牛主动脉内皮细胞的分离、培养及特征

目的:建立牛主动脉内皮细胞(BAEC)的体外研究模型,为体外研究内皮细胞的病理和生理过程提供重要手段.方法:用酶消化法分离BAEC,在pH为7.2的DMEM培养基中培养,鉴定内皮细胞中特异表达的第Ⅷ因子;以计数法测细胞的增殖能力,同时测定细胞的迁移.结果:细胞呈三角形,单层生长,第Ⅷ因子表达阳性,增殖呈指数生长,迁移正常.结论:提示牛主动脉内皮细胞的体外模型建立成功.     

胰岛素对牛胸主动脉内皮细胞血管内皮生长因子及其受体表达的影响

目的评价胰岛素对培养的牛胸主动脉内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)及其受体表达的影响.方法取新生的小牛胸主动脉,做血管内皮细胞原代及传代培养,取4～6代培养细胞分组应用不同浓度的胰岛素(30mU/L、300mU/L、3000mU/L)干预培养过程,48h后应用免疫组化法测定内皮细胞VEGF及其受体(flt-1、flk-1/KDR)的表达水平.结果低浓度胰岛素组(30mU/L、300mU/L)内皮细胞VEGF表达明显高于不用胰岛素组(P<0.01);高浓度组(3000mU/L)内皮细胞VEGF表达明显低于不用胰岛素组(P＜0.05);各组内皮细胞VEGF受体(flt-1及flk-1/KDR)的表达无明显差异(P＞0.05).结论低浓度胰岛素促进小牛主动脉血管内皮细胞VEGF表达;高浓度胰岛素可抑制血管内皮细胞VEGF表达;胰岛素对小牛主动脉血管内皮细胞VEGF受体(flt-1、flk-1/KDR)的表达无直接影响.     

胎牛主动脉内皮细胞的培养

目的 建立动脉内皮细胞（ＥＣｓ）的体外研究模型。方法 用消化法结合机械法的方法分离胎牛主动脉ＥＣｓ,在ｐＨ７．０的Ｍ１９９培养液中培养。结果 用Ⅷ因子相关抗原免疫荧光法以及倒置显微镜下细胞融合后呈单层生长、鹅卵石状排列,证实所培养的细胞为ＥＣｓ,在无内皮细胞生长因子的条件下体外连续培养的细胞达１８代。结论 在人动脉取材极为不易的情况下,胎牛主动脉ＥＣｓ的培养是很好的补充。     

鼠主动脉内皮细胞培养

血管内皮细胞(ECs)具有多种重要的生物学功能，而鼠类是常用的动物模型，因此建立简易、有效、重复性好的分离培养鼠主动脉ECs的方法，在心血管疾病、肿瘤扩散、免疫疾病研究中具有广泛的应用价值。     

TRPV4对高血压小鼠胸主动脉内皮细胞钙离子稳态的调节作用

目的:探讨瞬时受体电位香草素亚型4（transient receptor potential vanilloid type 4,TRPV4）在高血压小鼠胸主动脉内皮细胞中对于钙离子稳态的调节作用。方法:通过高盐饮食诱导小鼠高血压模型,分别在细胞和组织水平上使用钙离子荧光探针Flou-4/AM标记胸主动脉内皮细胞内钙,测定在TRPV4特异性激动剂GSK1016790A刺激下高盐饮食组和普通饮食组中细胞的钙离子浓度变化。结果:在胸主动脉内皮细胞的细胞和组织水平上通过使用GSK1016790A特异性激活TRPV4通道,普通饮食组和高盐饮食组细胞内钙离子浓度均增高（P<0.05）,但和普通饮食组相比较,高盐饮食组在GSK1016790A刺激下钙离子荧光强度增幅低于普通饮食组（P<0.05）。结论:TRPV4参与了小鼠胸主动脉内皮细胞钙稳态的调节,通过激活TRPV4,促进内皮细胞外钙离子内流进入胞内,从而维持细胞内钙离子的稳态,而在病理模型,高盐饮食诱导的高血压状态下,TRPV4调节小鼠胸主动脉内皮细胞钙内流的作用受损。     

SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代培养及鉴定

目的:研究SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞(RASMC)的培养方法及其生物学特性.方法:运用组织块贴壁法进行SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞培养,并用倒置相差显微镜观察、HE染色后形态学观察以及用免疫组化对培养细胞进行鉴定.结果:组织块贴壁法成功培养出SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞,培养的细胞呈典型"峰-谷"样生长,HE染色细胞呈梭形,胞浆丰富,核大而圆或椭圆,免疫组化S-P法检测a-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(a-SMActin)呈强阳性表达.传代纯化,细胞生长特性未见异常改变.结论:组织块贴壁法培养的SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞生长稳定,培养和纯化可同步进行,简单,方便.     

人主动脉内皮细胞体外培养方法的建立及生物学活性鉴定

目的：建立体外人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cells,HAECs）提取和培养的方法。方法：从术中取下的人主动脉组织上剥离内皮层,Ⅰ型胶原酶消化分离HAECs,利用显微镜观察其生长状况,免疫组织化学方法及流式细胞法鉴定及检测细胞纯度,以氧化低密度脂蛋白（oxidized low?density lipoprotein,ox?LDL）检测细胞吞噬功能并检测细胞在体外的血管生成能力。结果：0.1%及0.2%的Ⅰ型胶原酶,最佳消化时间均为50 min,2 h贴壁细胞数分别（25.2 ± 2.1）×103,（40.5 ± 3.8）×103）个。细胞融合后在倒置显微镜下呈“鹅卵石”样排列生长。血小板?内皮黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule?1,CD31）及Ⅷ因子鉴定为阳性,细胞纯度达（96.43 ± 4.12）%。细胞内吞ox?LDL及血管生成能力较好。结论：钝性分离主动脉内皮层,辅以Ⅰ型胶原酶消化是一种较好的HAECs获取方法,酶浓度及消化时间是其重要的影响因素。     

大鼠主动脉内皮细胞的贴壁法培养

为建立大鼠主动脉内皮细胞的培养方法,分离大鼠主动脉,采用组织块贴壁法进行内皮细胞原代培养并纯化传代,用免疫组织化学(SABC)法鉴定CD31抗原。结果,大鼠主动脉内皮细胞呈梭形或多角形,形成单层后,呈典型的鹅卵石样或铺路石样排列,并产生接触抑制现象。抗CD31抗原免疫组织化学法染色呈阳性。结论,大鼠内皮细胞贴壁培养法较简便经济。     

一种大鼠主动脉内皮细胞分离培养的改良方法

目的探索一套原代培养大鼠主动脉内皮细胞(RAEC)简单实用的方法体系。方法 SD大鼠两只,无菌环境下分离胸腹主动脉,清除脂肪、结缔组织。显微剪剪开主动脉,内膜面向下贴附于少量Ⅰ型胶原酶上消化60min。离心收集内皮细胞置于1%明胶包被的六孔板,加入20%胎牛血清的M199中培养。3～4天后换液更换内皮细胞培养基(ECM)培养。当细胞长满约90%底面积时,玻璃探针机械剔除成纤维样细胞后传代。倒置显微镜和抗Ⅷ因子抗体对细胞分别做形态学和免疫细胞化学鉴定。结果原代培养3～4天时,少量细胞开始贴壁并分裂生长。更换ECM后细胞增殖迅速,培养8～10天时可见细胞长满90%左右的底面积,呈典型的"铺路石"或"鹅卵石"征。免疫细胞化学鉴定表明在分离培养的内皮细胞中有特定Ⅷ因子表达。原代周期8～10天,传代周期3～4天,经纯化传代后纯度接近100%。传至第6代仍未见细胞分裂增殖活性下降。结论本实验体系培养RAEC简单有效,重复性良好。获得细胞数量多、纯度高,有利于实验人员掌握。     

人循环内皮祖细胞的分离培养和诱导分化

目的研究人循环内皮祖细胞（EPCs）分离、培养、分化及鉴定。方法采用Ficoll密度梯度离心法从人外周血中分离单个核细胞,接种于含血管内皮生长因子（VEGF）及优质胎牛血清的M199培养液中,对其进行体外诱导分化培养,以免疫组化、细胞荧光化学法及流式细胞检测法鉴定贴壁细胞的内皮细胞特异性标志。结果人外周血单个核细胞（MNCs）经体外培养,表达内皮细胞的特异性抗原,包括VWF、CD31和CD34,并显示出能内吞乙酰化低密度脂蛋白（ac-LDL）,结合UE小1等内皮细胞特性,提示这些细胞具有内皮细胞的表面蛋白特性和具有内皮细胞功能。结论人外周血中存在具有分化增殖能力的EPCs,在一定培养条件下可分化为血管内皮细胞。     

随机贴块法培养大鼠主动脉内皮细胞及其鉴定

目的 寻找一种培养及鉴定大鼠主动脉内皮细胞的简便方法.方法 采用随机贴块法培养大鼠主动脉内皮细胞并用差速消化法加以纯化,观察细胞形态学特性,用抗vwF抗体免疫荧光染色及内皮细胞体外成管试验鉴定.结果 培养3d即有细胞生长,1周可融合成层.抗vwF抗体免疫荧光染色及内皮细胞体外成管试验阳性.结论 本方法简便易行,适于推广应用.     

用培养的大鼠血管内皮细胞建立血管紧张素转换酶体外模型初步研究

目的分离大鼠肺血管及腹主动脉的内皮细胞,建立研究血管紧张素转换酶(ACE)表达的体外模型。方法分离大鼠肺血管内皮细胞采用活体胶原酶灌注法、腹主动脉内皮细胞采用贴壁法;二种方法均用胰酶不完全消化和加入血清或无血清培养相结合的方法得到纯化的内皮细胞。结果肺血管内皮细胞灌注法细胞传代至第4代后其增生速度趋于稳定,内皮细胞纯度达到95%以上,冻存后细胞复苏率(0.816±0.085)和贴壁率(0.758±0.079)均较高、生长良好。腹主动脉内皮细胞贴壁法第4代传代后细胞增生速度较慢,纯度为78%,冻存后传代细胞复苏率为0.724。结论肺血管内皮细胞灌注法分离到的大鼠肺血管内皮细胞,纯度高,可作为进一步研究ACE调控的良好体外模型。     

血凝酶对大鼠离体胸主动脉环收缩作用的影响

目的:研究血凝酶(Reptilase,RTA)对离体大鼠胸主动脉的收缩作用与机制。方法:制备离体大鼠胸主动脉环,经生物信号采集与分析系统测定血管环的张力变化。分有内皮组和去内皮组,采用累计加药法,观察血凝酶对去氧肾上腺素(PE)和氯化钾(KCl)预收缩的胸主动脉环收缩张力的影响。结果:血凝酶对PE预收缩的胸主动脉环产生浓度依赖性的收缩作用,对内皮完整PE预收缩血管环组显著高于去内皮组;而对KCl预收缩的胸主动脉环张力无显著影响;在内皮完整的血管,预孵内皮素转化酶抑制剂磷阿米酮(phosphoramidone,5×10-6mmol/L,PAMD)后,血凝酶对PE预收缩张力明显低于未孵育组(P<0.01);在去内皮的血管环上,应用EDTA(3mmol/L)螯合细胞外Ca2+或LaCl3(100μmol/L)后,可明显阻断血凝酶对PE预收缩作用(P<0.01)。结论:血凝酶对PE预收缩的胸主动脉环的收缩作用呈浓度依赖性,其机制可能为有内皮细胞途径参与,促进内皮素释放,对PE缩血管产生协同效应;还可能与血管平滑肌上有受体操纵性钙通道(receptor-operated calcium chan-nel,ROCC)[1]参与,增加血管平滑肌钙内流有关。     

胎鼠神经干细胞分离培养和鉴定

目的:建立胎鼠神经干细胞体外培养方法,观察神经干细胞生长特点。方法:采用含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的无血清培养基对大鼠胚胎大脑组织细胞悬液进行培养,细胞免疫荧光方法对神经干细胞鉴定,MTT法测定不同细胞密度的OD值,绘制生长曲线。结果:从胎鼠脑组织分离培养的细胞巢蛋白阳性。MTT结果显示细胞接种密度以2(×104～105)/ml生长良好(r=0.95,P<0.05)。结论:无血清培养基分离培养的胎鼠脑组织神经干细胞具有自我更新和增殖能力,巢蛋白细胞免疫鉴定为神经干细胞。     

The Effectof the Lyso PC-induced Endothelial Cell Conditioned Medi-um on Proliferating Cell Nuclear Antigen Expression of the Calf Tho-racic Aorta Smooth Muscle Cell

Proliferation of aorta smooth muscle cells(ASMCs) and move towards aortas intima layer isthe fundamental pathological change in atheroscle-rosis(AS) .Plasma low density lipoprotein(LDL)and especially the increased density of oxidized(Ox- LDL can speed up the formation of AS[1] . Inthe process of oxidation of LDL,phos-phatidylcholine (PC) is changed into Lysophos-phatidylcholine (Lyso PC) and constitutes the mainphosphatide ingredient of Ox- LDL[2 ] . Owing tothe real expression of a…     

大鼠胸导管内皮细胞的体外培养和观察

目的 体外培养大鼠胸导管内皮细胞，为研究淋巴管内皮细胞的生理功能、病理改变以及分子水平调节等提供手段。方法 术前用脂肪喂食大鼠，标记胸导管，将胸导管两端结扎，取下胸导管后充分分离和剪碎，在RP—MI1640培养液中直接培养，观察胸导管内皮细胞的生长。结果 胸导管内皮细胞呈铺路石样生长，Ⅶ因子相关抗原呈阳性反应。结论 此法简便易行，是获取淋巴管内皮细胞的一种可靠的方法。     

兔骨髓诱导的内皮细胞和纤维蛋白凝胶体外共培养

目的将兔骨髓诱导的内皮细胞接种于纤维蛋白凝胶内并观察其生长增值情况。方法梯度离心分离兔骨髓单个核细胞（MNCs）,直接向内皮细胞诱导培养,传代培养至第2代细胞,倒置显微镜观察细胞形态及生长特点,免疫组化鉴定;以10^5密度接种于纤维蛋白凝胶中培养并定期观察细胞生长情况,单纯细胞及胶原内的细胞分别用MTT法检测其生长并绘制生长曲线,胶原切片并作苏木精．伊红染色观察细胞在胶原内的生长。结果诱导的内皮细胞为铺路石样。呈单层生长,第2代细胞CD31、八因子相关抗原免疫组化均为阳性,摄取低密度脂蛋白和结合凝集素实验均阳性;细胞在纤维蛋白凝胶内成立体生长,细胞在纤维蛋白凝胶内3d后成梭形铺开,6d后自发形成管腔样结构;细胞在纤维蛋白凝胶内生长曲线成“s”形。结论骨髓诱导的内皮细胞在纤维蛋白凝胶内生长增值良好,纤维蛋白凝胶可以作为接种骨髓诱导的内皮细胞的基质材料。     

小鼠动脉血管内皮细胞的原代培养和鉴定

目的探讨小鼠动脉血管内皮细胞分离、培养的方法,为进一步实验研究提供相应的技术手段。方法手术显微镜辅助下取小鼠主动脉,去除外膜及脂肪组织,将血管剪成1 mm×1 mm大小的组织块,用植块法在含20%胎牛血清的DMEM培养液中培养。倒置相差显微镜观察细胞形态和生长特征,免疫细胞化学方法进行血管内皮细胞Ⅷ因子相关抗原(von Willebrand factor,vWF)鉴定。结果60 h后,相差显微镜下可观察到内皮细胞从组织块边缘游出,12天左右细胞开始融合成片,免疫染色相关抗原检测呈阳性。结论用组织块培养方法可以获取较为满意的小鼠血管内皮细胞。