磷脂酰肌醇3激酶对TNF-α诱导的大鼠气道平滑肌细胞增殖、凋亡和转化生长因子β1表达的影响

目的 探讨磷脂酰肌醇3激酶（PI3-K）对TNF-α诱导的大鼠气道平滑肌细胞（ASMC）增殖、凋亡和转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响.方法 以肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及PI3-K特异性抑制剂wortmannin作为工具药,分别将TNF-α、TNF-α＋wortmannin接种ASMC,置37℃,5%CO2培养箱中培养.逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测PI3-Kp85α、TGF-β1 mRNA表达,免疫细胞化学染色法检测PI3-Kp85α、PCNA、Bcl-2蛋白表达及定位,Sandwich ELISA检测NF-κB活性,四甲基偶氮唑蓝（MTT）微量比色法测定ASMC增殖,AnnexinV/PI双标记流式细胞仪分析法检测细胞凋亡,ELISA测定TGF-β1蛋白质含量.结果 （1）培养的ASMC PI3-K p85α的阳性定位在胞浆.TNF-α组ASMC PI3-Kp85α mRNA及蛋白表达水平均显著高于对照组及TNF-α＋wortmannin组（P＜0.01）;（2）TNF-α组ASMCNF-κB活性与对照组相比显著增高（P＜0.01）,TNF-α＋wortmannin组NF-κB活性与TNF-α组相比显著降低（P＜0.01）;（3）TNF-α组ASMC的增殖反应与对照组及TNF-α＋wortmannin组相比显著增加（P＜0.01）;TNF-α组细胞凋亡率与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）,TNF-α＋wortmannin组细胞凋亡率显著高于TNF-α组及对照组（P＜0.01）.（4）TNF-α组ASMC的PCNA、Bcl-2蛋白表达量均显著高于对照组及TNF-α＋wortmannin组（P＜0.01）;（5）TNF-α组ASMC的TGF-β1的mRNA表达水平、培养液上清TGF-β1的蛋白质含量均显著高于对照组及TNF-α＋wortmannin组（P＜0.01）.结论 PI3-K可能参与调控TNF-α诱导的大鼠气道平滑肌细胞的增殖、凋亡及TGF-β1的表达和分泌,NF-κB作为PI3-K的下游信号参与此过程.     

核因子-κB对TNF-α诱导的大鼠气道平滑肌细胞增殖、凋亡及TGF-β1表达的影响

目的: 探讨核因子-κB(NF-κB)对TNF-α诱导的大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖、凋亡和转化生长因子β₁（TGF-β₁）表达的影响。方法: 体外培养ASMCs，以肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及NF-κB特异性抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)作为工具药,将ASMCs分为对照组、TNF-α组和TNF-α+PDTC组。逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测TGF-β₁ mRNA表达，Western blotting检测NF-κB、TGF-β₁的表达，免疫细胞化学染色法检测PCNA、Bcl-2蛋白表达及定位，四甲基偶氮唑蓝(MTT)微量比色法测定ASMCs增殖，Annexin V/PI双标记流式细胞仪分析法检测细胞凋亡。结果: （1）TNF-α组ASMCs的NF-κB活性显著高于对照组(P<0.01),TNF-α+PDTC组NF-κB活性显著低于TNF-α组 (P<0.01)。（2）TNF-α组ASMCs增殖显著高于对照组(P<0.01),TNF-α＋PDTC组的增殖反应显著低于TNF-α组(P<0.01)；TNF-α+PDTC组细胞凋亡率显著高于TNF-α组及对照组(P<0.01)。（3）TNF-α组ASMCs的PCNA、Bcl-2蛋白表达量均显著高于对照组(P<0.01)，TNF-α+PDTC组的PCNA、Bcl-2蛋白表达量均显著低于TNF-α组(P<0.01)。（4）TNF-α组ASMCs的TGF-β₁的mRNA及蛋白表达水平均显著高于对照组及TNF-α＋PDTC组（P<0.01）。结论: NF-κB活化可能参与调控TNF-α诱导的大鼠气道平滑肌细胞的增殖、凋亡及TGF-β₁的表达和分泌。     

五味子多糖对TGF-β1诱导的人肾小球系膜细胞炎症因子和细胞外基质FN和COLⅠ表达的影响

目的：探讨五味子多糖（SCP）对TGF-β1诱导的人肾小球系膜细胞炎症因子和细胞基质（ECM）表达的影响。方法：体外培养人肾小球系膜细胞，采用4 ng/ml TGF-β1诱导人肾小球系膜细胞构建系膜增生性肾炎细胞模型，分为正常对照（Con）组、模型（TGF-β1）组、SCP低、中、高浓度（SCP-L、SCP-M、SCP-H）组，MTT检测细胞增殖活性，ELISA检测炎症细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)含量，qRT-PCR和Western blot分析纤连蛋白（FN）和Ⅰ型胶原蛋白（COLⅠ）表达，Western blot评估TLR4/NF-κB信号传导途径关键蛋白表达。结果：与Con组相比，TGF-β1组细胞增殖活性明显升高，IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1含量明显升高，FN、COLⅠ、Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子（MyD88）和磷酸化核因子-κB p65(p-NF-κB p65)表达明显上调（P<0.05）；与TGF-β1组相比，不同浓度SCP干预均能够抑制细胞增殖活性，降低IL-6、IL-1β、TNF-α和M...     

三七总皂苷对马兜铃酸I诱导的人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的：探讨三七总皂苷（total saponins of panax notoginseng, PNS）对马兜铃酸I（aristolochic acid I,AAI）诱导的人肾小管上皮细胞株HK-2转分化的影响。方法：应用倒置相差显微镜观察HK-2细胞形态学变化；免疫组织化学方法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）的表达；ELISA法测定培养细胞上清液中转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）的含量。结果：AA I诱导组HK-2细胞从原有典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞形态；胞浆内大量表达α-SMA，其积分光密度值增加（P<0.05）；细胞培养上清液中TGF-β1含量均增加，且呈时间依赖性（P<0.05）。不同剂量PNS治疗可减轻AA I诱导的细胞形态学改变，不同程度的抑制α-SMA的表达和TGF-β1的分泌，且呈剂量依赖性（P<0.05）。PNS对照组HK-2细胞形态学、α-SMA表达和TGF-β1分泌与空白对照组比较均无明显变化。结论：AA I可通过促进TGF-β1的分泌诱导肾小管上皮细胞转分化，促进细胞外基质α-SMA的合成；PNS可抑制AA I诱导的肾小管上皮细胞转分化作用，减少α-SMA的表达，该作用可能是通过抑制TGF-β1表达实现的。     

结缔组织生长因子在转化生长因子β诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用

目的：探讨结缔组织生长因子（CTGF）在转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的肾小管上皮细胞表型转化中的可能作用。方法： 将NRK52E肾小管上皮细胞分组处理，光镜、扫描电镜、透射电镜观察细胞形态的改变，细胞免疫组化检测ɑ-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和细胞角蛋白-18的表达，RT-PCR和Western blot检测Ⅰ型胶原的表达。 结果：TGF-β1 10 μg/L作用3 d，NRK52E小管上皮细胞失去正常的椭圆形，变得肥大，胞体拉长，扫描电镜下，见成纤维细胞状，失去上皮细胞特有的顶端-基底极性和表面的微绒毛结构，透射电镜下胞浆中见到微丝和致密体结构，骨架标志上肾小管上皮细胞较具特征性的细胞角蛋白-18表达减少,肌成纤维细胞标志性的α-SMA表达增多，Ⅰ型胶原分泌增多；加入TGF-β1中和抗体和CTGF反义寡核苷酸可以大部分阻断TGF-β的作用，而正义的CTGF寡核苷酸不能阻断TGF-β的作用。 结论： NRK52E细胞中，CTGF作为TGF-β的下游效应因子，介导了TGF-β诱导的肾小管上皮细胞转分化。     

锌离子对TGF-β1诱导的大鼠腹膜间皮细胞转分化的影响

目的研究锌离子对转化生长因子(TGF-β1)诱导的大鼠腹膜间皮细胞(RPMC)转分化的影响,从而为锌离子在腹膜透析中的应用提供理论基础。方法胰蛋白酶消化法原代培养腹膜间皮细胞、传代、经鉴定后分组:正常对照组,TGF-β1(10ng/ml作用48h),ZnSO4作用组(30μMZnSO4作用24h,再加10ng/mlTGF-β1作用48h)。采用相差显微镜观察各组细胞表型改变。应用免疫荧光、western blot方法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、上皮钙黏素(E-cadherin)、Ⅰ型胶原酶(collagenI)蛋白表达。结果 TGF-β1培养48h后细胞形态由典型的上皮逐渐变为梭形及不规则形,类似肌成纤维细胞,而ZnSO4作用组细胞形态改变明显减轻。α-SMA在正常组细胞存在少量表达,TGF-β1组荧光强度明显增强,而ZnSO4作用组荧光强度明显低于TGF-β1组。与对照组相比,TGF-β1组RPMC的α-SMA、collagenI蛋白表达明显升高,而E-cadherin蛋白表达降低。与TGF-β1组相比,ZnSO组RPMC的α-SMA、collagenI表达明显降低、E-cadherin蛋白表达增多。结论 4ZnSO4可逆转TGF-β1所致的RPMC的转分化,对腹膜透析过程中所导致的RPMC损伤具有保护作用。     

银杏素调节TGF-β1/Smad通路对ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤的影响

目的 探讨银杏素调节转化生长因子-β1(TGF-β1)/Smad信号通路对ox-LDL诱导血管内皮细胞损伤的影响。方法 将人脐静脉血管内皮细胞HUVEC分为对照组（未处理的HUVEC细胞）、模型组（50μg/mL ox-LDL处理的HUVEC细胞）、银杏素组（50μg/mL ox-LDL+12.5μmol/L银杏素处理HUVEC细胞）、SRI-011381组（50μg/mL ox-LDL+10μmol/L的TGF-β1/Smad激活剂SRI-011381处理HUVEC细胞）、银杏素+SRI-011381组（50μg/mL ox-LDL+12.5μmol/L银杏素+10μmol/L的SRI-011381共同处理HUVEC细胞）。ELISA试剂盒检测HUVEC细胞丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、IL-6、IL-1β、TNF-α水平;CCK-8法检测HUVEC细胞增殖;流式细胞术检测HUVEC细胞凋亡率;Western blot检测细胞上皮间质转化（EMT）、TGF-β1/Smad通路相关蛋白表达。结果 与对照组相比,模型组IL-1β、IL-6、TNF-α、M...     

前列腺素E2抑制转化生长因子-β1诱导的人胚肺成纤维细胞转分化及胶原合成

目的：研究前列腺素E₂（PGE₂）对转化生长因子-β₁（TGF-β₁） 诱导人胚肺成纤维细胞（HLF）转分化及促胶原(COL)合成作用的干预。方法： HLF 细胞生长至融合后分为 ①对照组、②TGF-β₁组、③TGF-β₁+PGE₂组、④TGF-β₁+吲哚美辛组，给予干预24 h后用细胞免疫荧光及Western blotting法观察发生转分化为肌成纤维细胞的标志蛋白 α-平滑肌动蛋白（α-SMA）的表达，用RT-PCR法检测结缔组织生长因子（CTGF）mRNA和Ⅰ型胶原（COLⅠ）mRNA的水平，用免疫细胞化学法检测CTGF蛋白表达，比色法检测培养上清中羟脯氨酸含量。结果: TGF-β₁ 可将HLF转分化为 α-SMA 阳性表达的肌成纤维细胞，PGE₂则能抑制这种转分化作用；PGE₂ 可显著减低TGF-β₁ 致肌成纤维细胞、CTGFmRNA与蛋白水平（P<0.05）和COLⅠmRNA 水平升高（P<0.05）； 吲哚美辛升高TGF-β₁ 致HLF肌成纤维细胞CTGF与COLⅠ的表达； 放线菌酮预处理肌成纤维细胞3 h后再加入TGF-β₁＋PGE₂，其COLⅠmRNA 水平明显低于TGF-β₁ 处理组水平（P<0.05）。结论: PGE₂可抑制TGF-β₁ 对成纤维细胞的转分化及促胶原合成作用, 且可通过依赖CTGF和非依赖2种方式下调COLⅠ的转录。     

内外源性结缔组织生长因子对肾小管上皮细胞胶原合成的比较研究

目的：探讨内外源性结缔组织生长因子（CTGF）对人肾小管上皮细胞（HK2）胶原合成的作用。方法：将HK2细胞分为5组：（1）对照组；（2）TGF-β₁ 5 μg/L刺激组；（3）CTGF 5 μg/L刺激组；（4）TGF-β₁ 5 μg/L刺激＋CTGF反义ODN 3 mmol/L干预组；（5）TGF-β₁ 5 μg/L刺激＋CTGF正义ODN 3 mmol/L干预组。采用 RT-PCR 和Western blotting检测胶原Iα₁（Col Iα₁）、胶原IVα₁（Col IVα₁） mRNA水平和蛋白水平表达。 结果：TGF-β₁刺激可使HK2细胞Col Iα₁、Col IVα₁ mRNA和蛋白表达显著升高，而CTGF刺激则无此作用，CTGF反义ODN可拮抗TGF-β₁刺激引起Col Iα₁、Col IVα₁ mRNA和蛋白表达升高，正义ODN无拮抗作用。 结论：内源性CTGF介导了TGF-β₁刺激引起的HK2细胞胶原合成，外源性CTGF对HK2细胞胶原合成无影响。     

A20重组蛋白通过NF-κB/TGF-β1/CTGF信号通路抑制哮喘小鼠气道重构的初步实验研究

目的探讨A20重组蛋白对支气管哮喘小鼠气道重构及NF-κB信号通路的影响。方法 40只雄性清洁级Balb/c小鼠,随机数字表法分为4组,每组10只,分别为:生理盐水对照组;卵蛋白(OVA)哮喘组;A20重组蛋白治疗3 d组;A20重组蛋白治疗7 d组。在末次激发24 h后所有小鼠取左肺组织行苏木精-伊红(HE)染色及PAS染色。取右肺组织分别用酶联免疫吸附法(ELISA),RT-PCR和Western blote检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-4、IL-5、TNF-α及IFN-γ含量以及肺组织中结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)、转化生长因子-β1(trailsforming growth factor-β1,TGF-β1)的mRNA表达和核转录因子(nuclear factor kappa B,NF-κB)的表达。结果哮喘模型组小鼠与对照组相比较BALF中炎症细胞计数、IL-4、IL-5、TNF-α水平增高,而IFN-γ水平降低;肺组织CTGF、TGF-β1的转录和表达水平以及NF-κB表达水平均显著高于对照组(P<0.01)。A20重组蛋白3 d和7 d干预组小鼠与哮喘模型组相比较BALF中炎症细胞计数、IL-4、IL-5、TNF-α水平,CTGF、TGF-β1的转录和表达水平,NF-κB表达水平均显著降低,而BALF中IFN-γ水平明显上升,具有显著差异(P<0.05),但2个不同治疗组之间上述各指标间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 A20重组蛋白可抑制哮喘小鼠气道重构的发生,其机制有可能是通过抑制NF-κB/TGF-β1/CTGF信号通路而实现的。     

Smad交互蛋白1在增生性瘢痕组织中的表达及其对纤维化相关因子的影响

目的研究Smad交互蛋白1（SIP1）在人增生性瘢痕组织中的表达及其对纤维化相关因子的影响。方法收集临床整形手术切取的9例患者增生性瘢痕标本及其自体正常皮肤标本。分离培养原代人增生性瘢痕成纤维细胞（HSFBs）,取第3-5代细胞用于实验。（1）免疫组织化学法检测增生性瘢痕组织标本及其自体正常皮肤组织标本中SIP1的表达情况。（2）真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/SIP1转染HSFBs。按照随机数字表法将细胞分为6组：对照组;pcDNA3.1（＋）组（空载体组）;pcDNA3.1（＋）/SIP1组;对照＋TGF-β1组;pcDNA3.1（＋）＋TGF-β1组;pcDNA3.1（＋）/SIP1＋TGF-β1组。于转染后第48 h和72 h分别提取细胞总RNA和细胞总蛋白。应用实时荧光定量PCR法检测各组细胞α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及结缔组织生长因子（CTGF）的mRNA表达水平;采用Western-blotting检测α-SMA的蛋白表达水平。结果 （1）免疫组织化学染色结果显示：增生性瘢痕组织中SIP1表达明显低于自体正常皮肤组织。（2）pcDNA3.1（＋）/SIP1转染HSFBs后纤维化相关因子的表达：①α-SMA的mRNA和蛋白表达水平：与对照组和pcDNA3.1（＋）组相比,pcDNA3.1（＋）/SIP1组在mRNA和蛋白表达水平均显著下调,差异有统计学意义（P〈0.05）。当细胞给予TGF-β1刺激后,各组α-SMA表达均上调,但pcDNA3.1（＋）/SIP1＋TGF-β1组mRNA和蛋白表达水仍低于对照＋TGF-β1组,差异有统计学意义（P〈0.05）。②CTGF的mRNA表达水平：与对照组和pcDNA3.1（＋）组相比,pcDNA3.1（＋）/SIP1组在mRNA表达水平显著下调,差异有统计学意义（P〈0.05）。当细胞给予TGF-β1刺激后,各组CTGF表达均显著上调,但pcDNA3.1（＋）/SIP1＋TGF-β1组mRNA表达水仍低于对照＋TGF-β1组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论与正常皮肤组织相比较,SIP1在增生性瘢痕组织中低表达。SIP1基因转染HSFBs可降低纤维化相关因?     

莪术醇通过上调miR-214抑制TGF-β诱导的RL-95细胞生长及纤维化相关蛋白表达

目的:探讨莪术醇对转化生长因子β(TGF-β)诱导的子宫内膜癌RL-95细胞生长及纤维化相关蛋白表达的影响,并探讨其机制是否与调控微小RNA-214(miR-214)表达有关。方法:以TGF-β诱导RL-95细胞纤维化作为子宫内膜异位症细胞模型。设置对照(control)组、TGF-β组、TGF-β+低剂量莪术醇组、TGF-β+中剂量莪术醇组、TGF-β+高剂量莪术醇组、TGF-β+高剂量莪术醇+anti-miR-NC组和TGF-β+高剂量莪术醇+anti-miR-214组。运用CCK-8法、流式细胞术、RT-qPCR和Western blot检测细胞活力、细胞周期分布、miR-214表达以及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原(Col I)蛋白表达。结果:与control组比较,TGF-β组RL-95细胞活力、S期细胞比例及α-SMA和Col I蛋白表达显著升高,G₀-G₁期细胞比例和miR-214表达显著降低(P<0.05)。与TGF-β组比较,TGF-β+中剂量莪术醇组和TGF-β+高剂量莪术醇组RL-95细胞活力、S期细胞比例及α-SMA和Col I蛋白表达显著降低,G₀-G₁期细胞比例和miR-214表达显著升高(P<0.05)。与TGF-β+高剂量莪术醇+anti-miR-NC组比较,TGF-β+高剂量莪术醇+anti-miR-214组RL-95细胞活力、S期细胞比例及α-SMA和Col I蛋白表达显著升高,G₀-G₁期细胞比例显著降低(P<0.05)。结论:莪术醇通过上调miR-214表达抑制TGF-β诱导的RL-95细胞生长和纤维化相关蛋白表达,进而对子宫内膜异位症纤维化具有潜在治疗作用。     

丹参素对TGF-β1诱导的肝星状细胞增殖与活化的影响

目的:观察丹参素对转化生长因子-β1(TGFβ-1)诱导的肝星状细胞(HSCs)增殖与活化的影响。方法:体外分离培养大鼠HSCs,细胞分为4组:对照组、TGFβ-1组、TGFβ-1+丹参素组及丹参素组。MTT法检测HSCs增殖情况;细胞免疫化学法分析各组HSCs表达结缔组织生长因子(CTGF)及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的变化。结果:与对照组比较,TGFβ-1无明显促进HSCs增殖的作用,TGFβ-1+丹参素组及丹参素组均促进HSCs增殖(P<0.05)。与对照组比较,TGF-β1能明显促进HSCs表达CTGF和α-SMA,丹参素单独作用降低CTGF和α-SMA的表达;TGFβ-1+丹参素组CTGF和α-SMA的表达低于TGFβ-1组。结论:丹参素对HSCs的增殖有抑制作用,且部分抑制TGFβ-1诱导的HSCs活化。     

1,25（OH）2D3对甲状旁腺素诱导的肾小管上皮细胞转分化和TGF-β1的表达的影响

目的:探讨1,25(OH)2D3对甲状旁腺素(PTH)诱导的肾小管上皮细胞转分化和转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响。方法:人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)培养在含50 mL/L FCS的DMEM/F12培养液中。对照组:加入等体积含50 mL/L FCS的DMEM/F12培养液;PTH刺激组:加入终浓度为10-10 mol/L PTH的含50 mL/L FCS的DMEM/F12培养液;PTH+1,25(OH)2D3干预组:加入10-10 mol/L PTH,同时加入不同浓度(10-10、10-9、10-8、10-7 mol/L)的1,25(OH)2D3。刺激HK-2细胞48 h。半定量RT-PCR法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和TGF-β1的基因表达;Western blot法检测细胞中α-SMA和TGF-β1的蛋白表达;免疫细胞化学法检测细胞中α-SMA的表达;ELISA法检测细胞培养上清液中TGF-β1的含量。结果:半定量RT-PCR结果显示,对照组HK-2细胞中几乎无α-SMA的mRNA表达,仅有少量的TGF-β1 mRNA表达;PTH刺激组α-SMA和TGF-β1mRNA表达量与对照组比较明显增加;PTH+1,25(OH)2D3干预组表达量比PTH刺激组显著降低,且随着1,25(OH)2D3浓度的升高呈一定的剂量依赖性(P<0.05)。Western blot结果显示,对照组HK-2细胞中无α-SMA的蛋白表达,仅有少量的TGF-β1蛋白表达;10-10 mol/L的PTH能够明显诱导HK-2细胞中α-SMA的蛋白表达,增加TGF-β1的蛋白表达量;PTH+1,25(OH)2D3干预组,α-SMA和TGF-β1的蛋白表达量比PTH刺激组显著降低(P<0.05)。免疫细胞化学法结果显示,对照组几乎无α-SMA阳性表达的细胞,PTH刺激组可见大量细胞α-SMA表达阳性;PTH+1,25(OH)2D3干预组α-SMA表达阳性的细胞数明显低于PTH刺激组(P<0.05)。ELISA结果显示,对照组细胞上清液中可检测到少量的TGF-β1,PTH刺激组含量显著升高,PTH+1,25(OH)2D3干预组与PTH刺激组比较含量明显降低(P<0.05)。结论:1,25(OH)2D3能够部分拮抗PTH诱导的HK-2细胞转分化和TGF-β1的表达。     

敲低金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP-1)抑制TGF-β1诱导的MRC-5人胚肺成纤维细胞增殖和胶原蛋白合成

目的探讨敲低金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP-1)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的MRC-5人胚肺成纤维细胞生长的影响。方法将MRC-5细胞分为空白组、 TGF-β1组、转染阴性对照小干涉RNA的TGF-β1组和转染TIMP-1小干涉RNA(siTIMP-1)的TGF-β1组。噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期分布, ELISA检测上清液肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量, Western blot法检测TIMP-1、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、 1型胶原蛋白(Col1)和β联蛋白(β-catenin)的蛋白水平。结果转染siTIMP-1组的MRC-5细胞TIMP-1蛋白水平明显降低。与空白组相比, TGF-β1组细胞活力明显升高、 G0/G1期细胞百分比明显降低、 S期和G2/M期细胞百分比明显升高, TNF-α含量明显升高,α-SMA、 Col1和β-catenin的蛋白水平均明显升高。与TGF-β1组相比,敲低TIMP-1水平后,细胞活力明显降低、 G0/G1期细胞百分比明显升高、 S期和G2/M期细胞百分比明显降低, TNF-α含量明显降低,α-SMA、 Col1和β-catenin蛋白表达均明显降低。转染阴性对照小干涉RNA的细胞与TGF-β1组各项指标均无明显差异。结论敲低TIMP-1水平可抑制MRC-5细胞增殖活性、减少胶原蛋白合成及TNF-α释放,可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。     

TAK1通过调控p38 MAPK信号通路影响肾小管上皮细胞纤维化

目的:探讨转化生长因子β激活激酶1(TAK1)对肾小管上皮细胞纤维化的影响及机制。方法:以肾小管上皮细胞HK-2作为研究对象,用转化生长因子β1(TGF-β1)诱导肾小管上皮细胞纤维化,以real-time PCR和Western blot检测细胞中TAK1表达的变化。用TAK1 shRNA慢病毒感染肾小管上皮细胞,以real-time PCR和Western blot检测其对TGF-β1刺激下肾小管上皮细胞中TAK1表达的影响以检测干扰效果。ELISA法检测细胞分泌的I型胶原和III型胶原水平,Western blot法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、结缔组织生长因子(CTGF)和磷酸化的p38 MAPK(p-p38 MAPK~(Thr 180/Tyr 182))的蛋白水平。用p38 MAPK激活剂处理已敲减TAK1表达的肾小管上皮细胞,检测其对细胞分泌I型胶原和III型胶原的影响及对细胞中α-SMA、CTGF和p-p38 MAPK~(Thr 180/Tyr 182)蛋白水平的影响。结果:TGF-β1可以明显上调肾小管上皮细胞中TAK1的表达水平。TAK1 shRNA可明显下调TGF-β1刺激下的肾小管上皮细胞中TAK1的表达水平。TGF-β1处理后的肾小管上皮细胞分泌I型胶原和III型胶原增多,细胞中α-SMA、CTGF和p-p38 MAPK~(Thr 180/Tyr 182)蛋白水平升高。敲减TAK1表达可以明显抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞分泌I型胶原和III型胶原,减少细胞中α-SMA、CTGF和p-p38 MAPK~(Thr 180/Tyr 182)的蛋白水平(P0.05)。p38 MAPK激活剂处理可以逆转敲减TAK1表达对肾小管上皮细胞分泌I型胶原和III型胶原及α-SMA、CTGF和p-p38 MAPK~(Thr 180/Tyr 182)蛋白水平的抑制作用。结论:敲减TAK1表达能够通过抑制p38 MAPK信号通路而降低TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化水平。     

心肌细胞结缔组织生长因子的表达及TGF-β1对其表达的影响

目的： 研究纯化的心肌细胞中结缔组织生长因子（CTGF）基因及蛋白的表达，并探讨转化生长因子β1（TGF-β₁）对其表达的影响。方法: 分离培养乳鼠心肌细胞，48 h后用流式分选方法（FACS）分选纯化心肌细胞，纯化的心肌细胞继续培养48 h。分为对照组（空白纯化心肌细胞组）和TGF-β₁刺激组，用RT-PCR方法测定两组细胞中TGF-β₁、CTGF、纤维连接蛋白（FN） mRNA的含量， 用Western blotting法检测两组细胞胞浆蛋白中CTGF、FN含量。结果: 心肌细胞中有较低水平的CTGF表达，在予以 TGF-β₁刺激后细胞内CTGF mRNA与蛋白含量分别提高 2.49 倍(P<0.01) 和3.63 倍（P<0.01），FN mRNA与蛋白含量分别提高 1倍(P<0.01)和4.18倍（P<0.01），而TGF-β1mRNA水平减少34%（P<0.01）。结论: 纯化的心肌细胞有CTGF的基础表达，并且TGF-β1可以明显上调其表达，提示心肌细胞主动参与了心肌纤维化过程。     

转化生长因子-β1诱导大鼠毛乳头细胞转分化为成纤维细胞的研究

目的 研究大鼠触须毛乳头细胞在转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导作用下转分化为成纤维细胞的可能性,从新的角度探讨增生性瘢痕的形成机制.方法 消化收集第4代毛乳头细胞,处理组以 TGF-β1（10 ng/mL）处理细胞4 d;对照组加入正常培养基（不含胎牛血清的DMEM/F12培养液）,每隔24 h观察两组细胞生长形态及生长方式;分别用实时一步法RT-PCR和流式细胞仪检测细胞α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白（Vimentin）的mRNA表达和蛋白表达,Western blotting检测成纤维细胞特异蛋白（FSP1）的表达.结果流式细胞仪检测TGF-β1诱导48 h、72 h后α-SMA表达明显低于对照组（P〈0.01）;TGF-β1诱导48 h、72 h、96 h后Vimentin表达明显高于对照组（P〈0.01）.实时一步法RT-PCR检测Vimentin的mRNA表达逐渐增强,α-SMA的mRNA表达在48 h后明显下降（P〈0.01）,但96 h后表达又有所增加;Western blotting法检测FSP1表达在诱导48 h后逐渐增加（P〈0.01）.结论 毛乳头细胞经TGF-β1诱导后,失去其典型的细胞形态及生长方式,而表现出成纤维细胞的细胞形态及生长方式;其相对特异性标记物α-SMA的表达下降,而成纤维细胞的相对特异性标记物Vimentin和FSP1表达增加.故TGF-β1可诱导大鼠毛乳头细胞转分化为成纤维细胞.     

IFN-α1b对肝星状细胞形态及其CTGF表达影响的研究

目的：通过观察IFN-α1b对肝星状细胞(HSC)形态和表达CTGF的影响，探讨IFN-α1b在治疗肝纤维化中的作用机制。 方法： 采用体外培养大鼠肝星状细胞，分别加入IFN-α1b、TGF-β1,观察肝星状细胞的形态学及CTGF表达的改变。 结果： 透射电镜观察到IFN-α1b作用组肝星状细胞有明显的凋亡现象发生；RT-PCR观察到正常组和TGF-β1诱导肝星状细胞表达的CTGF mRNA随IFN-α1b的作用而减少。 结论： IFN-α1b对肝星状细胞表达CTGF的抑制作用机制可能是通过诱导肝星状细胞凋亡和抑制TGF-β1诱导肝星状细胞表达CTGF。     

大鼠心肌细胞结缔组织生长因子的诱导表达及RNA干扰研究

目的： 探讨心肌细胞对结缔组织生长因子（CTGF）的基础表达及转化生长因子β1（TGF-β1）对其分泌的诱导作用,并进一步研究以RNA干扰(RNAi)技术靶向抑制CTGF对下游纤维化因子的影响。方法: 实验分为以下5组： 组Ⅰ：单纯心肌细胞组;组Ⅱ：TGF-β1诱导组;组Ⅲ：阴性质粒组;组Ⅳ：RNAi组;组Ⅴ：脂质体组。分离培养Sprague Dawley（SD）大鼠乳鼠心肌细胞,以5 μg/L终浓度的TGF-β1对培养的心肌细胞进行诱导,再通过脂质体法将靶向大鼠CTGF的短发夹RNA(shRNA)干扰质粒转染入心肌细胞,流式细胞技术分选出成功转染的细胞。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫印迹（Western blotting）技术进一步研究各实验组心肌细胞CTGF、纤维连接蛋白（FN）mRNA及蛋白的表达水平。结果: 单纯心肌细胞组对CTGF、FN均有低水平的基础分泌,在予以TGF-β1诱导后表达水平显著升高（P＜0.01）;而在靶向特异性RNAi后,上述因子的表达均被显著抑制（P＜0.01）;并且纤维化因子FN的表达水平与促纤维化因子CTGF的表达显著相关。结论: 心肌细胞可自主低水平分泌或诱导后高表达CTGF及下游纤维化因子FN,提示心肌细胞主动参与了心肌纤维化及心脏重塑过程;而通过RNAi靶向抑制CTGF后可阻抑心肌细胞分泌下游纤维化因子,进一步提示CTGF是促心肌纤维化的关键性细胞因子,而RNAi是一种特异高效的很有前途的干预手段。