大鼠体外肝细胞集落的建立及生长调控研究

目的研究建立体外培养肝细胞集落的关键条件,探讨肝细胞克隆生长的调控机制。方法采用原位预灌流和胶原酶循环灌流分离肝细胞,观察在化学限定培养条件下,肝细胞生长素(HPN)、二甲亚砜(DMSO)及尼克酰胺(NA)对肝细胞DNA合成、有丝分裂象、光镜形态和电镜超微结构的影响。结果肝细胞培养时间进程显示:10 mmol/L NA显著协同HPN促进肝细胞3H-TdR掺入作用,在60和84 h出现2个DNA合成峰;2% DMSO抑制3H-TdR掺入,但在NA共同作用下,肝细胞在132 h表现为DNA合成峰。有丝分裂象显示:HPN NA DMSO培养72 h时肝细胞为正常二级分裂,168 h后仍保持相当的有丝分裂活性。光镜下形态及电镜超微结构观察到培养28 d的肝细胞克隆生长特征及增殖潜在性。结论NA及DMSO加入-移除方案可交叉控制HPN作用的肝细胞增殖,所构建的肝细胞克隆生长系统可用于人肝细胞代谢、诱变、细胞中毒及生物转化等研究,并为实施体外克隆肝细胞治疗肝衰竭及遗传性肝疾病提供实验依据。     

红花对增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

目的探讨红花对增生性瘢痕成纤维细胞（HSFB）增殖和胶原合成的影响及其意义。方法通过MTT比色试验和生长曲线测定法检测红花对体外培养的HSFB增殖活性的影响；^3H-脯氨酸掺入法测定红花对细胞胶原蛋白合成的影响；用光镜和电镜观察药物作用后HSFB形态学和超微结构的改变。结果红花可明显抑制HSFB的增殖和胶原蛋白的合成，且在一定范围内具有时间-剂量依赖性，以8μg／ml浓度组第3天作用最为显著；HSFB的形态和超微结构呈抑制改变。结论红花具有抑制HSFB增殖和胶原合成的作用，为应用该药治疗瘢痕提供了实验依据。     

体外灌流装置分离肝细胞的初步探索

目的　探索和建立一种消化分离肝细胞的体外简易灌流装置及方法。方法　采用蠕动泵、特制水浴恒温箱、硅胶管、不锈钢网、塑料留置注射软管针头等组装成简易灌流装置 ,对成年家兔、新生中国实验小型猪和人胎肝进行体外两步灌流 ,综合评价分离肝细胞的效果。结果　灌流装置两步法消化分离肝细胞的活力为 84%～ 98% ,细胞获得量为( 3 .5～ 9.2 )× 10 6/g ,普通条件接种培养后细胞贴壁、生长均良好。结论　自制体外灌流装置消化分离肝细胞简便、快捷、可靠 ,尤其适宜于较大动物肝细胞的大量分离     

肝细胞生长因子对多囊肾病囊肿衬里上皮细胞增殖及细胞外基质合成的影响

目的：研究重组人肝细胞生长因子（rhHGF）对常染色体显性遗传型多囊肾病（ADPKD）囊肿衬里上皮细胞增殖及细胞外基质合成的影响。方法：用^3H-TdR掺入法测定不同浓度（0．5、1、2．5、5ng/ml)rhHGF作用48h以及最适浓度的rhHGF分别作用24、48、72h ADPKD囊肿衬里上皮细胞系细胞的增殖情况;并分别用^3H-脯氨酸掺入法和放免法测定最适浓度rhHGF作用最佳时间后ADPKD囊肿衬里上皮细胞系细胞胶原及层粘连蛋白的合成情况。结果：rhHGF促进了ADPKD囊肿衬里上皮细胞增殖及胶原和层粘连蛋白的合成,以1ng/ml持续作用48h最为显。结论：rhHGF对体外培养的ADPKD囊肿衬里上皮细胞增殖及细胞外基质合成有明显的促进作用。     

大鼠原代培养肝细胞的生物学特性研究

目的 :观察培养的原代大鼠肝细胞形态学和功能的动态变化 ,探讨其短期培养内的最佳功能状态。方法 :采用Seglen胶原酶二步灌流法分离肝细胞。光镜、透射电镜和免疫组化方法观察细胞形态学改变 ;并收集不同时期培养上清监测生化指标的改变。结果 :平均每只大鼠肝获取 1.2 1× 10 8个肝细胞 ,平均活力为 93.6 %。光镜下见肝细胞生长良好 ,可存活 3周 ,电镜下可见丰富的细胞器 ,细胞连接及胆小管 ,细胞角蛋白 18强阳性表达。肝细胞功能检测白蛋白分泌及尿素合成功能在第 3,4天时较好。结论 :肝细胞的形态和功能具有一致性 ,原代肝细胞在培养第 3,4天功能较好 ,可能为肝细胞移植和生物人工肝应用的最佳时机。     

改良原代大鼠肝细胞的体外分离培养和功能研究

目的建立经济有效且功能良好的原代肝细胞体外分离培养系统。方法采用0.02%胶原酶和Percoll分离液分离纯化大鼠肝细胞,光镜和电镜下观察HepatoZYME-SFM培养的肝细胞形态,自动生化仪定期检测培养肝细胞功能,RT-PCR半定量方法检测白蛋白mRNA,高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)分析安定代谢能力。结果分离纯化的大鼠肝细胞总数(2～3)×108cells/整肝,活力和纯度大于95%,生长良好形态正常。培养3d后ALT、AST显著下降,加入NH4Cl后8d内BUN保持相对稳定高水平,白蛋白合成在第3～4天达到高峰,培养的2～5d内肝细胞可有效清除安定。结论通过使用低浓度胶原酶灌流、Percoll分离液纯化以及HepatoZYME-SFM无血清培养基培养,肝细胞可有效保持良好形态结构和一定的生物合成代谢能力。     

抑癌基因p27对增生性瘢痕成纤维细胞增殖及DNA合成的影响

目的：探讨抑癌基因p27对增生性瘢痕的作用。方法：取体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞（HTsFb），将构建的pcDNA3-p27真核表达质粒体外转染HTsFb，经G418筛选获得稳定性表达的细胞克隆，用MTT和^3H-TdR掺入法观察抑癌基因p27对HTsFb增殖及DNA合成的影响。结果：抑癌基因p27对HTsFb增殖及DNA合成均有显著抑制作用。结论：抑癌基因p27可能通过抑制成纤维细胞增殖及DNA合成抑制瘢痕增生。     

体外培养树鼠句肝细胞的初步观察

目的 探讨体外培养的树Qu肝细胞形态结构与生物合成功能。方法 采用体外两步灌流法分离肝细胞,以L15培养基予以培养,光电镜下动态观察细胞形态结构,同时检测不同时相点培养上清中蛋白及甲胎蛋白含量。结果 采用简易体外两步灌流法分离的肝细胞,经台盼蓝拒染试验证实肝细胞的存活率为90％,体外培养的肝细胞在第3－10天具有良好的增殖分化功能,维持此形态和功能至培养第18天。结论 体外培养的树Qu肝细胞具有良好的形态结构和生物合成能力,能够满足肝炎病毒体外研究培养的需要。     

胃泌素受体拮抗剂对人结肠癌株生长抑制作用的研究

目的：研究胃泌素受体拮抗剂丙谷胺（PGL）对体外培养的人结肠癌细胞株HCT116的抑制作用。方法：体外培养人结肠癌细胞株HCT116，加入不同浓度的PGL，应用流式细胞分析仪（FCM）、光镜及电镜观察，细胞周期、DNA含量、形态与超微结构的变化。结果：癌细胞经PGL作用后，其DNA含量明显减少，处在G0／G1期细胞明显减少，与对照组相比，差异显著。光镜下癌细胞核变小，浓缩及深染。电镜下见细胞核碎裂、核浓缩和染色质边集等现象。结论：丙谷胺能完全抑制体外培养的人结肠癌细胞株HCT116的生长，它有望成为胃泌素受体阳性结肠癌患者的非细胞毒治疗药物。     

转染SV40永生化基因正常成人肝细胞的形态观察

目的了解转染SV40基因对正常成人肝细胞形态结构及特殊染色的影响。方法采用本组构建的含SV40永生化基因的正常成人肝细胞（rSSR#69/HL-7702肝细胞）,以HE染色法、糖原染色法（PAS）和葡萄糖-6-磷酸酶染色（G-6-Pase）法,在光镜下观察该细胞的形态特征,以电镜法观察该细胞的超微结构。结果：光镜下比较转染前、后的正常成人肝细胞形态无明显差异;PAS染色均可见胞浆内有粉红色的糖原颗粒,G-6-Pase染色均可见胞质内有铁黑色颗粒;电镜下比较转染前、后的正常肝细胞的超微结构亦无统计学差异。结论：转染SV40永生化基因的正常成人肝细胞的形态结构与转染前无明显差异,仍具有糖原合成及葡萄糖代谢的能力。     

一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法

为寻求一种简易、价廉的原代小鼠肝细胞培养方法 ,采用非灌注法、冰浴操作处理肝组织块及改良低血清培养基进行了原代鼠肝组织块和鼠肝细胞单层培养。通过光镜观察细胞形态、电镜观察超微结构及检测培养上清白蛋白水平证实培养细胞为肝细胞。持续培养结果显示原代培养第 6～ 12 d左右为肝细胞功能最佳观察和实验阶段。     

大鼠原代肝细胞的形态和功能

目的 :对分离培养的原代大鼠肝细胞进行形态学观察和功能研究 ,探讨其短期培养内的最佳功能状态 ,以便更好地用于肝细胞移植或生物人工肝 .方法 :采用Seglen胶原酶二步灌流法灌注SD雄性大鼠肝脏 ,获取的肝细胞在含有多种辅助因子的Williams’E培养基中进行培养 .台盼蓝排斥法计算细胞产量和细胞活率 ;光镜下直接或HE染色后动态观察细胞形态学改变 ,透射电镜观察其超微结构 ;并收集不同时期培养上清检测其细胞分泌等功能 .结果 :每只大鼠肝平均可获取 1 .2 1× 1 0 8个肝细胞 ,平均活力为 93.6 % .光镜下可见肝细胞呈多角形生长 ,有双核 ,连接成片状或岛状 .电镜下可见内质网、车轮状线粒体、糖原颗粒、细胞连接及胆小管 .肝细胞功能检测显示LDH漏出量、白蛋白分泌及尿素合成功能在 1wk内出现波动性变化 ,第 3日LDH漏出量最低 ,白蛋白分泌及尿素合成功能较好 .结论 :离体培养的 3d原代肝细胞具有较好的功能 ,可能为肝细胞移植和生物人工肝应用的最佳时机     

维甲酸对成纤维细胞作用的体外观察

目的 探讨维甲酸治疗瘢痕的作用机理及其用于临床的可能性，方法 采用成纤维细胞体外培养技术，并将＾３Ｈ－ＴｄＲ（胸腺嘧啶核苷）掺入成纤维细胞ＤＮＡ中，研究维甲酸对体外培养成纤维细胞生长增殖，ＤＮＡ合成及超微结构的影响。结果 维甲酸对成纤维细胞生长增殖，ＤＮＡ合成有不同程度的抑制作用，呈剂量效应关系，扫描电镜和透射电镜观察显示，维甲酸成纤维细胞合成胶原有抑制作用。结论 维甲酸治疗瘢痕的作用机理可能与抑     

肝细胞生长因子与恶性血液病的相关研究进展

肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）是1984年日本学者Nakamura等从部分肝切除大鼠血浆中分离纯化获得一种能刺激原代培养肝细胞生长、促进肝细胞DNA合成的肝源性活性因子,Nakamura又于1989年成功地克隆了大鼠和人的肝细胞生长因子（HGF）的cDNA并进行了表达。最初认为HGF是一种刺激肝细胞增生的有丝分裂原,对肝切除或化学损伤后的肝再生起重要作用。目前已知,HGF来源于间质细胞,其受体是原癌基因c-Met（C-metprotoncogene）的产物,广泛分布于上皮细胞。HGF能刺激多种类型细胞分化、增殖、再生、运动、迁移及形态的发生,是一种多功能的细胞因子。     

肝细胞生长因子神经保护作用的研究进展

肝细胞生长因子又称离散因子，最初作为肝细胞有丝分裂原从肝部分切除大鼠的血液中分离得到，因其活性不具种属特异性并可刺激肝细胞合成DNA而得名。HGF具有广泛的生物学效应，参与多种细胞的增殖、迁移和形态发生。近年来，人们对HGF在基础及临床方面的研究皆已取得了很大进展，研究发现HGF还是一种新的神经营养因子。现仅就其神经保护作用，尤其在缺血性损伤中作用的研究进展综述如下。     

瑞香狼毒水提物小鼠药物血清对小鼠白血病L1210细胞增殖、克隆形成和DNA合成的影响

目的;从整体水平探讨瑞香狼毒水提物（SCLA）的抗癌作用及机制。方法：以不同剂量SCLAig给药后,不同时间采集小鼠血清,处理体外培养的小鼠白血病L1210细胞,观察肿瘤细胞MTT还原,克隆形成能力和DNA合成的改变。结果;SCLA3,6,12g/kg给药1,2,4,8h后的药物血清处理肿瘤细胞后,其MTT还原及克隆形成率均显著降低;给药2h时的药物血清表现出更强的抑制肿瘤细胞增殖作用。SCLA小鼠药物血清也显著抑制[^3H]TdR掺入L1210细胞DNA。结论：直接抑制癌细胞增殖及DNA合成是瑞香狼毒的重要抗癌机制。     

大鼠肝细胞、Kupffer细胞体外共同培养的初步研究

目的研究SD大鼠Kupffer细胞与肝实质细胞体外共同培养时肝实质细胞生长、形态及功能状况.方法原位二步IV型胶原灌注法联合Percoll液密度梯度离心法分离肝实质细胞与Kupffer细胞;体外进行两种细胞单独培养、肝细胞与Kupffer细胞按6∶1比例共同培养,观察不同情况下肝细胞生存时间和形态,检测培养上清中白蛋白和糖的水平.结果单独培养组肝细胞的生长、增殖迅速,并向正常肝细胞的形态演变,肝细胞可培养存活至21 d;共同培养组肝细胞于48 h即开始出现少量的死亡细胞,细胞生长增值缓慢,细胞可培养存活至10 d.单独培养组上清白蛋白水平在48、96、120、144、168 h比混合培养组高(P<0.05);单独培养组上清糖水平在96、144、168 h高于混合培养组(P<0.05).结论肝实质细胞和Kupffer细胞在适宜的培养条件下可进行共培养;但共培养时肝细胞的生长、白蛋白合成功能和糖代谢会受到影响,肝细胞存活时间缩短,提示在共培养体系要实现肝实质细胞和Kupffer细胞两者良好生长和功能的协调,体外共培养条件需进一步优化.     

rhGM-CSF对小鼠口腔粘膜损伤的防治作用

目的：探讨rhGM-CSF促进口腔腔溃愈合的作用机制。方法：取体外培养的胎儿口腔粘膜成纤维细胞，用rhGM-CSF刺激成纤维细胞后第2、4、6天用细胞计数及^3H－胸腺嘧啶掺入法（^3H-TdR）测定其增殖情况，结果rhGM-CSF对胎儿口腔粘膜成纤维细胞增殖及DNA合成有刺激作用，在80－100ng/ml时，细胞生长达到最佳状态，过高浓度rhGM-CSF的刺激作用反而下降。结论：rhGM-CSF可以通过刺激成纤维细胞增殖及DNA合成促进口腔溃疡愈合。     

伏立康唑对体外培养棘阿米巴增殖和形态表现的影响

目的：探讨伏立康唑对体外培养棘阿米巴的增殖和形态表现的影响,阐明伏立康唑对棘阿米巴滋养体和包囊的抑制和杀伤作用。方法：选取对数生长期的棘阿米巴原虫分为对照组和实验组（2.5 和25.0 mg·L^-1）,分别于药物作用后24、48、72和96 h收集各组虫体,计数虫体数量并绘制增殖曲线;光镜下观察棘阿米巴的形态表现、活力和贴壁情况;电镜下观察其超微结构。结果：与对照组比较,实验组棘阿米巴虫体数量减少（P<0.01）;光镜下实验组棘阿米巴形态变化明显,由不规则带棘状伪足的滋养体转化为圆形包囊,出现大量细胞碎片;电镜下实验组棘阿米巴的超微结构出现不同程度的破坏、坏死。结论：一定浓度伏立康唑能够有效抑制体外培养棘阿米巴的增殖并改变其形态甚至超微结构,对滋养体和包囊均具有明显杀伤作用。     

衰老和缺氧对培养大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

目的 探讨衰老及缺氧对体外培养的肺动脉平滑肌(PASMCs)增殖的影响。方法 将细胞分为年轻常氧组、老年常氧组、年轻缺氧组、老年缺氧组。应用MTT比色法、^3H-TdR掺入法、流式细胞术、免疫组化方法检查细胞的增殖情况。结果 同年轻组比较，老年组PASMCs的生长曲线明显抬高，^3H-TdR掺入明显增加，进入有丝分裂期的细胞比例明显增加，总蛋白量减少，增殖细胞核抗原(PCNA)增加；同常氧组比较，缺氧组PASMCs的生长曲线明显抬高。^3H-TdR掺入先受抑制，后明显增加，进入有丝分裂期的细胞比例明显增加，总蛋白量减少，PCNA增加。结论 衰老和缺氧部能直接刺激平滑肌细胞的增殖．衰老的平滑肌细胞受缺氧刺激增殖最为明显。