小鼠趋化因子CXCL10真核表达载体的构建

应用RT—PCR方法，从小鼠脾脏T细胞的mRNA中，扩增获得编码小鼠趋化因子CXCL10的cDNA，并加上人单核细胞趋化蛋白1的信号肽基因，将其克隆到Pucm—T载体，经酶切及测序鉴定，进而构建CXCL10重组真核表达载体。采用脂质体法体外转染COS-7真核细胞，经Western blot和趋化指数检测，转染细胞能够表达CXCL10蛋白，其上清对淋巴细胞具有趋化作用。CXCL10的真核表达载体构建成功，为进一步研究其在肿瘤治疗中的作用奠定了基础。     

mBMP-4真核表达载体的构建及表达

0　引言　骨形态发生蛋白 - 4(BMP- 4)具有诱导成骨潜能细胞向软骨细胞和成骨细胞方向分化并形成新骨的能力 .随着基因转染技术的应用 ,将外源基因转入靶细胞内 ,通过靶细胞表达外源基因而发挥作用成为可能 .本研究的目的是通过基因克隆和 DNA重组技术构建可在真核细胞内表达的 BMP- 4表达载体 ,并观测外源基因在细胞内表达的情况 ,为探索将基因转移技术应用于骨折及骨不连等疾病的治疗奠定一定的实验基础 .1　材料和方法1.1　试剂　质粒 pc DNA3和 p SPT- 18- m BMP- 4均由吕振华博士馈赠 ,Eco R I和 H ind III,T4DNA连接酶、…     

抗阿尔茨海默病重组蛋白疫苗的克隆、表达和免疫学鉴定

目的：制备抗阿尔茨海默病的重组蛋白疫苗。方法：将β淀粉样蛋白42肽N端表位Aβ1-15基因,通过来源于破伤风毒素的辅助性T细胞表位多肽TTP基因片段,与大肠杆菌L-门冬酰胺酶Ⅱ（AnsB）基因的C末端融合,构建表达质粒pET28a—AnsB-TTP-Aβ1-15。转化至E．coli BL-21,TBYE培养基（Kan＇）培养,乳糖诱导表达,通过渗透休克、DEAE52-cellulose和Sephadex G-100柱层析制备融合蛋白rAnsB-TTP-Aβ1-15通过酶活力和抗原性测定鉴定融合蛋白。结果：获得的融合蛋白rAnsB-1TTP—Aβ1-15保留了AnsB71％的催化活力,具有与抗Aβ1-42抗体特异性结合的能力。结论：获得了在AnsB多聚酶分子表面呈现有Aβ1-15,表位的融合蛋白rAnsB-TTP—Aβ1-15为抗阿尔茨海默病疫苗研究奠定了基础。     

HBx基因的克隆和序列分析及其真核表达载体的构建

目的：通过HBx基因的克隆、序列对比和进化树分析以及peDNA3．1（＋）-HBx真核表达载体的构建，为进一步研究HBx基因与肝癌发生发展的关系打下基础。方法：用Oliga6．0结合Primer Premier5．0软件设计特异性引物，通过PCR方法从广西HBsAg阳性病人血清中（血清型Adrq^＋）分离得到的病毒株构建的HBxAg质粒中扩增HBx基因。用DNA star5．01和Vector NTI Suite8．0软件进行序列对比分析和进化树构建。经双酶切将HBx基因定向插入到pcDNA3．1（＋）质粒中。结果；成功克隆了基因型C型突变型HBx基因，并构建出真核表达载体pcDNA3．1（＋）HBx。新基因被GeneBank接受，在GeneBank上登录号为AY839630。序列对比和进化树分析表明．新克隆的基因与野生基因型C型有高度的同源性（97．80A），2．2％的变异。结论：从广西HBsAg阳性病人病毒株（血清型Adrq^＋）中发现了新的基因型C型突变型HBx基因（mutantgenotypeC）。peDNA3．1（＋）-HBx真核表达载体的构建，将为进一步研究HBx基因在树鼩实验性肝癌诱发过程中所起的作用打下基础。     

Nogo-c基因的克隆、测序及真核表达载体的构建

目的 克隆Nogo-c的cDNA序列，并构建其真核表达载体，为进一步研究其抑制神经生长机制奠定基础。方法 根据基因GenBah中Nogo-c基因的碱基序列，利用RT-PCR的方法从鼠脑组织中扩增编码Nogo-c基因，将目的片段与pMD18T载体连接，利用亚克隆的方法将Nogo-c的cDNA片段克隆到peDNA3．1载体中，并进行序列测定。结果 DNA测序证实该片段序列与文献报道完全一致。结论 成功构建出pcDNA3．1-Nogo-c真核表达载体。     

新城疫病毒NP蛋白的真核表达载体的构建

目的 研究新城疫病毒核衣壳蛋白基因的生物学作用及其抗人喉鳞癌的作用。方法 利用含有新城疫病毒Ｖ４株核衣壳蛋白基因ｃＤＮＡ的原核质粒ｐＵＶＮＰ４及真核质料ｐｃＮＤＡ３,采用基因重组技术构建了含有ＣＭＶ含动子、ＢＧＨｐｏｌｙＡ信号序列的表达新城疫病毒核衣壳蛋白的真核表达质粒。结果 酶切分析表明重组质粒中含有新城疫病毒Ｖ４株核衣壳蛋白基因。结论 重组质粒为表达新城疫病毒核衣壳蛋白基因的真核质粒。     

真核表达载体pCMV4—hTGFβ1的构建

真核表达载体ｐＣＭＶ４┐ｈＴＧＦβ１的构建贾赤宇陈璧（第四军医大学西京医院烧伤外科西安７１００３３）关键词转化生长因子β１人类巨细胞病毒中图号Ｒ７５３转化生长因子β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒβ，ＴＧＦβ）是一大类多功能的细胞增...     

小鼠血管抑素基因的克隆及真核表达载体构建

目的：克隆小鼠血管抑素(Angiostatin)cDNA，构建其真核表达载体pCMV-Angiostatin重组质粒，为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法：根据Genebank中小鼠血管抑素基因序列，用RT-PCR方法从鼠肝脏中扩增出Angiostatin cDNA，连接pMD18T载体测序，经测序证实后，通过中间栽体pKS，构建pCMV-Angiostatin重组质粒。结果：测序表明扩增的Angiostatin cDNA序列与报道基本一致，Angiostatin cDNA正确插入表达载体。结论：成功地克隆小鼠Angiostatin基因并完成其真核表达载体的构建。     

IkB—α基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的：克隆IkB-α基因，构建IkB-α的真核表达载体，方法：RT－PCR扩增IkB-α的cDNA，然后将其克隆入真核表达载体pShuttle，并转入大肠杆菌JM109。结果：通过PCR和重组质粒酶切分析等方法，筛选出重组阳性克隆。结论：此重组质粒可用于真核表达等进一步研究。     

人白细胞介素7基因克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人白细胞介素7（hIL-7）的真核表达载体。方法：从人脾脏组织的总RNA中，用RT－PCR方法扩增出编码成熟hIL-7的cDNA，将其克隆于pMD18-T质粒中，并进行序列测定。再将hIL-7cDNA以正义及反义插入真核、原核双重表达载体pBK-CMV质粒，转化至大肠杆菌DH5α。最后将表达的lacz-hIL-7重组蛋白行SDS－PAGE电泳，并作考马斯亮蓝染色分析，western blot鉴定。结果：hIL-7序列测定结果与预期一致。pBK-CMV-hIL-7（正义插入）的无隆表达重组蛋白，western blot证实此蛋白为IL－7。结论：成功构建了hIL-7的真核表达载体，为进一步研究hIL-7的抗肿瘤作用创造了条件。     

七种常见MBL基因单倍型标准质粒的构建

目的 构建7种常见的MBL基因单倍型标准质粒。方法以已确认MBL基因单倍型及基因型的DNA样本为模板．利用SSP-PCR技术扩增出包含MBL基因启动子区及第一外显子的单倍型片段并将其克隆人T载体；用定点突变技术分别将其第一外显子52和57位密码相应的碱基突变；采用PCR和测序进行鉴定。结果以单倍型及基因型已确认的DNA样本为模板，采用SSP-PCR和分子克隆技术获得单倍型HYPA、LXPA、LYOA、LYPA和LYPB重组质粒；以单倍型HYPA及LYOA重组质粒为模板，采用定点突变技术获得单倍型HYPD及LYOC标准质粒。结论构建成功常见的7种MBL基因单倍型标准质粒，为采用SSP-PCR、Real-time PCR等技术分析MBL基因相应的SNP及其单倍型与基因型提供了标准对照。     

七种常见MBL基因单倍型标准质粒的构建

目的 构建7种常见的MBL基因单倍型标准质粒。方法 以已确认MBL基因单倍型及基因型的DNA样本为模板,利用SSP-PCR技术扩增出包含MBL基因启动子区及第一外显子的单倍型片段并将其克隆入T载体;用定点突变技术分别将其第一外显子52和57位密码相应的碱基突变;采用PCR和测序进行鉴定。结果 以单倍型及基因型已确认的DNA样本为模板,采用SSP-PCR和分子克隆技术获得单倍型HYPA、LXPA、LYQA、LYPA和LYPB重组质粒;以单倍型HYPA及LYQA重组质粒为模板,采用定点突变技术获得单倍型HYPD及LYQC标准质粒。结论 构建成功常见的7种MBL基因单倍型标准质粒,为采用SSP-PCR、Real-timePCR等技术分析MBL基因相应的SNP及其单倍型与基因型提供了标准对照。     

三结构域重组纤连蛋白多肽在大肠杆菌中表达及其产物的纯化与鉴定

在大肠杆菌中表达了一种抗肿瘤转移多肽——人纤连蛋白（ＦＮ） 的ＣｅｌｌＩ－Ｈｅｐ Ⅱ－ＣｅｌｌⅡ三结构域重组多肽（ＣＨ８２）, 表达效率达２１％ 。在低温 （２２ ℃） 培养表达时, ＣＨ８２大部分为可溶性产物, 经ＤＥＡＥ－５２ 层析及Ｈｅｐａｒｉｎ－ａｇａｒｏｓｅ亲和层析可得到纯品; 在高温（３７ ℃） 培养表达时, ＣＨ８２ 主要以包涵体形式出现, 经尿素变性与复性处理后,可通过Ｈｅｐａｒｉｎ－ａｇａｒｏｓｅ 亲和层析得到纯品。所得纯品均具有结合肝素和结合细胞的功能, 且结合细胞的能力比双结构域ＦＮ更强, 表明两个结合细胞的功能结构域均有活性     

肿瘤特异增殖型腺病毒穿梭质粒pAd-delE1b55kD的构建

目的：构建一种对肿瘤细胞有特异靶向性的高效载体-肿瘤特异增殖型腺病毒的穿梭质粒pAd-delE1b55kD.方法：利用二步法PCR等基因重组技术,将质粒pXC1编码E1B-55kD蛋白的基因区域缺失,并保留一个BglⅡ酶切位点,以便插入外源性基因;利用凝胶图像分析和基因测序验证所构建质粒的正确性.结果：质粒pXC1的基因序列中,编码E1B-55kD蛋白的基因区中的2279～3326bp区域缺失,该区域上游的序列中第2024位碱基C点突变为T,第2252位碱基C点突变为T及第2261位碱基G点突变为T,从而在该区域上游插入了终止密码子TGA、TAG和TAA.在终止密码子下游,保留了一个BglⅡ酶切位点.结论：成功构建了肿瘤特异增殖型腺病毒穿梭质粒载体pAd-delE1b55kD,为肿瘤的基因治疗提供了一种对肿瘤细胞有特异靶向性的高效载体的穿梭质粒.     

抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体死亡受体5嵌合抗体的构建及其真核表达

目的构建以人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)受体死亡受体5(DR5)为抗原的鼠/人重组嵌合抗体。方法采用基因工程技术,扩增和克隆抗DR5嵌合抗体的轻、重链表达载体,共转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-dhfr-),筛选稳定分泌表达抗DR5嵌合抗体的细胞株。采用ELISA和Western bloting法鉴定抗体的人源性和抗体-抗原结合活性,四唑盐/吩嗪硫酸甲酯比色法检测抗体的生物学活性。结果获得了稳定表达和分泌抗人DR5的嵌合抗体(anti-DR5mV-hH)的重组细胞;与人DR5蛋白具有高的特异性结合活性;能使体外培养的人髓性白血病Jurkat细胞和人结肠癌HCT116细胞的存活率分别下降到73.15%和77.30%。结论抗DR5嵌合抗体anti-DR5mV-hH具有抗肿瘤活性,为发展人源化抗体药物的研究奠定了基础。     

人La蛋白突变体表达质粒的构建及诱导表达纯化

目的:构建人La蛋白(human La protein,hLa)突变体表达质粒,并在大肠杆菌中表达野生型La蛋白及各突变体.方法:利用定点突变技术,对野生型人La蛋白的原核表达质粒pET28b-hLa进行定向缺失突变,将得到的3个突变体Mu1(A366)、Del1(A235～276)、Del2(A119～150)分别克隆至pET28b中,获得野生型人La蛋白突变体的表达质粒,并在BL21(DE3)和Rosetta2两种不同宿主菌中和不同浓度的IPTG诱导条件下进行蛋白表达水平的比较.结果:所获得的人La蛋白突变体的基因编码序列经测序符合序列设计的要求,表达产物经SDS-PAGE分析可见,在相对分子质量47 000处出现一明显条带,与预期的相对分子质量一致.结论:三个位点的序列改变并没有明显影响hLa蛋白的表达,在补充密码子的宿主菌Rosetta2中的表达量优于宿主菌BL21(DE3).     

生物素标记人免疫球蛋白IgG重链的效果评估

目的对生物素标记的人免疫球蛋白IgG重链的效果进行评估和研究。方法将生物素与人免疫球蛋白IgG重链以各种不同的比例进行反应,然后让连接有抗人免疫球蛋白IgG重链抗体的微球颗粒与其反应,应用Luminex200仪器来测定其反应结果,最终来评估生物素与待标记的人免疫球蛋白IgG重链反应的效价。结果生物素与人免疫球蛋白IgG重链的重量比例适当时,微球颗粒上的平均荧光强度(MFI值)最强,而其他比例时,微球颗粒上的平均荧光强度呈下降趋势。结论生物素标记人免疫球蛋白IgG重链应有适当的比例,使被标记的生物素尽可能的多,同时又避免过多的生物素造成空间位阻影响。     

pcDNA3.1+-HIF-1α载体的构建和初步表达鉴定

目的克隆和构建带人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因真核表达载体pcDNA3.1 -HIF-1α。方法以大肠癌细胞株HT29的总RNA为模板,进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),获得HIF-1α的cDNA,克隆入T载体,测序证实后克隆入真核表达载体pcDNA3.1 ,酶切鉴定重组子。将构建好的pcDNA3.1 -HIF-1α用脂质体法转入HEK293细胞,RT-PCR鉴定重组质粒的表达。结果扩增出HIF-1αcDNA全长,测序结果与Genbank记载完全一致,成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1 ;建立了稳定的细胞株HEK293/pcDNA3.1 -HIF-1α。结论成功克隆和构建带人HIF-1α基因真核表达载体pcDNA3.1 -HIF-1α,并证明其能在真核细胞内表达。     

丙型肝炎病毒核心区与IgG Fc段融合基因疫苗的构建及表达

目的：构建能同时表达丙型肝炎病毒核心区与IgG Fc段的融合基因真核表达载体pcDNA3 HCV C-Fe，为下一步修饰和转染树突状细胞，制备能高效表达HCV C和Fc基因的树突状细胞疫苗做准备。方法：用分别含有Xhol I和Xba I初位点的人免疫球蛋白(IgG)Fc区基因上、下游引物，以含有人IgG基因序列的质粒pCMVsFc为模板，通过PCR扩增获得Fc区基因片段，基因片段回收后，以Xhol I和Xba I双酶切，定向插入到含HCV C基因的质粒PcDNA3 HCV C下游双粘端位点之间，获得重组表达质粒pcDNA3 HCVFc。通过酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行鉴定。以抗HCV C和抗Fc单克隆抗体为一抗，利用间接免疫荧光法检测pcDNA3 HCV-Fc在人肝癌细胞7721中的瞬时表达。结果：酶切、PCR及测定鉴定证实，pcDNA3 HCV—Fc插入片段为Fc区基因片段，免疫荧光法检测表明其可以在7721细胞中瞬时表达。结论：构建的质粒pcDNA3 HCV—Fc可以在7721细胞中瞬时表达Fc基因，为研究HCV C—Fc融合基因修饰的树突状细胞的功能奠定了基础。