HCV细胞感染模型研究进展及其在药物研究中的应用

利用从基于JFH1克隆的HCV嵌合体或者复制子中鉴定的适应性突变,已经建立了代表基因1~3型HCV的细胞感染模型。迄今,JFH1仍然是唯一能在肝细胞系中自主高效复制的克隆,因此迫切需要建立能培养所有HCV临床分离株的通用细胞感染模型。概述了建立HCV细胞感染模型的历程、现有细胞感染性克隆和支持HCV复制的细胞系,同时简述HCV细胞复制和感染模型在药物研究中的一些应用。     

慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞中负链HCV RNA的检测及意义

19例临床诊断慢性丙型肝炎患者,检测其外周血单个核细胞中丙型肝炎病毒(HCV)RNA的存在及复制状态。所选检测对象血清标本抗-HCV及HCV RNA均为阳性。采用逆转录-套式PCR法检测其外周血单个核细胞中HCV正、负链RNA,结果19例患者外周血单个核细胞中14例HCV正链RNA阳性;6例HCV负链RNA阳性。实验结果证实部分慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞中存在HCV复制,表明肝细胞并非为HCV感染与复制的唯一场所。HCV感染慢性化与其外周血单个核细胞中存在HCV复制可能有一定关系。     

针对宿主细胞靶位抗HCV策略研究进展

慢性HCV(CHC)感染是严重危害人类健康疾病之一.现阶段HCV治疗策略疗效有限,有必要寻找更新更好的抗HCV策略.宿主细胞因素为HCV感染、复制和/或致病所必需,因此可能成为潜在的治疗靶位.最引人注意的细胞因素包括,介导病毒入胞细胞受体、促进病毒复制、组装等细胞因素和细胞内脂质生物合成途径、氧化应激压力及内源性免疫反应等.目前的关键问题是从药理学角度调控这些细胞靶位,减少副反应,从而利于慢性HCV感染治疗.本文主要就近几年的相关研究进展作一简要综述.     

人肝癌细胞株7721HCV体外感染模型的建立

目的建立接近体内自然感染状态并能稳定支持HCV体外长期复制的感染细胞模型。方法将慢性丙型肝炎患者的血清与人肝癌细胞系7721共同孵育8小时后,分别以反转录-聚合酶链反应、免疫组化、原位杂交检测细胞和/或培养上清中的HCV正、负RNA、HCV抗原的表达及HCV-RNA在感染细胞内的定位。结果感染血清和细胞共同孵育后的第2～65天,从细胞内和培养上清中均可间断地检测出HCV正、负RNA,即使其间细胞传代4次HCV NS_3抗原、NS_5抗原在细胞内能稳定表达,原位杂交显示HCV RNA阳性物质多位于细胞浆。结论 7721细胞不但对HCV易感,而且可以稳定地支持HCV的体外长期复制,此模型可以用于HCV感染、复制机理的研究、抗病毒药物的评价及保护性抗体/疫苗的初步筛选。     

丙型肝炎病毒对人B淋巴细胞系的感染及其形态学研究

目的：研究HCV对人B淋巴细胞的感染,建立HCV感染的丙型肝炎患者B淋巴细胞模型（CBCL）,并进行HCV的形态研究,方法：用EB病毒转化B细胞建立B细胞系,以逆转录多聚酶链反应（RT－PCR）,免疫组织化,原位杂交方法检测B细胞系上清液及细胞内的HCV抗原及HCVRNA,并通过电镜对HCV进行形态研究,结果：细胞系上清液中HCVRNA呈阳性,细胞内HCV抗原及HCVRNA均呈均呈阳性,电镜观察结果发现细胞内存在65nm和100nm圆形球病毒颗粒,并可见病毒芽生形成现象,结论：HCV可感染人B淋巴细胞并在其中复制,病毒在感染细胞胸质空泡部位合成和组装,以芽生方式进入胸质空泡形成病毒颗粒。     

人滋养层细胞培养上清液及裂解液中丙型肝炎病毒的检测

目的应用改良的分离、纯化方法对孕早期人绒毛滋养细胞进行原代培养,利用HCV阳性血清对滋养细胞进行体外感染,探讨HCV在体外培养条件下对细胞的感染及HCV在细胞中的复制状态。方法采用胰蛋白酶消化法消化正常人妊娠孕早期胎盘组织,以35%、45%2个Percoll密度梯度进行分离纯化、并免疫组化鉴定,获得纯度较高的滋养层细胞,应用HCV阳性且高载量的血清进行体外感染,应用免疫荧光染色检测滋养层细胞中HCV NS5表达,通过细胞裂解液裂解感染后细胞,应用荧光定量PCR（RT-PCR）技术检测感染后细胞培养上清和细胞内的HCV RNA,以观察HCV的感染及复制情况。结果该法分离纯化的滋养层细胞生长良好,特异性角蛋白-7阳性,纯度高。原代滋养层细胞在与HCV阳性血清共同孵育后均未出现明显的细胞病变,感染后48 h在滋养层细胞细胞浆中可见HCV NS5表达,感染后分别于24、48、72、96、120 h收集的培养上清和感染后细胞内均可以检测到HCV RNA。排除了培养洗涤液HCV污染,进一步检测其细胞裂解液中HCV,结果检测HCV阳性。结论利用改良后人胎盘滋养层细胞的体外培养系统,HCV阳性血清能在体外感染原代培养的人滋养层细胞,HCV可在滋养层细胞中复制。     

丙型肝炎病毒细胞模型和动物模型的研究

建立丙型肝炎病毒(HCV)的细胞模型及动物模型,对于深入认识HCV病原学特点、复制及发病机制,筛选有效药物及疫苗等极为重要。近年来,国内外学者作了大量探讨,概括如下。 1 HCV细胞模型的研究 1.1 HCV感染类细胞模型 1.1.1 以肝细胞为宿主的HCV感染细胞模型 众所周知,人肝细胞是HCV感染的天然宿主细胞,以成人肝细胞作为感染HCV的细胞模型应有更好的代表性。Ito等直接将HCV阳性血清与丙肝患者肝活检分离出来的肝细胞共培养,发现肝细胞内和培养上清液中可检出大量HCV RNA,用     

La、hVAP-33、eIF2B γ和HCV IRES特异性小干扰RNA抑制HCV的复制和表达

目的 证实La自身抗原、33kD人类囊相关膜蛋白(hVAP-33)和真核细胞翻译起始因子第3亚单位(eIF2B γ)是HCV在细胞内的协同感染因子,通过抑制Huh7细胞内这些因子的表达可抑制HCV复制和表达. 方法 分别设计合成3条HCV内部核糖体进入位点(IRES)的小干扰RNA(siRNAs),转染Huh7-HCV细胞后筛选出其中沉默效率最高的1条.以HCV假病毒感染Huh7细胞后48 h,分别以上述HCV IRES siRNA和之前试验中已经筛选出的La、hVAP-33和eIF2B γ特异性siRNAs单独或者不同组合转染Huh7-HCV细胞,利用荧光定量PCR方法检测HCV核心基因并计算△△CT值(相对定量法),比较不同siRNAs及组合对目的基因沉默的效率;同时以Western blot观察HCV核心蛋白表达量的差异.结果 La自身抗原与IRES特异性siRNA共转染对HCV表达的抑制效率最高,使HCV核心蛋白基因相对表达量下降了约41％;4种基因特异性siRNAs 对HCV在Huh7细胞中的复制和表达均有不同程度的抑制作用,La、hVAP-33和eIF2Bγ特异性siRNAs分别与IRES siRNA联合均较其单独转染对目的基因的抑制效率高.结论 可以认为La自身抗原、hVAP-33和eIF2Bγ是HCV在宿主细胞内的协同感染因子,通过对Huh7细胞内协同感染因子及HCV IRES基因沉默后可以显著减少HCV的表达.     

丙型肝炎病毒受体研究现状及展望

在HCV感染宿主过程中，病毒首先结合到靶细胞表面，经受体介导进入细胞，然后才能复制、表达病毒蛋白并引起相关的病理变化。因此，HCV宿主细胞表面的受体或辅助受体的研究显得尤为重要。目前难以从感染的血清和组织中分离天然HCV病毒颗粒，此外缺乏有效的体外病毒复制系统和小动物模型，所以，HCV宿主细胞表面受体及HCV感染靶细胞机制仍不太清楚。     

HCV细胞培养系统研究进展

我国丙型肝炎患病率高,目前临床使用干扰素┼利巴韦林治疗,但仅对50%的HCV基因1型患者有效,因此急需有效的治疗方法。由于HCV在被感染组织和血清中浓度较低,且病毒变异高,目前对HCV机制的研究仍处于初级阶段,至今尚未建立可靠、稳定的HCV动物模型及感染细胞系统。如能建立一个有效的体外复制系统,对研究HCV的附着、融合、内吞、入胞、复制、释放和发病机制等有重要意义。本文就近年来国内外出现的HCV体外感染细胞系统的研究新进展进行综述,重点对稳定性较好的HCV体外细胞培养模型和HCV假病毒感染颗粒加以阐述。     

丙型肝炎病毒感染人端粒酶逆转录酶基因转导后细胞的研究

用丙型肝炎病毒阳性血清感染人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因转导后人外周血单个核细胞(PBMC),以 期建立长期存活的HCV体外复制细胞模型。将hTERT基因导入正常人PBMC,丙型肝炎阳性血清直接感染转导后 的细胞,RT-PCR检测细胞内HCV RNA正、负链的表达。hTERT基因转入PBMC内,RT-PCR测定其在mRNA水平 有表达,丙肝阳性血清感染后,检测到细胞内HCV RNA正链持续出现,负链问断出现。hTERT基因转导后的。PBMC, 用丙型肝炎阳性血清感染后,病毒在细胞内持续存在并复制,初步建立了长期存活的HCV体外复制细胞模型。     

重型丙型肝炎患者肝外脏器病毒感染和复制状态

目的 探讨丙型肝炎患者肝外脏器丙型肝炎病毒（HCV）感染和复制状态。方法 采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、原位杂交（ISH）和免疫组织化学法,对9例重型丙型肝炎患者肝外8种脏器内HCV基因、HCV复制中间体和HCV抗原表达进行了研究。结果 采用RT-PCR,9例患者肝外脏器均可检出HCV基因,6例（66.7%）检出HCV复制中间体及HCV抗原;采用ISH和免疫组化法,5例（55.6%）检出HCV基因。除脾脏外,心脏、肾脏、胰腺、肾上腺、肠道、胆囊和淋巴结等脏器细胞内有HCV基因和HCV抗原表达。结论 肝外多种脏器细胞可能支持HCV复制;肝外HCV感染程度低,复制水平低。     

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自丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)发现以来,关于其病毒学的研究不断取得一些进展,这些进展主要依赖于对其分子生物学的研究以及对其相关基因表达产物的研究。而关于HCV的形态还没有取得一致的可重复性的结论。这些HCV病毒学的进展主要在以下几方面与临床有关。1抗HCV药物筛选模型的建立病毒的复制有赖于感染活的宿主细胞,为了建立有效的抗HCV复制药物的细胞筛选模型,迫切需要建立能够允许HCV持续感染并有效复制的细胞系,但HCV RNA感染或转染原代培养的肝细胞、传代非瘤肝细胞系(PH5CH)、肝癌细胞系(Huh7)、逆转录病毒感染…     

丙型肝炎病毒感染细胞模型的实验研究

目的：建立接近体内自然感染状态，并能长期稳定复制的丙型肝炎病毒（HCV）感染细胞模型。方法：在含10％小牛血清的RPMI1 640培养基、37℃、5％ CO2条件下于培养瓶中培养人肝癌细胞株HepG2、SMMC7721及胎肝细胞株L02细胞，L02培养基加胰岛素0．2μ/ml,用HCV阳性血清感染HepG2、SMMC 7721、L02细胞，3株细胞均每隔3d换液，消化、传代1次，连续培养60d，用套式逆转录－聚合酶链反应（nested RT-PCR)检测培养细胞及上清液中正、负链HCV RNA。结果：HepG2、SMMC7721细胞在感染后2－30d,L02细胞在感染后3－30d于细胞中可以间断检出HCV正链RNA；3株细胞的细胞内HCV负链RNA均在感染后3－30d可以间断检出，检出率与正链RNA接近。3株细胞以HepG2细胞中HCV RNA正、负链检出率较高，并在第31－60天仍可间断检出HCV RNA正、负链，但复制程度逐渐减弱。HepG2、SMMC 7721及L02 3株细胞的培养上清液中HCV正链RNA感染后也呈间断阳性，检出率与细胞内正链RNA基因一致。培养上清液中均未检出HCV负链RNA。结论：HepG2、SMMC 7721及L02细胞均对HCV易感，并能支持HCV长期稳定的复制。因此HepG2细胞是较为理想的HCV体外感染细胞模型。     

BMP4是个体化治疗肝脏疾病的一个新靶点

<正>【据《Hepatology》2014年2月报道】题:肝窦内皮细胞旁分泌信号调节HCV复制(作者Rowe IA等)HCV是引起全球肝脏疾病的一个主要因素,它可引起慢性肝损伤,可进一步发展为肝硬化及原发性肝癌。肝脏是由包括肝细胞、肝窦内皮细胞、枯否细胞和胆管上皮细胞等多种细胞组成的大而复杂的器官。肝细胞是HCV复制的主要场所,然而肝脏非实质细胞在HCV复制周期中的作用仍未被探究。肝窦内皮细胞分泌因子可增加HCV的感染,文献研究证实骨形态形成蛋白-4(BMP4)即为内皮细胞表达的一种前病毒分子。重组BMP4促进HCV的复制,中和BMP4后可以终止肝窦内皮细胞介导的前病毒     

HCV治疗的分子学基础（下）

对NSSBRNA依赖性RNA多聚酶的介绍 NS5B基因产物是病毒的RdRP。这种酶是病毒复制中各RNA合成步骤所必需的：与病毒基因组互补的负链RNA中间产物的合成以及与负链中间产物互补的正链RNA基因组的合成。很明显，对这种关键酶活性的抑制会导致HCV在感染细胞中复制的降低。而且，被NS5B催化的酶反应，RNA依赖的RNA合成，是一种通常不在非感染细胞中发生的反应。因此，如果发现这种酶的特异性抑制剂，就能阻断HCV的复制而毒性甚微。     

丙型肝炎病毒感染实验模型的研究新进展

丙型肝炎病毒(HCV)感染是继乙型肝炎病毒之后引起慢性肝炎、肝硬化以及肝细胞癌的又一主要病因.HCV易感宿主选择有限,至今尚不能建立稳定、易行的HCV感染细胞及动物模型系统,使得病毒变异性、复制机制、与宿主蛋白相互作用以及新药与疫苗研发等相关研究受到极大限制.本文就近年来围绕持续稳定的HCV体外细胞或动物感染模型的研究新进展作一综述.     

体外感染实验探讨丙型肝炎病毒的ADE分子机制

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)在感染人滋养层细胞的过程中是否存在抗体依赖性感染增强(ADE)作用,以探讨HCV母婴传播的分子机制。方法将HCV阳性血清以4种不同方式感染人滋养层细胞,以免疫电镜观察HCV病毒颗粒在滋养层细胞中的表达,应用RT-PCR法、免疫组化法检测细胞内外的HCVRNA正链、负链,HCVNS5、NS3及C区抗原。结果在滋养层细胞胞浆内发现了HCV病毒颗粒,HCVRNA正链、负链,HCVNS5、NS3、C区抗原仅在全血清感染细胞内或上清中间断测得。结论HCV可以在滋养层细胞中复制。HCV感染滋养层细胞的过程中存在ADE机制,抗体和补体均参与了HCV的跨膜转运过程。     

小泛素样修饰物特异性蛋白酶3通过调节脂滴水平体外促进HepG2细胞丙型肝炎病毒复制

目的 探究丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞小泛素样修饰物特异性蛋白酶3(SENP3)对脂滴水平的调节及其对HCV复制的影响。方法 以感染性HCV病毒颗粒感染人HepG2细胞,采用Western blot法检测感染前后SENP3蛋白表达水平。采用脂质体法转染SENP3-siRNA至HepG2细胞,在感染HCV后采用Western blot法检测HCV核心蛋白表达量,采用qRT-PCR法检测HCV RNA水平,采用油红O染色观察细胞脂滴水平。以软脂酸处理敲低SENP3后的HepG2细胞,采用qRT-PCR法检测感染HCV后HCV RNA水平。结果 在HCV感染HepG2细胞后1 d、3 d和6 d,HCV 核心蛋白相对表达量分别为0.01±0.00、0.17±0.02和0.43±0.04,SENP3蛋白相对表达量分别为0.23±0.04、0.42±0.03和0.46±0.04,差异显著(P<0.05);转染SENP3-siRNA可有效降低SENP3表达并降低HCV感染后细胞HCV核心蛋白表达水平;SENP3敲低细胞HCV RNA相对水平为54.2±11.4%,较转染非特异性siRNA细胞显著降低(P<0.01);敲低SENP3蛋白表达后细胞脂滴数量显著减少;敲低SENP3的HepG2细胞感染HCV后HCV RNA相对水平为58.2±5.2%,较转染非特异性siRNA细胞显著降低(P<0.01),而以软脂酸处理敲低SENP3的HepG2细胞,在感染HCV后HCV RNA相对水平为74.6±6.4%,较未经软脂酸处理细胞显著升高(P<0.01)。结论 在HCV感染肝细胞时SENP3可通过调节脂滴代谢促进HCV复制。     

丙型肝炎病毒感染离体培养树鼩肝细胞模型初探

本研究以树鼩为研究对象，采用体外两步灌流法分离肝细胞，然后用丙型肝炎病毒（HCV）RNA阳性血清直接感染原代培养的肝细胞，观察树鼩肝细胞对HCV的易感性，旨在建立较为实用的细胞感染模型，为深入研究HCV感染细胞的复制机制提供一定的实验依据。