重叠,无明显聚类趋势。结论粪肠球菌具有开放型泛基因组,其核心基因为稳定型,不同来源分离菌株进化均匀分布,这些结果为后续揭示粪肠球菌分子遗传进化规律等研究奠定了基础。     

黑龙江省活禽市场6株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列分析北大核心CSCD

目的了解2018年黑龙江省活禽市场H9N2亚型禽流感病毒变异特点和进化规律。方法采集黑龙江省禽流感监测点活禽市场的环境标本进行H9N2亚型的核酸检测,阳性标本进行病毒分离,对分离的禽流感病毒毒株进行全基因组序列测定,应用生物信息学软件分析其基因特征。结果 6株H9N2亚型禽流感病毒HA基因裂解位点附近氨基酸序列均为PSRSSRGLF,符合典型低致病性禽流感病毒基因的特征,HA蛋白受体结合位点第226位Q→L,具有与α-2,6唾液酸受体亲和力增强的特性,第183位突变为天冬酰氨;NA蛋白中63-65位茎部全部缺失,使病毒的生长受到抑制,在3个可能的血凝素结合位点中,6株病毒发生变异(368N,369G,402D);另外,HA和NA基因潜在糖基化位点也存在增加或缺失的现象;与参考序列相比,PB1、PB2蛋白有3处发生突变,增强了病毒的致病性;M2蛋白发生V27G和S31N突变,对金刚烷类药物产生耐药;NP和NS基因在几个关键位点上均未发生变异。遗传进化分析显示,6株H9N2亚型禽流感病毒在NA、M和NP基因中相似度更高,HA、NA基因位于Y280/97-like分支,PB2、M基因位于G1/97-like分支,PB1、PA、NP和NS基因均位于F/98-like分支。结论 6株H9N2亚型禽流感病毒发生了3配体重组,可能成为高致病性禽流感病毒H5、H7亚型部分基因的供体。因此,应加强对H9N2亚型禽流感病毒的监测,密切关注其变异情况及重组趋势。     

1株鼠源狂犬病毒野毒株全基因组序列测定与分析

目的对1株分离自牛狂犬病疫区野鼠脑内的狂犬病毒野毒株(MRV)进行全基因组测序,并对其分子变异和进化特点进行分析。方法RT-PCR扩增克隆覆盖全基因组9个重叠基因片段,基因组3′末端和5′末端采取3′-RACE和5′-RACE方法。结果9个重叠基因片段序列拼接得到MRV全基因组序列,共11869个核苷酸。MRV毒株全基因组构成与其他狂犬病毒基因组构成相似,由5个编码区组成,基因起始位点和终止位点高度保守,在核蛋白和糖蛋白的重要抗原位点有个别氨基酸发生变异。选择有代表性的狂犬病毒株,构建了N基因分子系统进化树。结论MRV毒株属于狂犬病毒基因1型,与AV01和CVS同源性最高为99%,与分类位置未确定的北高加索毒株(WCBV)的同源性最低为72%。     

冈田绕眼果蝇基因组序列特征研究北大核心CSCD

目的了解冈田绕眼果蝇(Amiota okadai, A. o)基因组序列特征。方法采用Genscan、Augustus、Glimmer、HMM、GeneID和SNAP等软件对冈田绕眼果蝇基因组测序数据进行从头预测;用GeMoMa软件进行同源预测,利用EVM软件对预测结果进行整合,并结合已获得的冈田绕眼果蝇RNA-seq数据对冈田绕眼果蝇基因进行结构优化、以预测其基因组全部基因并在公共数据库及专有数据库中进行注释。结果对冈田绕眼果蝇基因组进行注释及优化分析,共得到11 510个具有较高可信度的基因;在公共数据库中进行BLAST比对,98.53%的基因得到注释,其中NR数据库中注释的基因数目(占98.20%)较多,可富集到KEGG的基因数目(占43.15%)较少;通过KOG数据库分析功能基因,共得到4 967个功能基因。在3个专有数据库中(TCDB、CAZyme和PHI)中进行比对,分别注释获得了291、359和2 574个基因,其中PHI数据库中可注释的基因(2 574个)较多。结论初步揭示了冈田绕眼果蝇基因组序列特征和注释信息,共得到11 510个基因,为其基因组序列特征研究奠定了基础。     

2020年深圳地区4株冠状病毒HCoV-NL63基因组特征分析

目的 了解2020年深圳市冠状病毒HCoV-NL63全基因组序列的遗传特征和变异.方法 对HCoV-NL63核酸检测阳性的咽拭子标本进行全基因组测序、系统发生树重建和生物信息学分析.结果 获得4株HCoV-NL63全基因组序列,均属于B基因型B2亚型,株间核苷酸(氨基酸)同源性为99.80％～99.98％ (99.64...     

嗜肺军团菌血清I型菌株随机扩增多态性DNA指纹图谱研究

目的采用随机扩增多态性DNA(RAPD)方法研究我国58株嗜肺军团菌血清1型(Lp1)菌株的基因型特征。方法58株嗜肺军团菌血清1型菌株来自北京和深圳市的集中空调冷却塔水和温泉水,随机引物采用5’-CGGCGGCG-GCGG-3’序列,分析Lp1型军团菌RAPD基因型和温度、pH值的关系。结果58株Lp1型菌株共分为17个RAPD基因型。与集中空调冷却塔水Lp1型菌株相比,温泉水分离的菌株基因型具有较高的多态性。深圳市29株集中空调冷却塔水分离的Lp1菌株,共呈现出3个RAPD基因型,北京市24株来自温泉水的Lp1菌株分为12个RAPD型,5株来自集中空调冷却塔水的Lp1型菌株分为两个RAPD型。温泉水Lp1菌株的基因型差异和水温度和pH值无明显的关联。结论RAPD分型方法可用于我国Lp1菌株的基因分型,不同地区和来源的Lp1型军团菌菌株具有特征性的RAPD基因型,温泉水中分离的Lp1菌株较集中空调冷却塔水分离菌株基因型呈现较高的基因多态性。     

云南省1株基孔肯雅毒株全基因组序列测定及特征分析

目的 对1例缅甸输入基孔肯雅热病例血清标本进行病毒分离及全基因组测序,分析其基因特征。方法 采用real-time RT-PCR方法对标本进行检测,分离培养后获得毒株,对病毒核酸扩增后的产物进行全基因组测序,使用DNAStar 7.1软件对测序结果进行拼接,Mega5.0软件对序列进行比对和系统发生树构建。结果 病例血清标本核酸检测显示CHIKV阳性,经分离培养获得CHIKV毒株(YN0627株),全基因组测序得到其序列,YN0627全长为11 586 nt,其基因结构符合CHIKV的基因特征。系统进化分析显示,YN0627与东中南非洲遗传谱系(East, Central and South African Lineage, ECSA)的其他流行株聚集在一起,属于ECSA谱系。YN0627的编码区与参考序列相比,核苷酸同源性为85.24%~99.96%,氨基酸同源性为95.34%~99.97%,结构蛋白编码区域有28个氨基酸变异位点。结论 云南省输入性CHIKV-YN0627属于ECSA谱系,且观察到多个氨基酸位点突变,提示云南省应当加强对CHIKV的监测和研究。     

嗜肺军团菌lvgA基因分析及实时荧光定量RT-PCR对军团菌的检测

目的确定不同嗜肺军团菌lvgA基因序列的差异性及其感染宿主细胞后转录水平的变化,建立基于lvgA基因检测嗜肺军团菌的荧光定量RT-PCR。方法通过使用NCBI/Blast,Pfam,TMHMMServer v.2.0等网络资源分析嗜肺军团菌lvgA基因编码蛋白的保守功能结构域、跨膜区域。根据参考序列设计引物,采用PCR技术从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增lvgA基因,将其连接入克隆载体pMD18-T进行测序,并用cltust软件比较不同嗜肺军团菌菌株lvgA基因的核苷酸、氨基酸序列。根据lvgA基因和嗜肺军团菌16SrDNA序列内的特异保守区域设计引物,以实时荧光定量RT-PCR检测嗜肺军团菌在感染人单核巨噬样细胞THP-1后lvgA基因转录水平的变化,同时,采用基于lvgA基因的荧光定量RT-PCR对嗜肺军团菌患者血液样本进行检测。结果研究表明,嗜肺军团菌lvgA基因为军团菌毒力基因,其产物定位于外膜表面。不同嗜肺军团菌菌株中lvgA基因的核苷酸序列和氨基酸序列保守,相似度分别达:99%,96%,96%和99%,98%,98%。在感染宿主细胞后lvgA基因的转录水平上调明显,最高达4.3倍(P<0.05)。基于lvgA基因的荧光定量RT-PCR方法可有效地检测嗜肺军团菌患者血液样本中的嗜肺军团菌。结论 lvgA基因与嗜肺军团菌的毒力相关,建立的基于lvgA基因的荧光定量RT-PCR方法具有快速、敏感、稳定等优点,适用于嗜肺军团菌肺炎临床实验室的早期诊断。     

浙江新分离汉坦病毒ZT71株S基因片段的克隆及序列分析

目的为了获得浙江省汉坦病毒基因组更为详尽的资料,研究汉坦病毒的进化状况及变异程度,为疫苗病毒株的选择使用提供科学依据。方法本实验室利用RT-PCR方法扩增ZT71株S基因片段并克隆入质粒载体,进行核苷酸序列测定及分析。结果ZT71株S基因由1754个核苷酸组成,只有一个开放读码框架,共编码429个氨基酸。与HTN型病毒(76-118)的核苷酸和氨基酸同源性分别为72.0%和82.6%,与SEO型病毒(SR-11、R22、Guo3、8610)核苷酸和氨基酸同源性分别为88.4%—96.5%和98.1%—99.0%,与其它型汉坦病毒的同源都很低。结论表明此分离的病毒为SEO型汉坦病毒,为进一步研究其进化和变异提供了有利条件。     

狂犬病两株不同毒力克隆株病毒的神经毒力和全长基因序列比较

目的 对2株毒力不同的狂犬病病毒克隆株(CTN181-3和CTN181-12)进行神经毒力和全长基因序列的比较。方法 分别对2株病毒用10、14和21日龄小鼠脑内接种,测定小鼠的致死力(LD₅₀);同时用空斑法测定2株病毒的病毒滴度(PFU),以lgPFU/lgLD₅₀比较2株病毒的毒力差异;分别对2株病毒进行全基因序列测定并分析,找出毒力差异关键基因位点。结果 2株病毒对10、14和21日龄小鼠的lgPFU/lgLD₅₀,CTN181-3株为0.07、3.40和6.60,CTN181-12株为<-0.9、<-0.6和1.04。全基因序列分析表明,二者共有8个核苷酸和6个位点的氨基酸存在差异。结论 CTN181-3株的神经毒力明显低于CTN181-12株,两者间6个氨基酸的差异是其毒力差异的分子基础。     

广东地区空调冷却塔水嗜肺军团菌分离株脂肪酸分型研究

目的探讨脂肪酸分析方法在种水平上对嗜肺军团菌的判断能力;将脂肪酸分型方法与传统的血清分型方法进行比较,了解不同血清型嗜肺军团菌株脂肪酸成分的异同。方法选取近3年从广东地区空调冷却塔水中分离到的112株嗜肺军团菌分离株,提取脂肪酸,利用MIDI公司Sherlock系统进行菌体脂肪酸成分分析,使用SPSS 13.0软件对获得的数据资料进行统计分析及聚类分析。结果脂肪酸分析法判定嗜肺军团菌的符合率为84.8%,所有菌株共有的脂肪酸成分有9种,主要脂肪酸成分有4种,分别为16∶0 iso、15∶0 anteiso、16∶1 w7c和14∶0 iso脂肪酸。血清1型菌株与血清6、7型菌株相比,有3种主要脂肪酸含量差异有统计学意义(P<0.05)。结论可以依据菌体脂肪酸分析方法对嗜肺军团菌进行快速鉴定;嗜肺军团菌菌株的脂肪酸成分稳定,但各血清型间脂肪酸含量存在一定差异;MIDI数据库中军团菌脂肪酸数据仍有待完善。本研究同时提供了广东地区空调冷却塔水嗜肺军团菌株脂肪酸组成及分型数据。