三种提取人腰椎间盘纤维环总RNA效率方法比较

目的：通过比较利用不同方法抽提人腰椎间盘纤维环RNA的效果来评定抽提人腰椎间盘纤维环总RNA的有效的方法和步骤。方法：对60例腰椎间盘突出症患者在腰椎间盘摘除手术时切取摘除的椎间盘组织,60份标本分别用异硫氰酸胍法、Trizol法和膜结合柱分离法提取组织中的RNA,用紫外可见分光仪测定所得RNA的浓度和OD260/OD280的比值并分别记录,另外记录提取RNA所用的时间和OD比值大于1.60的阳性率以及平均每份标本所需的费用。结果：利用异硫氰酸胍法,平均耗时160 min,RNA平均浓度为95.44μg/μl,平均OD比值为1.62,阳性率58.3%;利用Trizol法提取总RNA,平均耗时105 min,RNA平均浓度为531.40μg/μl,平均OD比值1.40,阳性率18.5%;利用膜结合柱分离法提取标本总RNA,平均耗时41 min,RNA平均浓度为690.34μg/μl,平均OD比值为1.83,阳性率100%。结论：膜结合柱分离法是提取人腰椎间盘高质量总RNA的有效方法。     

快速提取白念珠菌总RNA的新方法研究

目的 探讨快速提取理想白念珠菌总RNA的实验方法.方法 对静止相和菌丝相的白念珠菌国际标准菌株ATCC90028采用冷酸洗玻璃珠联合Tripure法提取总RNA,用紫外分光光度计测量其OD260、OD280的值,并进行琼脂糖凝胶电泳.结果 提取的白念珠菌酵母和菌丝相总RNA产量分别为1.944 0、1.962 4,且OD260/OD280比值介于1.8～2.0范围内,电泳显示提取的总RNA呈现28s rRNA,18s rRNA和5s rRNA 3条清晰的条带.结论 冷酸洗玻璃珠联合Tripure新方法快速且完整性好,值得推广.     

笃斯越桔果实总DNA提取方法的比较研究

目的探讨越桔果汁总DNA的最佳提取方法。方法分别采用SDS法、高盐低pH值法、CTAB法、异硫氰酸胍法提取越桔果汁的基因组DNA,并对其进行核酸含量测定和电泳及RAPD-PCR检测。结果SDS法、高盐低pH值法、CTAB法、异硫氰酸胍法提取越桔果汁的基因组DNA其OD260/OD280分别为1.944、1.738、1.661、1.813,其浓度分别为2.363μg/μl、0.548μg/μl、0.735μg/μl、1.455μg/μl;电泳检测显示异硫氰酸胍法提取DNA条带最清晰,扩增产物最多。结论用异硫氰酸胍法提取越桔果汁总DNA优于其它方法。     

鹌鹑肝组织胱硫醚β-合酶基因RT-PCR的实验研究

[目的]建立一种有效的鹌鹑肝组织胱硫醚β-合酶(CBS)RT-PCR,为实现CBS Real-time PCR提供条件。[方法]采取一步法,改进一步法,异硫氰酸胍法(重复抽提)和异硫氰酸胍法(一步法)四种方法提取总RNA,以CBS cDNA共有序列设计鹌鹑CBS引物,进行CBS RT-PCR引物筛选。[结果]除改进一步法外,其他三种方法提取的总RNA完整性好;除异硫氰酸胍法(一步法)外,其他三种方法提取的总RNA的A260/A280都在1.8以上纯度。异硫氰酸胍法(重复抽提)提取的总RNA极少残留DNA。[结论]四种方法都能较好地扩增CBS片段,一步法最省时。但异硫氰酸胍法(重复抽提)抽提得到的RNA质量较好.     

改进异硫氰酸/酚/氯仿一步法制备烟曲霉总RNA

目的:高质量地提取烟曲霉总RNA,为从转录水平研究烟曲霉病理机制奠定基础。方法:异硫氰酸/酚/氯仿一步法制备烟曲霉总RNA,1·5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪照相。结果:提取的RNAOD260/OD230>2·0,OD260/OD280为1·8~2·0,电泳条带清晰,RNA纯度及完整性好。结论:该方法可用于制备高质量的烟曲霉总RNA。     

改良酸性胍一步法提取RNA技术

酸性胍一步法提取RNA具有省时、量高和质纯等优点,但是不易在国内现有条件下进行,因此本文对该法进行了改良。实验表明,与CsCl法和酸性胍一步法比较,改良一步法保持了RNA产量、poly(A)+RNA产率、260/280比值和分子完整性等参数水平,并且易于在国内现有条件下推广使用,由此为酸性胍一步法提取RNA提供了可行的方法。     

Trizol RNA提取法在雪貂组织的流感病毒H3N2定量PCR检测中优于RNeasy mini kit (Qiagen)柱子法

目的 比较RNeasy mini kit (Qiagen)柱子法和Trizol法提取RNA在雪貂肺和肠组织H3N2 SYBR Green PCR定量中的去干扰作用,从而找到适合该定量体系的RNA提取方法.方法 比较Trizol法,RNeasy mini kit柱子法,改良RNeasy mini kit柱子法1和改良RNeasy mini kit柱子法2提取肺肠组织RNA的质量,RNA逆转录成cDNA后,利用SYBR Green PCR方法检测样品中H3N2的载量,比较产物的特异性,综合评价RNA提取方法.结果 4种方法提取的肺和肠组织的RNA质量不相同,紫外分光光度仪测得RNeasy mini kit柱子法提取的RNA 的A260/280低于1.8,其余3种方法的A260/280在1.8～2.1之间,A260/230只有Trizol法能达到2.0左右,其余3种方法均远低于2.0.电泳可见Trizol法提取的RNA有3条带:28 s、18 s和5 s,而RNeasy mini kit柱子法的RNA除了有28 s、18 s外,还有基因组DNA,改良RNeasy mini kit柱子法1和2提取的RNA只有28 s和18s带.RNA逆转录后进行荧光定量PCR,从溶解曲线看,不论是鼻甲刮取物还是肺肠组织的样品模板,4种方法获得的样品与标准品均为单一峰溶解曲线峰,并且波峰位置重叠.而鼻甲刮取物定量的产物跑琼脂糖凝胶电泳均为单一的特异性条带,而肺肠组织的产物电泳发现:Trizol法获得的模板定量产物与标准品一致,为单一的特异性条带,而其它3种方法获得的模板则均有非特异性条带.结论 鼻甲刮取物的病毒定量选用RNeasy mini kit柱子法提取定量结果与Trizol法一样可靠,说明对于简单样品该体系及引物非常适用,结果可信.对于组织样品肺和肠,Trizol法获得的样品定量结果比其它3种方法可靠.     

金银花药材脱氧核糖核酸(DNA)提取方法的研究

目的:研究金银花药材总脱氧核糖核酸(DNA)的提取方法。方法:对经典的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法进行了改良,采用改良的CTAB法提取金银花药材的总DNA,通过紫外吸收、琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度。结果:用改良的CTAB法提取的总DNA的OD260/OD280比值在1.76-1.85之间,干药材提取率为89.8-325.4μg/g。结论:用改良CTAB法提取的基因组DNA纯度高,符合分子生物学的要求。     

适用于转录组测序的人参根总RNA提取方法的筛选

目的 筛选适用于转录组测序的人参根组织总RNA提取方法.方法 以15年生长白山人参为研究对象,比较RNAiso Plus法、Trizol法、改良CTAB法、植物总RNA提取试剂盒、多糖多酚总RNA提取试剂盒(RNA prep Pure Plant Kit)提取人参根组织总RNA,利用琼脂糖凝胶电泳、Aligent 2100 Bioanalyzer对5种方法提取的总RNA进行质量检测.结果 Trizol法和RNAiso Plus法均能提取到总RNA,1%琼脂糖凝胶电泳显示28S、18S条带清晰稳定,D(γ)260 nm/D(γ)280 nm和D(γ)260 nm/D(γ)230 nm值均在2.0左右.Trizol试剂法提取总RNA的28S条带亮度明显高于18S,所得RNA浓度达485.66 ng/μL,经Aligent 2100 Bioanalyzer检测,28S条带亮度是18S的2倍.RNA prep Pure Plant Kit试剂盒及植物总RNA提取试剂盒提取RNA的条带模糊、弥散,RNA降解严重.改良CTAB法无法完成人参根组织总RNA的提取.结论 Trizol试剂法提取的人参根组织总RNA浓度、纯度及完整性与其他方法相比效果最佳,能满足转录组测序的要求,是人参根组织总RNA提取的首选方法.     

Trizol与RNA Fast1000试剂盒提取外周抗凝血总RNA的方法比较

目的 比较传统Trizol法和试剂盒法提取血液中总RNA的效果.方法 我们将100份人体新鲜血液标本随机分为2组,每组各50份,分别用Trizol法和RNA Fast1000试剂盒法两种方法从外周血中提取RNA测定其纯度和完整性,通过两独立样本的t检验统计分析2组OD值比值数据的差异性.结果 试剂盒提取的总RNA的纯度(1.904±0.15)优于传统的Trizol方法(1.727±0.42).结论 与Trizol法相比,试剂盒法具有简便、快速、高纯度等特点,且提取的RNA样品质量较高,可直接用于RT-PCR合成、Northem杂交等分子生物学操作.     

血清丙肝病毒RNA二种提取方法的比较

２４例抗－ＨＣＶ阳性的血清标本，同时以硫氰胍半字符热酚变性方法和蛋白酶ＫＩ肖化法裂解提取丙肝病毒ＲＮＡ（ＨＣＶＲＮＡ），并应用反转录半字符多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和套式多聚酶链反应（Ｎｅｓｔ－ＰＣＲ）检测ＨＣＶＲＮＡ。结果表明，硫氰胍半字符热酚法明显优于蛋白酶Ｋ消化法。前者处理标本的阳性检出率为５８．３％，后者处理标本的阳性检出率为３３．３％（Ｐ＜０．０５）；前者操作步骤简便，在试剂的保存等方面优于后者，故前者更适于临床ＨＣＶＲＮＡ的检测     

乳腺癌患者外周血RNA提取方法的探讨

目的：建立外周血RNA的提取方法，为用逆转录－聚合酶链反应检测乳腺癌外周血中微转移打好基础。方法：从30例乳腺癌患者的冰冻保存和新鲜全血标本，用两种不同方法分离外周血有核细胞，提取RNA，测定RNA产量及RNA的完整性。结果：从冰冻保存和新鲜全血标本，提取的总RNA的OD值有显著性差异。从新鲜全血中提取RNA的产量高于从冰冻保存的全血中提取的RNA的产量。但是，电泳时均有28S与18S的条带。结论：用逆转录－聚合酶链反应时，以从新鲜全血中提取RNA为宜，但为留取标本的方便，也可用冰冻保存的全血标本，该实验中所采用的两种分离外周血有核细胞提取RNA的方法都切实可行。     

肺吸虫和血吸虫总RNA的提取及电泳分析

目的为构建肺吸虫ｃＤＮＡ文库，获得目的重组抗原，用以肺吸虫病的诊断，而制备卫氏肺吸虫的总ＲＮＡ。方法采用改进的一步法（Ａ和Ｂ）提取了卫氏肺吸虫成虫的总ＲＮＡ，同时提取了日本血吸虫成虫及其虫卵、小鼠肝脏的总ＲＮＡ。结果人睾丸组织的总ＲＮＡ经琼脂糖凝胶电泳，观察到方法Ａ所提取的肺吸虫、血吸虫及其虫卵的总ＲＮＡ在凝胶上只有一条略大于１８Ｓ的条带。用方法Ｂ提取的肺吸虫以及血吸虫的总ＲＮＡ则出现２条条带，其中１条色淡，并略小于２８Ｓ，另１条色深，并略大于１８Ｓ。结论肺吸虫的Ｌ－ｒＲＮＡ中也存在切口现象。     

黄花石蒜花蕊和花葶组织中总RNA提取方法的比较

目的 筛选适合黄花石蒜花蕊和花葶组织中总脱氧核糖核苷酸(RNA)的提取方法.方法 采用CrAB法、SDS法和植物总RNA提取试剂盒法对黄花石蒜花蕊和花葶组织中总RNA进行提取并比较其效果.结果 CTAB法和SDS法均不能提取到完整的RNA;植物总RNA提取试剂盒能有效地去除蛋白质、多糖及DNA,28S条带的荧光亮度是18S条带的2倍左右,OD260/280值在1.8～2.0之间,花蕊和花葶的产率分别为304.1 μg/g和255.8 μg/g,并且试剂盒法提取的总RNA通过RT-PCR扩增能获得特异性条带.结论 试剂盒法适合黄花石蒜花蕊和花葶组织总RNA的提取,提取的总RNA质量高、完整性好、产率高,符合后续实验的要求.     

一种椎间盘组织总RNA提取的改良方法

目的改进传统常规法在椎间盘组织中总RNA提取,获得高质量的椎间盘组织总RNA。方法健康成年Newsland白兔,完整取出椎间盘组织,随机分RNA传统方法组和酶消化改良组。传统组,按Trizol法提取总RNA;酶消化改良组,加入0.2%Ⅱ型胶原酶,置于细胞培养箱消化数小时,加入含小牛血清的PBS液终止,离心收集细胞。余步骤同传统组。结果传统组,电泳结果未见28S和18S条带,5S条带部分可见;A260/280比值在1.5左右,蛋白多糖污染重。而酶消化组,电泳结果可见清晰的28S、18S和5S条带,且28S条带的亮度约是18S的两倍;A260/280比值在1.8～2.0之间,无蛋白污染,此法提取的RNA,逆转录后可用于扩增β-actin基因。结论酶消化改良法可望成为椎间盘组织总RNA提取的好方法。RNA片断完整,纯度高,无蛋白污染,不影响后续基因表达（RT-PCR）的分析,并且重复性好,可以推广。     

不同RNA提取及反转录方法对环状RNA聚合酶链反应的影响

［摘要］ 目的 比较不同总RNA提取方法及不同反转录引物对喉鳞状细胞癌细胞株Hep2细胞环状RAN扩增的影响,进一步为环状RNA鉴定与扩增提供可靠的实验方法。 方法 使用Trizol抽提法和miRNeasy Mini试剂盒提取Hep2细胞中的总RNA;Nanodrop 2000对总RNA进行定量及纯度测定;使用随机引物和通用引物分别对总RNA进步反转录;实时定量聚合酶链反应检测Hep2细胞中环状RNA-circHIPK3及circFLNA的表达。 结果 Trizol抽提法提取的RNA浓度和RNA总量高于miRNeasy Mini试剂盒提取的RNA总浓度结果（P＜0.01）,但应用miRNeasy Mini试剂盒提取的RNA纯度要高于Trizol抽提法（P＜0.05）,应用随机引物反转录,能扩增出circHIPK3和circFLNA,而利用通用引物进行反转录,circHIPK3及circFLNA不能被扩增;另外,利用miRNeasy Mini试剂盒法提取总RNA后所扩增出circHIPK3及circFLNA的相对表达量明显高于Trizol抽提法（P＜0.01）。 结论 miRNeasy Mini试剂盒提取总RNA纯度更高,更有利于环状RNA的扩增,利用随机引物进行反转录而非通用引物,可顺利扩增出环状RNA。