靶向大鼠Nogo受体基因的小发夹RNA慢病毒载体的构建及病毒包装

目的构建靶向大鼠Nogo受体(NgR)的小发夹RNA(shRNA)慢病毒载体并进行病毒颗粒包装及滴度测定。方法设计合成3对针对大鼠NgR及1对非特异性的寡核苷酸单链,退火后得到shNgR双链,克隆入慢病毒载体pGC-LV,行聚合酶链反应(PCR)并测序鉴定重组体;构建NgR过表达载体,双酶切并测序鉴定插入序列正确性;NgR过表达载体和各慢病毒shRNA干扰载体共转染293T细胞后,定量反转录(RT)-PCR及蛋白印迹法筛选有效的慢病毒shRNA干扰载体;重组NgR慢病毒shRNA干扰载体和病毒包装质粒共转染293T细胞,包装并收集病毒颗粒,进行病毒浓缩液滴度检测。结果 PCR及DNA测序结果均显示慢病毒载体pGC-LV-shNgR构建正确;双酶切及测序亦显示NgR过表达载体插入序列正确;定量RT-PCR及蛋白印迹法结果表明所构建的3个慢病毒载体pGC-LV-shNgR均可以有效干扰NgR的表达,其中pGC-LV-shNgR-A干扰效率最高;包装病毒颗粒后,检测病毒浓缩液的滴度为2×107 TU/mL。结论成功构建靶向大鼠Nogo受体的shRNA慢病毒载体并进行病毒颗粒包装,浓缩的病毒液可以用于后续研究。     

雌激素受体α基因shRNAi慢病毒载体的构建与滴度测定

目的:构建雌激素受体(ER)α基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,检测病毒感染细胞的滴度.方法:针对已经筛选确定的ERα基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoR Ⅰ酶切后的pGCsil-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生 shERα-LV慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用shERα-LV载体、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0质粒共转染包装293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果:PCR和测序证实,成功构建ERα shRNA的慢病毒载体shERα-LV.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2×108 TU/mL.结论:成功构建人ERα基因RNAi慢病毒载体,为ERα在乳腺癌发生发展中的研究提供了基础.     

大鼠PPARγ shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ)基因RNA干扰慢病毒载体并鉴定。方法设计针对PPARγ的小发夹RNA(shRNA)序列,应用基因重组技术插入到pLentiLox3.7(pLL3.7)慢病毒载体中,XbaⅠ和XhoⅠ双酶切和DNA测序鉴定重组克隆。将pLL3.7空载体(NC组)、pLL-PPAR-γsh1RNA(S1组)、pLL-PPAR-γsh2RNA(S2组)三组质粒分别与辅助包装质粒共转染人胚肾293T细胞,并测定病毒滴度;病毒感染大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞和大鼠海马神经干细胞后,分别用RT-PCR和Western blot检测PPARγmRNA和蛋白表达。结果 PPARγshRNA成功插入慢病毒载体。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度为5×106IU/ml。与NC组相比,S1、S2组PPARγmRNA水平下降(P<0.05),且S1组PPARγ蛋白表达亦明显下降(P<0.05)。结论成功构建PPARγ基因RNA干扰慢病毒载体。     

ERα基因shRNAi慢病毒载体的构建与滴度测定

目的：构建ERα基因RNAi慢病毒载体,检测病毒感染细胞的滴度。方法：针对已经筛选确定的ERα基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Age I和EcoRI 酶切后的pGCsil-GFP载体［含U6启动子和绿色荧光蛋白（GFP）］连接产生shERα-LV慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。 用shERα-LV载体、pHelper 1.0 载体和pHelper 2.0质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结论：PCR和测序证实,成功构建ERα shRNA的慢病毒载体shERα-LV. 包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2E+8TU/ml。讨论：成功构建人ERα基因RNAi慢病毒载体,为ERα在乳腺癌发生发展中的研究提供了工作基础。     

人miR-378慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建人miR-378慢病毒表达载体。方法酶切法从已构建的质粒获得pri-miR-378,克隆于含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的PGCSIL载体,转化感受态细胞,产生重组慢病毒质粒PGCSIL-miR-378,并进行PCR及测序鉴定。将PGCSIL-miR-378、pHelper 1.0和pHelper 2.0三种质粒DNA共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平用逐孔稀释滴度法测定病毒滴度。结果成功构建miR-378的慢病毒表达载体,测序证实所插入基因序列完全正确。荧光显微镜检测证实PGCSIL-miR-378携有正确的miR-378基因,并能在293T细胞中表达。检测病毒滴度为8×108 TU/ml。结论成功建立了miR-378慢病毒表达系统。     

HIF-1α基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建HIF-1α基因RNA干扰慢病毒载体。方法选定HIF-1α基因RNAi靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经XhoⅠ和HpaⅠ双酶切后的慢病毒载体pLentilox3.7（pLL3.7）连接,产生pLL3.7HIF-1α慢病毒载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽取质粒后,用限制性内切酶XbaⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定,将阳性克隆送金斯特公司进行测序鉴定 用PHR、pVSVG和pLL3.7慢病毒载体共转染包装细胞293T细胞（磷酸钙转染法）,包装产生慢病毒,将收集的病毒上清经高速离心浓缩后,按一定比例稀释,然后感染293T细胞,用流式细胞仪检测293T细胞GFP蛋白的表达水平,从而测定病毒滴度。结果酶切和测序证实,构建出HIF-1αshRNA的慢病毒载体pLL3.7HIF-1α 包装慢病毒,测得离心的浓缩病毒悬液的滴度为2×108TU/ml。结论成功构建HIF-1α基因RNAi慢病毒载体。     

CYP4F3基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建

目的构建细胞色素P450(CYP)4F3基因RNA干扰(RNAi)重组慢病毒载体。方法设计并合成CYP4F3 siRNA序列,与含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的pGCL载体连接产生PscsiCYP4F3慢病毒载体,PCR和测序鉴定。用PscsiCYP4F3、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染人肾上皮细胞系293T细胞,包装产生慢病毒,测定病毒滴度,并以人肺腺癌A549细胞中CYP4F3mRNA表达水平确定该基因干扰的有效靶点。结果成功构建CYP4F3siRNA的慢病毒载体,并筛选出该基因的有效干扰靶点。结论成功构建人CYP4F3基因RNAi慢病毒载体,为后期研究CYP4F3基因功能奠定基础。     

大鼠CRH基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建针对大鼠促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体并进行鉴定。方法针对CRH基因设计4个RNAi靶点并分别构建入慢病毒骨架载体,测序鉴定。过表达质粒和RNAi质粒共转染293T工具细胞后,用Western blot进行外源筛靶以确定有效靶序列。有效RNAi病毒质粒与辅助质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将其浓缩后用孔稀释法测定病毒滴度。结果 Western blot外源筛靶显示3个靶点能有效敲减目的基因的表达。测定浓缩病毒悬液的滴度为1．5×109 T U／ml。结论成功构建了CRH基因的RNAi慢病毒载体,可用于CRH在应激反应中作用的研究。     

SATB1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建SATB1基因慢病毒载体,为其体内外实验研究提供依据。方法将靶向SATB1基因的shRNA表达序列连接到慢病毒载体pGCSIL-GFP中,获得pGCSIL—GFP-shSATB1质粒,经PCR和测序鉴定后与慢病毒包装质粒pGCSIL-GFP—shSATB1通过Lipofectamine2000共转染至细胞293T,包装产生病毒液,测定其滴度。结果PCR扩增和测序结果证实,SATB1shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为2×10^7pfu／ml。结论成功构建人SATB1基因慢病毒载体。     

表皮生长因子受体基因RNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定研究

目的构建表皮生长因子受体(EGFR)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,为其体内外实验研究提供依据。方法合成EGFR基因的miRNA干扰序列,构建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-EGFR质粒,测序验证插入序列正确,连接到慢病毒载体pLenti6.3-MCS/V5 DEST中,获得pLenti6.3-EGFR-miRNA质粒,与慢病毒包装质粒Packaging MIX、POLOdelivererTM3000 Transfection Reagent共转染293T细胞株,细胞包装产生慢病毒颗粒,测定慢病毒滴度。结果 PCR和测序结果证实,EGFR miRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液滴度为1.8×106ifu/ml。结论成功构建EGFR基因RNAi慢病毒载体,为研究其在胶质瘤细胞中的生物学功能奠定基础。     

靶向人乳头瘤病毒18E6的短发夹结构RNA慢病毒载体的构建

目的:构建含有靶向人乳头瘤病毒18型E6癌基因(HPV18E6)的短发夹结构RNA(shRNA)的慢病毒载体。方法:根据HPV18E6癌基因的相关信息,设计并合成shRNA干扰序列,连入pGCSIL-GFP质粒,构建并鉴定含有shRNA的重组质粒pGC-shRNA;将重组质粒pGC-shRNA和病毒包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共转染293T细胞,进行病毒包装,收集病毒液并进行浓缩、纯化;所得病毒液感染293T细胞,测定病毒滴度,并验证其对宫颈癌HeLa细胞HPV18E6癌基因的干扰效果。结果:HPV18E6的shRNA干扰序列与人类基因组没有同源性,此插入序列转录后得到的RNA二级结构能形成发夹状结构;重组质粒pGC-shRNA经PCR鉴定及DNA测序结果显示该重组质粒构建成功;成功对病毒进行包装、浓缩及纯化后,所得病毒滴度为3×108TU/mL,并能很好地抑制HPV18E6癌基因的表达。结论:成功构建了HPV18E6-RNAi-LV慢病毒载体,为后续RNA干扰研究的开展提供了工具。     

CDC25B3基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建CDC25B3基因RNAi慢病毒载体.方法 合成CDC25B3基因RNAi有效靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与双酶切后的pGCL-GFP载体(含有U6启动子和GFP基因)连接产生LV-shCDC25B3慢病毒载体,挑选阳性克隆经PCR和测序鉴定.用脂质体转染法将LV-shCDC25B3、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 PCR和测序证实,成功地构建了CDC25B3 shRNA的慢病毒载体LV-shCDC25B3.浓缩病毒悬液的滴度为1×108TU/ml.结论 成功构建人CDC25B3基因RNAi慢病毒载体.     

USP22 ShRNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建并鉴定USP22基因ShRNA慢病毒载体,为进一步研究USP22基因在鼻咽癌中的作用机制奠定基础。方法针对USP22基因的编码序列设计并合成2条特异性干扰序列,序列两端含有限制性内切酶位点HpaⅠ和X hoⅠ。寡核苷酸链退火生成寡核苷酸双链,5＇端磷酸化后将含有酶切位点的寡核苷酸双链克隆到pLL3.7慢病毒表达载体。连接产物经转化、培养,提取其质粒,提取出来的质粒经HpaⅠ和XhoⅠ酶切电泳鉴定,鉴定正确的质粒进行测序。构建成功的慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA与包装载体质粒混匀共转染于293T细胞。通过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）情况,对病毒滴度和感染效率进行检测。结果成功构建慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA。与包装载体质粒共转染293T细胞后测定慢病毒滴度为4×10^7 TU/ml。结论本实验应用相关技术成功构建USP22 ShRNA慢病毒载体,为进一步研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。     

ErbB4基因miRNA慢病毒载体的构建及其在小鼠海马齿状回的表达

目的构建靶向ErbB4的miRNA慢病毒载体,包装产生高滴度慢病毒并观察其感染小鼠海马齿状回基因的表达。方法将靶向ErbB4基因的miRNA干扰质粒利用Gateway重组技术构建慢病毒表达质粒,并与慢病毒包装系统共转染HEK293T包装细胞,收获上清并浓缩得到慢病毒浓缩液,通过测定绿色荧光蛋白(GFP)表达水平测定其滴度。所得慢病毒浓缩液经立体定位微量注射感染小鼠海马齿状回。观察鼠脑冰冻切片基因表达情况,并用神经元标志物神经元核抗原(NeuN)和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)特异性抗体行免疫染色分析转导的细胞类型。结果阳性克隆测序结果与设计序列一致,说明靶向ErbB4基因的miRNA慢病毒干扰载体构建成功。包装收获慢病毒。浓缩的慢病毒包装上清感染HEK293T细胞后,流式细胞术检测GFP阳性率,计算得慢病毒活性滴度为1.0×1012转导单位(TU).L-1。小鼠海马齿状回立体定位微量注射1.0×1012TU.L-1慢病毒6个月后,观察到注射部位外源基因的显著表达。免疫荧光染色显示,慢病毒转导的细胞多呈NeuN标记阳性,并与GFAP的表达不重叠。结论靶向ErbB4的miRNA慢病毒载体构建成功,获得了靶向ErbB4基因的高滴度miRNA慢病毒颗粒,并实现了脑实质的局部长期稳定转导,慢病毒转导的主要细胞类型为神经元。     

人脂联素基因慢病毒载体在293 T细胞中的表达及意义

目的构建携带人脂联素(human apM1,hapM1)基因的慢病毒载体,并观察其在293 T细胞中的表达及意义。方法将hapM1的编码区(CDS区)从克隆载体上亚克隆到慢病毒载体上,构建重组慢病毒载体质粒。在脂质体介导下与包装质粒HELPER、包膜质粒VSVG共转染293 T细胞包装生产慢病毒。慢病毒感染293 T细胞后,RT-PCR和Westernblot法检测在293 T细胞中hapM1基因的表达。采用抑制血管平滑肌细胞增殖实验,检测表达产物的生物学活性。结果hapM1基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。重组慢病毒载体质粒PNL-hapM1-IRES2-EGFP经鉴定正确。三质粒共转染293 T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2.0×105TU·L-1。感染293 T细胞后RT-PCR、Western blot检测hapM1组细胞有hapM1蛋白表达,其余两组(Mock-293 T组、293 T组)均无表达。表达产物hapM1蛋白能够抑制血管平滑肌细胞的增殖。结论成功构建带有hapM1基因慢病毒载体,并且能够在293 T细胞中表达具有生物学活性的hapM1蛋白。     

大鼠Adrb3基因重组慢病毒干扰载体的构建及其对血管平滑肌细胞Adrb3表达的影响

目的 构建大鼠Adrb3 （rAdrb3） 基因慢病毒干扰载体, 筛选高效率rAdrb3基因干扰序列, 观察其对大鼠血管平滑肌细胞 （VSMC） Adrb3基因表达的影响, 为进一步研究Adrb3在心力衰竭中的作用机制提供实验工具。方法 设计2条rAdrb3基因shRNA寡核苷酸序列, 构建慢病毒干扰质粒并进行测序鉴定。三质粒法共转染293T细胞包装慢病毒, 测定慢病毒滴度。大鼠VSMC设置正常对照组 （Normal组）, 空载慢病毒组 （Lv-rAdrb3-shRNA-control组）,携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体1组 （Lv-rAdrb3-shRNA-1组）, 携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体2组 （Lv-rAdrb3- shRNA-2组）, 感染5 d后, 收集细胞。提取细胞总RNA和蛋白, Real-time PCR检测rAdrb3 mRNA表达, Western blot 检测rAdrb3蛋白表达。结果 构建2个携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体, 滴度均为2×108 TU/mL。慢病毒感染大鼠 VSMC 72 h后, 感染效率可达80%。与Normal组比较, Lv-rAdrb3-shRNA-1、 Lv-rAdrb3-shRNA-2组Adrb3 mRNA水平沉默效率为87.18%、 65.27% （P＜0.05）; 与Normal组比较, Lv-rAdrb3-shRNA-1、 Lv-rAdrb3-shRNA-2组rAdrb3蛋白水平沉默效率为85.57%、 70.04% （P＜0.05）。结论 成功构建并筛选出有效携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体, 可显著抑制大鼠VSMC Adrb3的表达。     

大鼠雪旺细胞Neuritin基因shRNA表达载体构建及其体外抑制效应

目的构建针对大鼠neuritin基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)表达载体,并研究该载体对neuritin基因表达的沉默效应及雪旺细胞生存的影响。方法设计并合成neuritin靶向siRNA序列,连接pGCSIL-GFP慢病毒表达载体后,将neuritin基因干扰质粒和重组表达质粒共转染入293T细胞,包装成慢病毒,以此感染大鼠雪旺细胞,分为空白对照组(A组)、无意义干扰组(B组)和干扰组(C组)。RT-qPCR、Western blot及Annexin V/PI方法分别检测细胞neuritinmRNA、蛋白表达及细胞凋亡情况。结果与A、B组相比,C组雪旺细胞neuritin mRNA和蛋白表达水平降低,而细胞凋亡明显增加(P<0.01或P<0.05)。结论成功构建neuritin基因shRNA慢病毒表达载体。其转染的雪旺细胞neuritin基因表达受抑制,并导致细胞凋亡增加。     

靶向结缔组织生长因子shRNA慢病毒表达载体的构建及病毒包装

目的构建靶向结缔组织生长因子（CTGF）的shRNA慢病毒载体并检测其介导的RNA干扰（RNAi）对人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）CTGF表达的影响,为进一步研究CTGF在增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）中的功能奠定基础。方法设计并合成三对针对CTGF的siRNA,通过WesternBlot筛选有效靶点,合成有效靶点的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与线性化的pGC-LV-GFP载体连接,通过PCR筛选阳性克隆并进行DNA测序鉴定;将重组CTGFshRNA的质粒与病毒包装的辅助质粒共转染295T细胞,将包装产生的慢病毒感染ARPE-19细胞,WesternBbt检测CTGF的表达。结果通过双酶切和基因测序证实靶向CT-GF的shRNA慢病毒载体构建成功,Western Blot证实经慢病毒感染后的ARPE-19细胞中的CTGF的蛋白水平明显减低。结论成功构建了靶向CTGF的shRNA慢病毒表达载体,体外感染ARPE-19细胞可有效降低CTGF蛋白的表达,为深人研究CTGF在PVR中的功能提供了有力的工具。     

巨细胞病毒IE2的红色靶基因与绿色荧光-慢病毒系统的建立及其对人神经干细胞的感染

目的 RNA干扰技术沉默连接红色荧光蛋白mCherry与靶基因巨细胞病毒IE2的表达,并初步研究慢病毒感染神经干细胞的可能性。方法以人巨细胞病毒IE2 mRNA编码序列作为干扰靶点,以慢病毒质粒UTG作为载体,构建靶向巨细胞病毒IE2的shRNA表达质粒,构建携带IE2的mCherry红色荧光蛋白的质粒作为验证shRNA有效性的靶点,并转染293FT细胞。通过红色荧光的表达及RT-PCR和Western Blot确定最佳沉默IE2序列后,将有效的UTG-IE2质粒与辅助质粒共转染293FT细胞,获取高滴度慢病毒。应用慢病毒感染人神经干细胞,观察神经干细胞被慢病毒感染的情况并检测神经干细胞的绿色荧光表达情况。结果成功构建IE2-shRNA慢病毒载体UTG-shRNA-IE2,RT-PCR及Western Blot结果显示慢病毒感染的293FT细胞IE2 mRNA及蛋白表达相对于对照组显著降低。构建的慢病毒可以成功感染神经干细胞。结论红色靶基因-绿色慢病毒系统具有简便的筛选性能;UTG慢病毒对神经干细胞具有较高感染效率,可实现慢病毒介导的RNA干扰在神经干细胞内的有效表达,并为相关研究提供技术支持。     

慢病毒介导shRNA干扰前列腺癌PC3细胞Keap1基因表达的研究

目的：针对Keap1构建shRNA慢病毒干扰载体,并评价慢病毒介导的RNA干扰在人前列腺癌细胞PC3中的基因沉默效应。方法：利用生物信息学方法设计针对Keapl的RNAi寡聚核苷酸序列;采用慢病毒载体构建Keapl的shR-NA载体,利用大肠杆菌进行重组表达,利用293T细胞包装得到重组腺病毒;依据绿色荧光蛋白（GFP）示踪,逐孔稀释法确定转染效率及滴度;以实时荧光定量法比较各靶序列的基因干扰效果。结果：筛选了所构建的4个Keapl靶向序列,以慢病毒载体构建完成对应Keapl的shR-NA质粒。通过瞬时转染筛选得到效率最佳（干扰效率达到80％）的靶序列和工作条件。结论：本研究成功构建并筛选了针对Keapl的shRNA慢病毒载体,有效抑制PC3细胞中Keapl的表达。