RhoA-Rock信号通路在转化生长因子β1诱导大鼠腹膜间皮细胞转分化中的作用

目的　探讨RhoA-Rock信号通路在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）转分化中的作用。 方法　体外培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞,静止24 h后,采用随机数字表法随机分为以下4组：正常对照组、TGF-β1（10 μg/L）刺激组、TGF-β1（10 μg/L）＋Y-27632（Rock特异性抑制剂,10 μmol/L）组（Y-27632预处理2 h）、Y-27632（10 μmol/L）组。用TGF-β1（10 μg/L）刺激RPMC不同时间,观察α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,E钙黏素（E-cadherin）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）的表达。RT-PCR法检测E-cadherin、α-SMA 和ColⅠmRNA表达。Western印迹法检测RhoA（包括总RhoA及活化的RhoA）、E-cadherin、α-SMA、ColⅠ和波形蛋白（vimentin）表达。活化的RhoA由膜蛋白提取试剂盒提取。 结果 （1）TGF-β1（10 μg/L）刺激RPMC能诱导RhoA活化,于10 min开始出现活性升高,为对照组的（2.57±0.52）倍（P < 0.05）;1 h达高峰,为对照组的（4.35±0.41）倍（P < 0.05）。（2）TGF-β1（10 μg/L）刺激RPMC能导致E-cadherin mRNA和蛋白表达下调,α-SMA、ColⅠmRNA和蛋白表达上调,呈时间依赖性。（3）Rock特异性抑制剂Y-27632能显著下调α-SMA、ColⅠmRNA的表达,较TGF-β1刺激组各降低了53.8%和55.7%（均P < 0.05）,并且能下调α-SMA、ColⅠ和vimentin蛋白的表达,较TGF-β1刺激组分别降低了42.6%、60.1%和58.1%（均P < 0.05）,但不能上调E-cadherin mRNA和蛋白的表达。 结论　TGF-β1可通过RhoA-Rock信号通路介导大鼠腹膜间皮细胞转分化,抑制该通路可作为防治腹膜纤维化的潜在靶点。     

高糖对人腹膜间皮细胞局部内皮素系统表达的影响

目的:研究高浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞(HPMC)局部内皮素系统表达的影响,并应用非特异性内皮素受体拮抗剂即ETA/ETBR拮抗剂PD142893进行干预,探讨高浓度葡萄糖透析液导致腹膜受损的机制.方法:以人腹膜间皮细胞株(HMrSV5)为研究对象,采用放免法检测不同时间(12 h、24 h和48 h)、不同浓度(50、100、150、200、250 mmol/L)的葡萄糖、甘露醇作用下HPMC分泌的ET-1水平.采用半定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测局部内皮素系统ET-1、ETAR、ETBR及ECE的基因表达.采用ELISA检测不同浓度ET-1、葡萄糖作用下IL-1β水平,并在此基础上加入PD142893,观察IL-1β的变化.结果:(1)正常HPMC分泌低水平的ET-1,高浓度的葡萄糖可诱导HPMC分泌 ET-1增加,呈时间和剂量依赖.高浓度的甘露醇作用下,HPMC分泌的ET-1与正常对照组相比未见明显差异.(2)正常HPMC表达完整的ET-1、ETAR、ETBR、ECE mRNA.高糖作用下ET-1、ETAR、ETBR mRNA表达增强,而高糖对ECE mRNA的表达无明显影响.(3)ET-1、高糖刺激HPMC分泌IL-1β,呈剂量依赖.PD142893可明显减少高糖诱导的IL-1β的分泌.结论:正常HPMC存在局部内皮素系统,高浓度葡萄糖诱导其表达增加,高浓度葡萄糖透析液导致腹膜受损可能部分通过内皮素途径,内皮素可能是导致CAPD患者腹膜纤维化的重要因素.     

高糖与炎症因子及黄芪对人腹膜间皮细胞毒性的影响

目的:研究不同浓度的含糖腹透液、多种炎症因子以及二者的共同作用对人腹膜间皮细胞损伤的影响,并探索中药黄芪对此的干预作用.方法:用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定细胞毒性,观察各种因素(不同浓度的含糖腹透液与炎症因子的组合、多种炎症因子及其组合和中药黄芪)对体外培养人腹膜间皮细胞株损伤的影响.结果:4.25%腹透液使细胞破坏明显增加,P＜0.05;4.25%腹透液+TNF-α或(LPS+TNF-α+IL-1β)进一步加剧细胞损伤,P＜0.05和P＜0.01.黄芪明显减少细胞破坏,在1.5%腹透液情况下,P＜0.001;在TNF-α和LPS+TNF-α+IL-1β情况下,P＜0.05.结论:黄芪减少腹膜间皮细胞损伤,在炎症因子或含糖腹透液条件下,黄芪仍有保护间皮细胞的作用.     

高糖对人腹膜间皮细胞整合素表达的影响

目的:研究高糖对人腹膜间皮细胞(HPMC)整合素表达的影响,探讨腹膜透析中腹膜间皮细胞层完整性损伤的机制.方法:采用人腹膜间皮细胞株HMrSV5为研究对象.观察高浓度葡萄糖对HPMC细胞膜表面整合素表达及基质黏附性的改变,并采用免疫荧光技术观察高糖对细胞Actin微丝骨架的影响.结果:(1)高糖致细胞脱落呈时间依赖效应;(2)高糖引起细胞膜上β1整合素的表达明显减低;(3)高糖使Actin微丝骨架解体;(4)高渗透压组未见上述效应.结论:高糖使β1整合素表达下降,微丝骨架解体,从而损害细胞-基质间黏附的形成,造成腹膜间皮完整性的损害.     

高糖对大鼠腹膜间皮细胞中P21WAF1基因表达的影响

目的研究细胞周期调控蛋白p21WAF1在高糖对腹膜间皮细胞增殖抑制中的作用.方法用流式细胞仪技术及半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定不同浓度的葡萄糖对体外培养的大鼠腹膜间皮细胞细胞周期分布和p21WAF1mRNA表达的影响.结果在高糖的培养条件下,大鼠腹膜间皮细胞出现细胞肥大,胞核增多,细胞分裂停止,且大多数间皮细胞的细胞周期停滞于G1期.在静止期的间皮细胞几乎无p21WAF1mRNA的表达,在高浓度葡萄糖刺激下p21WAF1mRNA明显增加,且随着浓度增高而表达增高,且含糖浓度为3.86%时p21wAF1的表达比含糖为1.38%时明显增高(P＜0.05).在和含糖浓度为3.86%、1.38%组渗透压相同的甘露醇组也几乎无p21wAF1mRNA的表达.结论p21wAF1可能在高糖对间皮细胞的抑制作用及G1期阻滞中起重要的调节作用.     

线粒体呼吸链在高糖腹膜透析液诱导人腹膜间皮细胞层高通透性中的作用

目的 研究线粒体呼吸链在高糖腹膜透析液（PDS）诱导人腹膜间皮细胞（HPMC）通透性升高中的作用,探讨高糖PDS导致腹膜高通透状态的分子机制。 方法 体外培养HPMC,用不同浓度葡萄糖PDS加或不加抗氧化剂谷胱甘肽,培养24 h。采用跨细胞电阻（TER）技术测定HPMC通透性的变化;免疫荧光及Western印迹观察claudin-1的表达;线粒体活性氧（ROS）荧光探针检测细胞线粒体ROS的生成;线粒体呼吸链酶复合物活性检测试剂盒检测复合物Ⅰ~Ⅳ的活性变化。 结果 各组细胞的TER值均随时间的延长而下降,4.25% PDS组TER值24 h内从（34.7±1.5） Ω&#8226;cm2下降至（4.3±1.4） Ω&#8226;cm2;高糖PDS使细胞间连接蛋白claudin-1的表达显著下调,葡萄糖浓度越高作用越明显;同时高糖PDS导致线粒体呼吸链酶复合物Ⅲ活性较对照组下降89.2%（P < 0.01）,进而使线粒体ROS产生增加。谷胱甘肽可逆转上述指标的变化。 结论 高浓度葡萄糖PDS通过抑制线粒体呼吸链酶复合物Ⅲ的活性,引起HPMC的氧化损伤,进而导致腹膜间皮细胞层的高通透性增高。     

NADPH氧化酶介导血管紧张素Ⅱ诱导的腹膜间皮细胞转分化及细胞外基质积聚

目的 探讨NADPH氧化酶在血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的腹膜间皮细胞转分化以及细胞外基质积聚中的作用。 方法 体外培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞，静止24 h后，随机分为以下4组：正常对照组，AngⅡ（10^-7 mol/L）组，AngⅡ+ Los(洛沙坦,10 μmol/L)组及AngⅡ+DPI（NADPH氧化酶活性抑制剂，10 μmol/L）组。应用荧光染料（DCF）及激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧（ROS）的产生。RT-PCR检测NADPH氧化酶亚单位p47phox以及纤溶酶原激活物抑制剂（PAI）1、α平滑肌肌动蛋白（SMA）、E钙黏蛋白（cadherin） mRNA的表达。Western印迹检测p47phox、α-SMA的蛋白表达。 结果 （1）外源性AngⅡ可显著增加大鼠腹膜间皮细胞ROS的产生，刺激15 min后，ROS 的表达较对照组上升了(3.64±0.53)倍。DPI和洛沙坦可显著抑制AngⅡ刺激后ROS的产生（P < 0.05）。（2）AngⅡ刺激腹膜间皮细胞后， NADPH氧化酶亚单位p47phox mRNA和蛋白的表达均呈上升趋势。洛沙坦和DPI可阻断由AngⅡ诱导的p47phox表达上调（P < 0.05）。（3） AngⅡ诱导α-SMA表达的上调以及 E-cadherin mRNA的下调, 洛沙坦和DPI可部分逆转AngⅡ的这种作用。（4）AngⅡ刺激8 h后可明显上调PAI-1的mRNA表达，为正常对照组的（3.06±0.77）倍。 洛沙坦和DPI可明显阻断PAI-1的表达上调（P < 0.05）。 结论 NADPH氧化酶依赖产生的ROS介导了AngⅡ诱导的腹膜间皮细胞转分化及细胞外基质积聚。阻断AngⅡ的作用及抑制NADPH氧化酶的表达和活性可作为防治腹膜纤维化的潜在治疗靶点。     

透明质酸合成酶-2在人腹膜间皮细胞透明质酸合成及胞外基质形成中的作用

目的 明确哪一种透明质酸合成酶是人腹膜间皮细胞合成透明质酸及形成细胞外基质/胞衣样结构的主要酶。方法 分离培养人腹膜间皮细胞,以半定量RT-PCR法检测其3种透明质酸合成酶HAS-1、HAS-2、HAS-3 mRNA水平表达情况。明确正常培养人腹膜间皮细胞主要表达HAS-2mRNA和微量HAS-3 mRNA后,设计HAS-2的反义寡核苷酸序列,以脂质体介导法将其转入正常培养的人腹膜间皮细胞。转染前(0 h)、转染后8、24、48 h以RT-PCR法观察HAS-2 mRNA表达情况,并以微粒排除法观察细胞衣样结构面积变化。结果 转染后8和24 h,HAS-2 mRNA表达分别下降58％和89％(P均<0.05);转染后48 h HAS-2 mRNA表达已部分恢复至正常表达的25％水平(P<0.05)。相应地,转染后24 h以微粒排除法观察人腹膜间皮细胞细胞外基质/胞衣样结构面积与细胞体面积比值,亦明显减少至几乎完全消失。作为对照的正义序列和逆转序列则无该作用。结论 HAS-2是正常培养人腹膜间皮细胞合成透明质酸以及细胞外基质/胞衣样结构形成的关键酶。     

p38信号通路对腹膜间皮细胞p27kip1和纤连蛋白的影响

目的 探讨p38有丝分裂素激活蛋白激酶(MAPK)对高糖诱导的人腹膜问皮细胞(HPMC)p27^kip1的表达和纤连蛋白(FN)分泌的影响。方法 同步化生长融合的HPMC在有或无p38 MAPK抑制剂SB203580的条件下和不同浓度的葡萄糖共同孵育。采用Bradford法测定细胞内总蛋白量。采用逆转录．聚合酶链反应(RT．PCR)方法检测p27^kip1 mRNA的表达。p27^kip1和p38 MAPK蛋白用Western印迹法测定。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞培养液FN水平。结果 高糖刺激HPMC时细胞内总蛋白量、p27^kip1蛋白及细胞培养液里的FN蛋白水平明显升高。抑制p38 MAPK活性可有效阻断高糖介导的腹膜间皮细胞p27^kip1的表达及FN的分泌。结论 高糖通过p38 MAPK的活化可上调HPMC p27^kip1的表达和FN的分泌。     

姜黄素通过调节小凹蛋白1改善高糖透析液诱导的腹膜间皮细胞转分化

目的:通过观察姜黄素对腹膜间皮细胞小凹蛋白1(caveolin-1,cav-1)表达及腹膜间皮细胞间充质转分化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)的影响,探讨姜黄素防治腹膜透析相关腹膜纤维化的作用及机制。方法:体外培养人腹膜间皮细胞株(HMrSV5细胞),将细胞随机分为：对照组(control组)、模型组(PDS组)、干预组(PDS+姜黄素组),采用Western-blot、Real time-qPCR、免疫荧光法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E钙黏蛋白(E-cadherin)、转化生长因子β₁(TGF-β₁)、及cav-1的表达。然后通过基因siRNA基因沉默的方法构建cav-1低表达的人腹膜间皮细胞系,采用Western-blot、Real time-qPCR法检测α-SMA、E-cadherin、TGF-β₁及p-smad2的表达。结果:高糖腹膜透析液诱导可导致α-SMA及TGF-β₁表达的上调同时导致E-cadherin、cav-1表达...     

过氧化氢对人腹膜间皮细胞产生IL-8、MCP-1的影响

目的：研究不同浓度的过氧化氢对培养的人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells,HPMC)产生趋化蛋白—百介素—8(IL—8)、单核细胞趋化蛋白—1(MCP—1)的影响以及高糖环境下、抗氧化剂丙酮酸存在时过氧化氢作用的改变。方法：分别在不同浓度的葡萄糖环境下，用不同浓度外源性小剂量过氧化氢、丙酮酸刺激细胞，用半定量PT—PCR方法测IL—8、MCP—1基因水平，用ELISA方法测定IL—8表达。结果：(1)亚毒剂量的过氧化氢可以使HPMC表达IL—8增加，但对MCP—1 mRNA的影响不大。且高糖环境下，外源性过氧化氢能够使HPMC产生更多的IL—8。(2)加入丙酮酸后，IL—8的表达下降，而MCP—1的表达未见明显的改变。结论：(1)外源性小剂量的过氧化氨可使HPMC产生IL—8增加，且高糖环境使之作用增强，可能增加透析液的生物不相客性。(2)丙酮酸能够对抗氧化应激，对HPMC具有保护作用。     

艾塞那肽通过p38MAPK通路对成骨细胞促增殖和抗凋亡的作用研究

目的探讨艾塞那肽通过p38MAPK通路对成骨细胞促增殖和抗凋亡的作用机制。方法将小鼠成骨细胞MC3T3-E1Subclone 14分为对照组、艾塞那肽组、棕榈酸钠组、棕榈酸钠组+艾塞那肽组,分别使用相应试剂培养48 h。通过CCK-8和流式细胞术检测细胞活力与凋亡。通过Western blot检测细胞中P38MAPK、Cyclin D1、Caspase-3的蛋白水平。结果艾塞那肽对正常细胞活力无显著影响(P0.05),棕榈酸钠组的细胞活力显著低于对照组(P0.01),艾塞那肽+棕榈酸钠组的细胞活力显著高于棕榈酸钠组(P0.01);艾塞那肽对正常细胞凋亡无显著影响(P0.05),棕榈酸钠组的细胞凋亡率显著高于对照组(P0.01),艾塞那肽+棕榈酸钠组的细胞凋亡率显著低于棕榈酸钠组(P0.01);艾塞那肽对正常细胞中P38MAPK、Cyclin D1和Caspase-3蛋白水平无明显影响(P0.05),棕榈酸钠组的P38MAPK和Caspase-3显著高于对照组而Cyclin D1显著低于对照组(P0.01),艾塞那肽+棕榈酸钠组的P38MAPK和Caspase-3显著低于棕榈酸钠组而Cyclin D1显著高于棕榈酸钠组(P0.01)。结论艾塞那肽可以通过p38MAPK通路,减少Caspase-3蛋白并上调Cyclin D1蛋白的表达,抑制高脂环境下成骨细胞的凋亡并提高细胞活力。     

p16/p38 MAPK/p53/Wip1通路在乳腺癌发生、发展中的作用及其临床意义

目的 探讨p16/p38 MAPK/p53/Wip1通路在乳腺癌发生、发展中的作用及其临床意义.方法 应用免疫组织化学方法检测70例乳腺癌组织、癌旁组织、20例正常乳腺组织中Wip1、p53、p38 MAPK、p16蛋白的表达,并对Wip1蛋白高表达与p53、p38、p16蛋白表达进行相关分析.结果 3种组织中Wip1蛋白高表达率分别为62.9%(44/70)、2.9%(2/70)、0(0/20).乳腺癌组织比癌旁组织、正常乳腺组织明显升高(P＜0.01).Wip1蛋白高表达与p53、p38、p16蛋白表达呈负相关(P＜0.01,等级相关系数rs分别为-0.529、-0.626、-0.499).结论 p16/p38 MAPK/p53/Wip1是负反馈通路,它可能在乳腺癌发生发展中起重要作用.     

松弛素对高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化及分泌细胞外基质的影响

目的:观察人松弛素(Relaxin)对高糖培养人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化、分泌细胞外基质的影响。方法:实验分组:正常糖组:含5.5 mmol/L葡萄糖;高糖组:含30 mmol/L葡萄糖;高渗组(甘露醇组);高糖+松弛素干预组;ELISA法检测细胞上清中TGF-β1、细胞胶原(ColⅠ)、纤连蛋白(FN)的表达。免疫印迹技术(Western blot)检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达,确定肾小管上皮细胞表型转化情况。结果:与正常糖组相比,高糖组肾小管上皮细胞分泌ColⅠ、FN、TGF-β1显著增加,在高糖培养基中加入人松弛素干预后可显著抑制由高糖诱导的ColⅠ、FN、TGF-β1的高表达,降低α-SMA表达,抑制肾小管上皮细胞转分化。结论:松弛素能抑制高糖诱导HK-2细胞分泌细胞外基质,抑制HK-2细胞转分化,具有抗纤维化作用。     

脂多糖作用下腹膜间皮细胞骨桥蛋白表达及乌司他丁的影响

目的：观察脂多糖对大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）中骨桥蛋白（OPN）表达的影响;观察乌司他丁（ulinastatin）作用下RPMC的OPN细胞分布及mRNA表达的影响。方法：胰蛋白酶法行RPMC的原代培养和传代,经鉴定第3代细胞融合至80%时分组。正常对照组：不同浓度LPS（50,100μg/ml）组;50μg/mlLPS作用不同时间（8,12,24,34,48h）组;乌司他丁组：（160,320,640U/ml）与LPS50mg/L作用24h,RealTime-RT-PCR技术检测骨桥蛋白（OPN）、TGF-β1mRNA的表达。结果：LPS可刺激RPMC的骨桥蛋白表达显著增加,呈剂量、时间依赖性（P〈0.05）;乌司他丁可降低LPS引起的RPMC中的骨桥蛋白表达,呈剂量依赖性（P〈0.05）。结论：脂多糖通过上调骨桥蛋白的表达,引起腹膜损伤导致腹膜纤维化,乌司他丁可以一定程度抑制骨桥蛋白引起的腹膜纤维化过程。     

p38 MAPK在LPS诱导内皮细胞表达ICAM-1中的作用

目的 研究p38丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号转导通路在脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)表达细胞间粘附分子-1(ICAM—1)中的作用。方法 脐静脉内皮细胞培养后分为两组：(1)刺激组,设不同时相点分别用LPS刺激内皮细胞;(2)预处理组,在LPS刺激前2h,用SB203580预处理内皮细胞。观察ICAM—1蛋白和mRNA表达的变化,检测内皮细胞p38MAPK活性变化。结果 LPS刺激后,内皮细胞表面ICAM—1分子在8～36h显增加,胞浆中mRNA在2h即有显增加;LPS刺激HUVEC后15min,p38MAPK活性即有升高,30～60min达高峰。p38抑制剂SB203580可显抑制LPS的诱导作用。结论 LPS可能通过激活p38MAPK信号转导通路,调节HUVEC的ICAM—1基因和蛋白表达。     

FK506对大鼠缺血再灌注肾细胞间黏附分子-1,p38丝裂原活化蛋白激酶表达的影响

目的探讨FK506对肾缺血再灌注不同时间细胞间黏附分子-1(ICAM-1),p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)蛋白表达的影响。方法采用HE染色分析缺血再灌注肾组织病理损伤程度,免疫组织化学二步法检测缺血再灌注肾不同时间ICAM-1,p38MAPK蛋白表达的变化。结果ICAM-1蛋白以在肾血管表达为著。缺血45 min,再灌注2 h有少量表达(11.52±0.45),再灌注6、12 h呈阳性表达,直至24 h仍有增高趋势(20.54±1.17),FK506 IR组肾组织ICAM-1蛋白水平显著低于IR组(P<0.05)。p38MAPK蛋白主要在远曲小管上皮细胞表达,缺血45 min,再灌注2 h有少量表达(25.25±1.97),再灌注6、12 h及24 h呈阳性表达,6 h达高峰(42.03±1.85),FK506 IR组肾组织p38MAPK蛋白水平显著低于IR组(P<0.01)。苏木素-伊红(HE)染色可见IR组肾小管上皮细胞有不同程度的片状坏死灶和炎性细胞浸润,FK506 IR组肾组织损伤明显减轻。结论FK506可能通过下调ICAM-1,p38MAPK蛋白表达水平,减轻肾缺血再灌注损伤。