肝细胞生长因子基因转染对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移的影响

目的:观察HGF基因对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移的影响。方法:从已有质粒pRc/CMV-HGF中扩增出HGF基因,将其克隆到含增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体中,构建重组质粒pEGFP-HGF,酶切及测序鉴定正确后,用脂质体将重组质粒pEGFP-HGF转染到人脐静脉细胞株ECV304中,G418筛选获得稳定表达细胞克隆,采用荧光显微镜观察、RT-PCR、免疫细胞化学方法检测鉴定重组质粒的表达情况;酶联免疫吸附法(ELISA)检测稳定表达细胞中HGF的含量;再以MTT法检测转染重组质粒后细胞增殖的改变,Transwell Migration实验检测细胞迁移能力的改变。结果:所构建重组质粒经酶切图谱分析和序列测定证实构建成功;荧光显微镜下观察到有绿色荧光;RT-PCR证实HGFmRNA在转染阳性细胞高表达;免疫细胞化学证实转染pEGFP-HGF质粒的细胞有HGF蛋白的表达;ELISA检测细胞培养基中HGF含量可达112.3 ng/ml,MTT法、TranswellMigration测定转染pEGFP-HGF阳性细胞的增殖、迁移能力明显高于对照组(P<0.01)。结论:重组质粒pEGFP-HGF能够在内皮细胞株ECV304转录、表达;表达的活性蛋白HGF刺激ECV304的增殖、迁移,为进一步应用于基因治疗奠定实验基础。     

RNA干扰抑制Nogo-A基因表达及对PC12细胞凋亡的影响

为研究Nogo-A基因沉默对细胞凋亡的影响,本文构建了靶向Nogo-A的短发夹样RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体并经脂质体转染到培养的PC12细胞。分别以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹法检测转染48h后Nogo-A mRNA及蛋白表达的变化。在转染后不同时间应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖活性,用原位末端标记(TUNEL)法及流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示:由shRNA产生的小干扰RNA(siRNA)可有效抑制PC12细胞Nogo-A基因的表达。Nogo-A siRNA处理组细胞的增殖活性增加、凋亡率明显下降。本结果提示,Nogo-A基因可能与细胞凋亡有关。     

人源载体介导的minidystrophin-EGFP融合基因在Cos-7细胞中的表达

目的 构建微小肌营养不良蛋白（minidystrophin）和增强绿色荧光蛋白（enhaneed green fluorese protein，EGFP）融合基因的人源载体，观察该载体在Cos-7细胞中的表达。方法 以正常人肌营养不良基因cDNA（GenBank NM_004006）为模板，通过PCR克隆的方法构建minidystrophin基因，融合EGFP基因后连接到人源载体pHmeo，大量提取荸组质粒，转染Cos-7细胞，通过逆转录聚合酶链反应、荧光显微镜观察等方法检测该载体在细胞内的表达。结果 成功构建pHmDysG载体，转染Cos-7后，逆转录聚合酶链反应可扩增出735bp特异条带，荧光显微镜观察可见表达蛋白分布于细胞膜上。结论 prim载体介导的minidystrophin基因可以在真核细胞表达，并被有效地转运至细胞膜，可望用于杜氏肌营养不良基因治疗的研究。     

稳定表达人热休克蛋白22内皮细胞株的构建和鉴定

背景：热休克蛋白22的应激表达可能对缺氧复氧内皮具有一定的保护作用。 目的：建立稳定表达人热休克蛋白22基因的内皮细胞株。 方法：EcoRⅠ/kpnⅠ双酶切鉴定真核表达重组质粒pEGFP-N1-HSP22。脂质体法以重组质粒pEGFP-N1-HSP22转染人脐静脉内皮细胞,G418筛选,获得G418抗性单克隆细胞。用荧光显微镜、RT-PCR及Western-blot检测热休克蛋白22在人脐静脉内皮细胞中的表达。 结果与结论：经双酶切电泳检测重组质粒pEGFP-N1-HSP22符合预期大小片段。稳定转染的单克隆人脐静脉内皮细胞中,荧光显微镜观察到每个细胞均有绿色荧光蛋白表达,RT-PCR和Western-blot检测到热休克蛋白22mRNA和蛋白表达。说明成功获得稳定表达人热休克蛋白22基因的内皮细胞株。     

RNA干扰抑制Nogo-A基因表达对PC12细胞多巴胺释放的影响

目的 研究Nogo-A基因沉默对PC12细胞多巴胺释放的影响.方法 构建靶向Nogo-A的短发夹样RNA(shRNA)真核表达载体,并经脂质体转染PC12细胞,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹法检测对Nogo-A mRNA及蛋白的抑制效应.采用高效液相色谱仪(HPLC)检测转染前后多巴胺释放的变化.结果 将重组质粒转染到PC12细胞48h后,Nogo-A基因表达明显受抑、多巴胺释放量减少.结论 Nogo-A可能参与PC12细胞多巴胺的释放.     

Caspase 9及其相关分子基因表达水平改变对同型半胱氨酸内皮凋亡的影响

目的 了解caspase 3信号传导通路中上游分子Bcl 2、细胞色素c（cytochrome-c）、caspase 9在同型半胱氨酸作用下的人脐静脉血管内皮细胞内的mRNA及蛋白表达水平的改变，揭示线粒体参与信号传导链在caspase 3所介导的内皮细胞凋亡过程中的作用。方法 培养人脐静脉内皮细胞，用不同浓度同型半胱氨酸作用于细胞后，用逆转录-聚合酶链反应及Western印迹分别检测各分子基因及蛋白表达水平的改变。结果 Bcl 2、cytochrome-c和caspase 9在同型半胱氨酸作用下mRNA及蛋白表达水平下降，并且随同型半胱氨酸浓度的升高而降低。结论 Bcl 2可能参与了同型半胱氨酸促进细胞凋亡的信号传导途径。Caspase 3没有通过上游分子apoptosome和caspase 9途径活化。这些研究结果提示，同型半胱氨酸诱导细胞凋亡并不是通过以线粒体凋亡通路为主的信号传导通路。     

siRNA表达载体稳定沉默肺癌A549细胞MEKK3基因的细胞株建立

目的 构建人MEKK3基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体并建立稳定沉默MEKK3基因表达的肺癌A549细胞克隆株.方法 设计并合成针对人MEKK3基因4个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,以BamH Ⅰ及Hind Ⅲ酶切位点分别克隆入pSilencer 4.1-CMV hygro载体,测序鉴定后以脂质体分别转染人A549细胞,Western印迹检测它们对MEKK3表达的抑制,并选择抑制效率最高的表达载体转染入A549细胞,潮霉素筛选后获得含该载体的抗性细胞克隆株,荧光实时定量PCR检测该细胞克隆株中MEKK3表达抑制.结果 测序鉴定表明4个MEKK3 siRNA表达载体正确无误;Western印迹结果显示对MEKK3的表达有抑制作用,其中pSilencer4.1-MEKK3 siRNA2的抑制率达84%;荧光实时定量PCR结果表明,pSilencer4.1-MEKK3 siRNA2可稳定沉默MEKK3 mRNA的表达,有效率达83%.结论 成功地构建了针对人MEKK3基因的siRNA表达载体,并成功地建立了能高效且稳定地沉默MEKK3基因表达的肺癌A549细胞克隆株.     

重组人促红细胞生成素对人脐静脉内皮细胞HoxB2及HoxD3 mRNA表达影响

目的研究重组人促红细胞生成素(rHuEPO)调节体外培养内皮细胞参与血管生成机制。方法从人脐静脉体外分离培养内皮细胞(HUVEC),采用形态学观察及血管内皮细胞Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ-R Ag)免疫组织化学方法检测进行内皮细胞鉴定,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测HUVEC同源盒HoxB2及HoxD3基因mRNA表达变化。结果与对照组比较,rHuEPO可明显上调内皮细胞HoxB2及HoxD3 mRNA表达水平,差异有统计学意义(P0.05)。结论 rHuEPO可调节内皮细胞HoxB2及HoxD3 mRNA表达,这种调节作用可能是其促血管生成的主要原因之一。     

Beclin1 基因慢病毒表达载体的构建和鉴定

背景：Beclin1基因是哺乳动物的自噬调控基因。 目的：实验拟构建Beclin1 基因慢病毒过表达载体。 方法：聚合酶链反应扩增目的基因Beclin1 后插入慢病毒表达载体pLenex中,构建重组载体pLenex-Beclin1。使用聚合酶链反应、双酶切和DNA的测序方法对其进行鉴定,并与辅助包装质粒共感染293T细胞。慢病毒颗粒转染非小细胞肺癌A549细胞后,用蛋白质印迹法检测Beclin1 基因的过表达效率。 结果与结论：聚合酶链反应鉴定结果显示扩增的阳性片段已插入pLenex载体,聚合酶链反应、双酶切和DNA测序结果表明,重组慢病毒载体pLenex-Beclin1 的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染A549细胞后,细胞内Beclin1蛋白高效表达。结果证实,实验成功构建了Beclin1 基因慢病毒过表达载体。     

t-PA基因新型真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)基因的新型真核表达载体,为血栓性疾病的基因治疗奠定基础。方法将tPA基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1MycHisB()中,进行酶切鉴定及DNA测序分析,并将携带有tPA基因的该真核表达载体,通过脂质体介导,转染鼠血管平滑肌细胞,底物发色法测定转基因血管平滑肌细胞tPA活性。结果经双酶切鉴定和测序证实已将tPA基因DNA片段正确插入到真核表达载体中,并能在真核细胞中表达、分泌有活性的tPA。结论成功构建pcDNA3.1MycHisB()/tPA基因新型真核表达载体。     

小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2对NIH3T3细胞增殖的影响

目的:研究新发现的小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2对小鼠NIH3T3细胞生物学行为的影响,探讨基因的生物学功能。方法:构建真核表达质粒pcDNA3.1( )-Biot2,由脂质体包裹稳定转染NIH3T3细胞,用Realtime RT-PCR、Western blot等方法筛选和鉴定Biot2表达阳性细胞克隆,研究其与细胞增殖相关的生物学特征的变化。结果:成功构建真核表达重组质粒pcDNA3.1( )-Biot2,并稳定转染于NIH3T3细胞。与对照组相比,转染了Biot2cDNA的NIH3T3细胞生长速率明显增快。结论:成功地建立稳定转染小鼠新基因Biot2的NIH3T3细胞克隆;Biot2基因能影响细胞增殖的调节,促进NIH3T3细胞的增殖,为进一步研究基因生物学功能奠定了基础。     

NNMT真核表达载体的构建并转染SMMC7721肝癌细胞株

目的构建peDNA3．1（-）／NNMT（尼克酰胺-N-甲基化酶）真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC7721中。方法采用PCR法从PGEX4T-1／NNMT重组质粒中克隆得到NNMT cDNA全长序列,并将扩增的eDNA片段与pMD19-T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（-）中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC7721,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用RT—PCR检测转染前后该细胞株NNMT基因的mRNA表达水平。结果真核表达载体构建成功．经RT-PCR检测,重组质粒转染株的NNMT基因mRNA表达水平高于对照组,证实NNMT基因已经稳定转染到SMMC7721细胞中并得到表达。结论成功建立了人基因NNMT的稳定转染细胞株,为进一步研究NNMT的功能奠定了基础。     

真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

背景：阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于?-淀粉样多肽的异常。  目的：构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株。 方法：采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞(SH-SY5Y)的总cDNA中,扩增出约1.0 kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达。 结果与结论：人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株。     

鼠β-防御素2(mBD2)真核表达质粒的构建及稳定表达株的鉴定

目的：对小鼠β防御素-2（mBD2）基因进行克隆,构建其真核表达载体,筛选出稳定表达细胞株,并研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤机制。方法：通过向BALB/c小鼠腹腔注射内毒素（LPS）,建立小鼠急性时相反应,取其肺组织提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增小鼠mBD2基因,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后插入相同酶切的pcDNA3.1（＋）真核表达载体,对其进行酶切和测序鉴定。将构建好的真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/mBD2转染SiHa细胞,采用G418进行稳定表达株的筛选,用免疫荧光染色和RT-PCR鉴定细胞内mBD2蛋白表达情况。结果：提取小鼠肺组织总RNA,采用RT-PCR方法扩增了250bp左右的产物,通过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,构建了真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/mBD2。SiHa被该质粒转染后,在100mg/LG418浓度下筛选20d,得到了稳定表达mBD2的细胞株,用免疫荧光染色显示mBD2蛋白在胞质中有大量表达,RT-PCR反应扩增到了mBD2的mRNA。结论：成功地构建了pcDNA3.1（＋）/mBD2真核表达质粒,mBD2蛋白在SiHa细胞中能稳定表达,这些结果为进一步深入研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤的作用奠定了基础。     

pcDNA3.1/NF-κB(p65)表达载体的构建及蛋白表达

目的克隆NF-κB(p65)基因,构建真核表达载体pcDNA3.1/NF-κB(p65),并进行体外表达研究。方法提取B16总RNA,RT-PCR扩增出NF-κB(p65)基因片段,并将其克隆到pcDNA3.1载体中进行序列分析,转染到B16细胞中,Real-time PCR和Western-blot检测NF-κB(p65)的抗原性和表达量。结果获得高质量的B16总RNA,RT-PCR扩增出1.65kb的cDNA片段,成功构建了pcDNA3.1/NF-κB(p65)载体,Blast序列分析与GenBank中NM_009045.4完全一致。NF-κB(p65)重组蛋白具有抗原性,其基因和蛋白表达高于B16细胞组和空质粒pcDNA3.1组。结论成功构建pcDNA3.1/NF-κB(p65)表达载体和表达出具有NF-κB(p65)抗原性的重组蛋白。     

雌激素受体2对前列腺癌细胞系PC-3M增殖的影响

目的： 构建带有人雌激素受体2（ESR2）全长cDNA的重组质粒pcDNA3.1-hERβ,转染人前列腺癌PC-3M细胞株,观察ESR2对细胞增殖能力的影响。 方法：RT-PCR方法从人正常卵巢组织中获取ESR2全长cDNA,利用基因重组技术与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建重组质粒pcDNA3.1-hERβ;瞬时转染前列腺癌PC-3M细胞株,应用细胞计数、MTT法及流式细胞术检测细胞增殖能力的改变;半定量RT-PCR法及Western blotting法分别检测增殖相关基因cyclinD1和 P21Cip1 mRNA及蛋白表达。 结果：DNA测序结果显示扩增的ESR2序列与GenBank（NM_001437）所公布的序列完全一致。重组质粒pcDNA3.1-hERβ瞬时转染人PC-3M细胞48 h后,与质粒对照组相比：RT-PCR法及Western blotting法显示,ESR2基因在mRNA水平和蛋白水平的表达均明显增加;细胞计数及MTT结果发现,细胞数目减少,细胞增殖活性下降（P<0.01）;流式细胞实验显示,G0/G1期细胞比例增加（P<0.05）,S期及G2/M期细胞比例减少（P<0.05）;RT-PCR及Western blotting结果还发现cyclinD1的表达减弱,而P21Cip1的表达增强。 结论：成功构建pcDNA3.1-hERβ重组质粒;带有ESR2全长基因的重组质粒转染PC-3M细胞后,细胞的增殖活性受到抑制;RSR2可能通过影响细胞增殖相关基因cyclinD1和 P21Cip1的表达抑制细胞的增殖。     

人α-防御素-1(α-HNP-1)基因真核表达载体的构建及在大鼠骨髓间充质干细胞中的转染表达

目的构建人α-防御素-1(α-HNP-1)基因的真核表达载体,并且转染大鼠骨髓间充质干细胞。方法提取人外周血粒细胞中的总RNA,反转录为cDNA作为模板,采用PCR的方法扩增得到人α-防御素-1(α-HNP-1)的基因片断。将扩增产物连接入pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,蓝白筛选,对PCR及酶切鉴定含有目的片断的克隆进行测序。经测序证实无误后,将获得的pGEM-T-HNP-1重组质粒上的α-HNP-1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)上,构建HNP-1的真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1。将真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1用脂质体法转染原代大鼠骨髓间充质干细胞,用免疫组化法检测α-HNP-1的表达。结果获得预期大小为303bp的RT-PCR产物;经PCR、酶切鉴定和DNA测序分析证实重组质粒载体pcDNA3.1-HNP-1构建正确;免疫组化法显示转染细胞呈阳性反应。结论成功构建HNP-1基因的真核表达载体,并且在大鼠骨髓间充质干细胞中能成功表达。     

小鼠白细胞介素21 cDNA的克隆及真核表达质粒的构建

目的：克隆小鼠自细胞介素2l(IL-21)基因，构建真核表达质粒，用以进行肿瘤的基因治疗。方法：用RT-PCR法。从ConA活化的小鼠T细胞中扩增IL-21 cDNA。克隆人哺乳动物细胞高效表达质粒pcDNA3．1中，构建重组mIL-21真核表达质粒。重组体用载体上的通用引物和PCR下游引物为测序引物，鉴定克隆的正确性。将已鉴定的重组质粒用脂质体法转染Sp2／0细胞，用RT-PCR法鉴定转染细胞中IL-21基因的表达，用MTT比色法检测表达的mIL-21诱导的NK细胞杀伤活性的增强。结果：正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1／mIL-21，并在转染的细胞中检测出IL-2l的表达，表达的mIL-21可在体外增强NK细胞的杀伤活性：结论：成功地构建了重组真核表达质粒pcDNA3．1／mIL-21，为进一步在肿瘤动物模型中进行IL-21基因治疗及疗效观察奠定了基础.