人源抗HBsAg单链抗体与白细胞介素2融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的表达

目的：探讨抗HBsAg单链抗体与白细胞介素2融合蛋白在巴氏毕赤酵母(P．Pastoris)中的表达以及初步的纯化、活性鉴定方法。方法：用PCR将目的蛋白基因从质粒PGEM7Zf( )-HBScFv-IL-2上扩增出来，再亚克隆到酵母表达载体pPICZaA中，转化P．Pastoris宿主菌GS 115，菌落：PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定转化子，重组酵母经甲醇诱导后，通过SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定表达产物；再通过亲和层析法纯化目的蛋白；用间接ELISA实验鉴定其活性。结果：表达的重组蛋白分子质量约为44ku，表达量可达12％；纯化后凝胶成像分析目的蛋白的纯度达到95％；重组融合蛋白能与HBsAg、鼠抗IL-2单克隆抗体特异性结合。结论：成功构建了抗HBsAg单链抗体与IL-2融合蛋白酵母表达工程菌，并初步建立了对目的蛋白的纯化及活性鉴定方法。     

人源抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体的构建

目的构建以人HBsAg单链抗体(HBScFv)为导向作用、α干扰素为治疗作用的融合蛋白酵母表达载体pPICZ-αB/ScFv-IFN-α。方法通过重叠PCR构建目的蛋白质基因,再亚克隆到酵母表达载体pPICZαB中,DNA测序后,转化巴氏毕赤酵母宿主菌GS115 ,菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定重组酵母,重组酵母经甲醇诱导后,通过SDS PAGE分析鉴定表达产物。结果DNA测序结果显示构建的目的基因片段(HBScFv IFN-α)的序列与原设计序列相符合;菌落PCR结果显示目的基因已整合到酵母菌中;诱导表达后,SDS PAGE结果显示在相对分子质量约4 4 0 0 0处可见目的蛋白质表达带。结论成功构建了抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体     

抗HBsAg单链抗体特异性单克隆抗体的制备及应用

目的获得抗HBsAg单链抗体(HBScFv)的单克隆抗体,并初步研究其在抗HBsAg类小分子抗体及其融合蛋白质的纯化、活性鉴定方面的应用。方法利用杂交瘤技术,以大肠杆菌表达的重组抗HBScFv为抗原,免疫Balb/c小鼠,再将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。通过ELISA法、Western-blot鉴定特异性单克隆抗体,通过免疫双扩散法鉴定单抗亚型,并将筛选到的高效价单抗用于抗HBsAg Fab抗体等重组蛋白质的亲和色谱及ELISA鉴定。结果建立了9株能够稳定分泌抗HBScFv特异性单克隆抗体的细胞株,其细胞上清效价为1∶160~1∶12 800,腹水效价为1∶50 000~1∶400 000;单克隆抗体的亚类分析结果显示有6株为IgG1,其余3株为IgG2a。初步应用结果表明制备的单克隆抗体14F7可用于抗HBsAg Fab抗体等重组蛋白质的亲和色谱及活性鉴定。结论成功建立了能够稳定分泌HBScFv特异性单克隆抗体的细胞株。     

双抗体夹心法测定注射用重组人白细胞介素-2的含量

目的:建立用双抗体夹心法(ELISA 法)测定注射用重组人白细胞介素-2的含量。方法:采用酶标仪在450 nm 处测量白细胞介素-2复合物的 A_(450nm)值,并计算重组人白细胞介素-2冻干粉的百分含量。结果:白细胞介素-2浓度在31.25～500 pg·mL~(-1)范围内线性关系良好(r=0.9999);低、中、高3种浓度的回收率分别为97.3%,98.4%,101.4%,RSD 均小于5.0%。质量控制符合要求。精密度在误差许可范围内。注射用重组人白细胞介素-2的含量为49.55μg·mg~(-1)。结论:方法准确、可靠,注射剂辅料对测定无干扰,可用于注射用重组人白细胞介素-2的含量测定。     

基因重组白细胞介素—2的研究开发

综述了重组白细胞介素-2(rIL-2)的理化性质、生物效应,以及研究开发,包括工程菌发酵、分离纯化、活性测定等工艺开发及质量控制的进展。     

双抗原夹心酶联免疫法检测抗白细胞介素-3的抗体

目的 :建立一种多用途、快速简便和易行的检测抗白细胞介素 3(IL 3)抗体的酶联免疫检测方法。方法 :以高纯度的基因工程人白细胞介素 3(rhIL 3)包被酶标板 ,以辣根过氧化物酶标记rhIL 3,建立了检测抗rhIL 3抗体的一步法双抗原夹心法。结果 :特异性 :与相似的蛋白分子 (其它细胞因子抗体 )无交叉反应 ,实验动物和人的正常血清反应呈阴性。灵敏度 :最低检出限为抗IL 3的单抗 5ng/ml。精密性 :组间和组内变异系数均 <1 2 %。应用于rhIL 3长期毒性实验取得良好的检测效果。结论 :此法特异性强、灵敏度高、方法稳定、操作简便 ,与其它细胞因子的单抗无交叉反应 ,能在同一条件下检测不同种属动物血清中的IL 3抗体 ,用于IL 3长期毒性实验等明显优于间接酶联免疫法。     

肺结核患者治疗前后血清可溶性白细胞介素-2受体的检测

目的：探讨了肺结核患治疗前后血清中可溶性白细胞介素－2受体水平。方法：应用双抗体酶法测定43例肺结核患血清中SIL－2R水平，并与35名正常健康人作对照。结果：肺结核患在治疗前血清中SIL－2R水平显地高于正常人组（P＜0．01），经3个月抗痨治疗后，其血清中SIL－2R水平已基本接近正常水平（P＞0．05），结论：肺结核病是一种自身免疫调节异常的疾病。     

白细胞介素-2及其相关药物的应用研究进展

综述白细胞介素-2及抗白细胞介素-2受体单克隆抗体的应用研究进展。白细胞介素-2是一种在机体的免疫调节中发挥着重要而复杂作用的细胞因子,既可促进淋巴细胞增殖,增强免疫功能,又能限制T细胞反应而增强机体的免疫耐受,故可用于治疗肿瘤和感染性疾病及自身免疫性疾病。     

基因变构人白细胞介素-2克隆构建和原核表达

目的构建基因变构IL-2穴88N→R雪的重组克隆熏并将其在原核系统中进行高效表达,为研究基因变构IL-2穴88N→R雪的生物学活性奠定基础。方法分离人体T细胞经PHA刺激活化后,提取细胞的RNA为模板,逆转录构建cDNA文库,经套式PCR扩增出编码IL-2的基因,插入T-A载体后获得编码天然IL-2的克隆,核苷酸测序证实成功后,自行设计含有突变位点的引物,利用重组PCR技术,进行定点诱变构建基因变构IL-2穴88N→R雪的重组克隆熏DNA测序确认变构成功。将改构后的IL-2基因重组于原核pGEX-4T-2质粒上,转化宿主菌E.coli.DH5α中,经IPTG诱导后表达IL-2变构体,表达产物经SDS-PAGE电泳分析。结果获得了人类天然IL-2的编码基因克隆和基因变构IL-2的编码基因克隆,并将变构IL-2穴88N→R雪在大肠杆菌中获得了高效表达。结论IL-2基因的成功定点变构及其在原核生物中获得稳定高效的表达,为进一步在真核细胞中表达以及研究制备低毒、高效的新型基因变构IL-2药物奠定基础。     

突变型人白细胞介素-2基因在大肠杆菌中的表达

目的：建立突变型人白细胞介素-2（rhIL-2）基因大肠杆菌表达系统，为rhlL-2的生产及临床应用奠定基础。方法：自人胎盘组织中提取总RNA，逆转录PCR（RT-PCR）扩增突变型人IL-2基因cDNA，通过对下游引物的设计将编码125位半胱氨酸（c125）的密码子TGT更改为编码丝氨酸的密码子TCT。构建表达型重组质粒pBV-IL-2，温度诱导表达．表达产物行SDS一聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）及WesternBlot鉴定。结果：DNA序列分析证实，重组质粒pBV-IL-2含有突变型人IL-2编码序列及正确的开放读码框架。SDS-PAGE显示，诱导表达碎菌后的沉淀中有分子质量大小约为16．5ku的外源蛋白产生。经Western印迹（WesternBlot）证明为rhlL-2。结论：成功构建了突变型人白细胞介素-2大肠杆菌表达系统。表达产物主要以包涵体的形式存在于碎菌后的沉淀中。     

Tudor-SN蛋白TSN结构域亚结构片段重组质粒的构建与表达

目的:研究人类Tudor-SN蛋白TSN结构域4个亚片段的功能,构建重组质粒pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)。方法:以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增出目的基因,将双酶切后带有粘性末端的目的片段和pEGFP-C2载体连接,从而构建重组质粒pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)。将构建成功的重组质粒用脂质体法转染HeLa细胞,并在荧光显微镜下观察融合蛋白的荧光表达情况,Western印迹检测融合蛋白的表达。结果:对重组质粒进行双酶切鉴定可见Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)的cDNA片段;脂质体转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。Western印迹后可在相应位置检测到融合蛋白pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)。结论:真核pEGFP-C2-Tudor-SN-TSN(Ⅰ~Ⅳ)重组质粒构建及表达成功。     

重组人白细胞介素15表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的 :获得重组人白细胞介素 1 5 (rhIL 1 5 )高效表达菌株。方法 :经细菌脂多糖 +γ干扰素活化的人外周血单个核细胞提取细胞总RNA ,用RT PCR方法扩增出编码人IL 1 5cDNA的基因片段 ,采用 pBV2 2 0表达载体 ,经DNA重组技术构建IL 1 5基因工程菌。结果 :核酸序列测定与预期一致 ,所表达的IL 1 5经SDS PAGE证明分子量约 1 5kD ,表达量占菌体总蛋白的 2 8% ,经CTLl2 细胞检测 ,表达产物粗提物 1∶1 0 0复性后效价可达到1 0 6IU /ml。结论 :构建的基因工程菌为IL 1 5高效表达菌株。     

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在BHK细胞表达鼠IL-2蛋白的研究

目的:利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在BHK细胞表达重组鼠白细胞介素(IL)-2蛋白。方法:用Flag标记鼠IL-2并加入真核细胞启动子CMV,构建重组质粒pFB-CMV-IL-2并予酶切和PCR鉴定;将鼠IL-2克隆入杆状病毒表达载体pFastBacDual中,将pFB-CMV-IL-2转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态菌中,筛选阳性克隆,获得重组杆状病毒载体Bacmid-pFB-CMV-IL-2,抽提质粒;用脂质体转染法将Bacmid-pFB-CMV-IL-2转染Sf9昆虫细胞包装病毒,收获重组杆状病毒,将构建病毒转导BHK细胞培养,用Western blot检测IL-2蛋白。结果:通过杆状病毒表达系统,在BHK细胞成功表达重组的鼠IL-2蛋白。结论:重组杆状病毒在真核细胞中成功表达重组鼠IL-2蛋白。     

重组真核质粒pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)的构建及表达

目的:将人类G3BP(Ras-GTPase activating protein SH3 domain binding protein)蛋白Domain(1～5)基因片段分别定向连入pEGFP-C2质粒,使G3BP蛋白各功能片段与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达。方法:以重组质粒pEGFP-C1-G3BP为模板,PCR法扩增出目的基因,利用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切法将目的片段连接到pEGFP-C2载体上,再将构建成功的pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)重组质粒转染入HeLa细胞内,以荧光显微镜及Western印迹法检测绿色荧光蛋白与目的蛋白的融合表达情况。结果:以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,荧光显微镜及Western印迹结果均检测到绿色融合蛋白的表达。结论:重组pEGFP-C2-hG3BP-Domain(1～5)质粒成功构建并表达。     

rhIL-6表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

通过PCR技术扩增出约0.5kb的IL-6基因片段,并且采用含有P_RP_L串联启动子及SD区的高效表达载体pBV_220,经DNA重组技术,成功地构建了rhIL-6的基因工程菌E.coli DH_5a/pBV_220IL-6。所表达的IL-6经SDS-PAGE证明约17.5kD,表达量占菌体总蛋白的30%以上。以IL-6依赖细胞株MH_60·BSF_2检测,表达产物粗提物1:100复性后效价可达到5×10~8u/ml,每升发酵菌液可获10~12u IL-6粗品。     

抗菌肽Cecropin B-肿瘤血管生长抑制因子 Kringle5融合蛋白表达载体的构建及其表达

通过重叠区扩增法人工合成抗菌肽Cecropin B(CB)基因,从ThioA/L15-7上卸下肿瘤血管生长抑制因子Kringle5(K5)基因,将两者按正确的阅读框架融合并定向克隆至大肠杆菌高效表达载体pET32a上,构建成pET32a/CB-K5重组载体。重组载体转化BL21(DE3)细胞后,提取质粒进行PCR鉴定和序列分析,证明重组质粒pET32a/CB-K5阅读框架和融合基因序列均与预期相符。实验结果显示,成功地构建了抗菌肽CecropinB(CB)和肿瘤血管生长抑制因子Kringle5(K5)融合蛋白的表达载体pET32a/CB-K5。转化E.coliBL21(DE3),SDS-PAGE分析显示,在IPTG诱导下,融合蛋白以包涵体的形式在重组转化菌株中获得高效表达,表达量达到菌体总蛋白的50%。     

人肠生长激素工程菌高效表达培养工艺的研究

为了优化含有人肠生长激素(rh[Gly^2]GLP-2)基因的融合表达工程菌pED-h[Gly^2]GLP-2高效表达的最适培养工艺条件，文章通过摇瓶培养研究了包括培养基组成、初始pH值、接种量、诱导剂：诱导剂浓度、诱导时机及诱导后培养时间等因素对蛋白表达量的影响，确定了该工程菌表达目的蛋白的最佳条件，目的蛋白表达量可达40％以上，为基因工程产品的大规模工业化生产提供了一些有价值的数据。