基于HPV16的新型伪病毒治疗MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎的实验研究

目的 构建基于人乳头状病毒（human papilloma virus,HPV）16型的新型伪病毒,探讨对MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎的治疗作用,为临床治疗系统性红斑狼疮提供实验依据。方法 将12只3月龄MRL/lpr狼疮小鼠随机均分为治疗组和对照组,治疗前后测定尿蛋白、血清尿素氮、肌酐及抗ds-DNA抗体滴度。结果 治疗组小鼠治疗后的尿蛋白、血清尿素氮、肌酐及抗ds-DNA抗体均下降,与治疗前有显著性差异（P〈0.05）,而对照组治疗前后无显著性差异（P〉0.05）,并且治疗组小鼠的平均生存期比对照组明显延长（P〈0.05）。结论 基于人乳头状病毒16型的新型伪病毒可显著改善MRL/lpr小鼠的免疫状况和肾脏功能,提高平均生存期。该研究结果 为临床治疗系统性红斑狼疮提供了新的启示。     

稳定表达人VEGF165的NIH/3T3细胞株的筛选与鉴定

 目的 培养NIH/3T3细胞,并进行慢病毒载体介导的VEGF165基因转染,为建立转基因小鼠血管瘤模型奠定基础.方法 采取贴壁培养法分离培养NIH/3T3细胞,细胞随机分为3组,分别为Lenti-VEGF165-EGFP 重组慢病毒载体转染组、Lenti-EGFP慢病毒转染组和未转染组,转染后72 h荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪分选后用ELISA方法检测VEGF165外分泌.结果 ELISA 检测转染后小鼠NIH/3T3细胞,Lenti-VEGF165-EGFP 重组慢病毒载体感染组、Lenti-EGFP慢病毒转染组和未转染组培养上清中VEGF165浓度分别为(205±15)、0、0 ng/L(P<0.05) 结论 NIH/3T3细胞获得慢病毒载体介导的VEGF165表达基因修饰且稳定传代,为下一步血管瘤动物模型研究奠定了基础.     

健康成人外周血EB病毒感染98例的研究

目的:探讨鼻咽癌高发区健康人群外周血EB病毒DNA阳性率与EB病毒血清学抗体水平之间的关系.方法:收集98例祖籍广东的健康成人外周血,分离外周血单个核细胞和血浆/血清,用巢式PCR法检测EB病毒DNA的W片段,同时用免疫酶标法检测EB病毒VCA/IgA和EA/IgA的血清学滴度.结果:57例外周血单个核细胞可以扩增出阳性产物(57/98,58.16%),这57例外周血单个核细胞EB病毒DNA阳性者中有10例(10/57,17.54%)的血浆/血清也扩增出EB病毒DNA.98例健康成人的VCA/IgA抗体的几何平均滴度为1:20.61,只有1例可检出EA/IgA(滴度为1:5).结论:大部分居住在鼻咽癌高发区的健康成人外周血携带有EB病毒,部分可进入溶解周期.外周血单个核细胞EB病毒DNA阳性组与阴性组之间的抗EB病毒抗体水平(VCA/IgA)没有差异.     

HPV16L1蛋白血清学诊断宫颈癌临床效果观察

目的：探讨基因重组人乳头瘤病毒（HPV）16L1蛋白的血清学诊断宫颈癌的临床意义。方法：选择63例宫颈癌患者，采用PCR方法检测宫颈癌组织的HPV型别；并采用重组原核表达系统制备HPV16L1蛋白，检测其血清HPV16L1抗体。结果：宫颈癌HPV通用型DNA阳性率50．8％，HPV16DNA阳性率46％，HPV18DNA阳性率3．2％。宫颈癌组血清HPV16L1抗体阳性率44．4％，与健康对照组和尖锐湿疣组比较，差异非常显著（P〈0．01）。HPV16DNA检测法与HPV16L1ELISA血清抗体检测法两者间相关显著（P〈0．05）。结论：宫颈癌患者以HPV16感染为多见，HPV16L1血清ELISA抗体检测可用作HPV16感染的血清学诊断和宫颈癌的免疫学研究。     

HPVl6L1蛋白血清学诊断宫颈癌临床效果观察

目的：探讨基因重组人乳头瘤病毒（HPV）16L1蛋白的血清学诊断宫颈癌的临床意义。方法：选择63例宫颈癌患者，采用PCR方法检测宫颈癌组织的HPV型别；并采用重组原核表达系统制备HPV16L1蛋白，检测其血清HPV16L1抗体。结果：宫颈癌HPV通用型DNA阳性率50．8％，HPV16DNA阳性率46％，HPV18DNA阳性率3．2％。宫颈癌组血清HPV16L1抗体阳性率44．4％，与健康对照组和尖锐湿疣组比较，差异非常显著（P〈0．01）。HPV16DNA检测法与HPV16L1ELISA血清抗体检测法两者间相关显著（P〈0．05）。结论：宫颈癌患者以HPV16感染为多见，HPV16L1血清ELISA抗体检测可用作HPV16感染的血清学诊断和宫颈癌的免疫学研究。     

人乳头瘤病毒6b型L1基因的克隆及表达

目的研究尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒(HPV)6b型晚期基因L1(HPV6bL1)在真核细胞内的表达。方法 PCR技术扩增原核重组质粒PQE40-HPV6bL1中L1基因,酶切后与真核表达质粒PEGFP-C1连接,转化入感受态大肠埃希菌DH5α,经扩增后酶切鉴定,挑选阳性克隆进行测序。以重组质粒PEGFP-HPV6bL1转染COS-7细胞,荧光显微镜下观察融合蛋白的表达,RT-PCR检测HPV6bL1 mRNA的表达。结果双酶切及测序鉴定显示,重组质粒中插入的目的基因片段及载体DNA大小、方向和插入位点均正确,PEGFP-HPV6bL1构建成功。重组体成功转染进COS-7细胞,在荧光倒置显微镜下可观察到细胞内有绿色荧光蛋白表达,RT-PCR检测到HPV6bL1 mRNA的表达。结论建立了HPV6bL1绿色荧光真核表达系统,为研究该蛋白质的功能奠定了基础。     

三种方法浓缩慢病毒后绿色荧光蛋白转染效率的比较

 目的 比较超滤管法、超速离心法及病毒浓缩液法浓缩慢病毒后绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的转染效率。方法 用摇床过夜摇pMD2.G、psPAX2及GFP载体菌种并用试剂盒提取这三种质粒;将pMD2.G、psPAX2及GFP载体质粒与转染试剂按比例混合后转染293T细胞生产病毒;收集病毒上清液并用超滤管法、超速离心法及病毒浓缩液法浓缩慢病毒;将接种的293T细胞分为3组,并向每组接种有293T细胞的培养液中加入2、4、8、16 μl三种方法浓缩的病毒浓缩液,48 h后用荧光显微镜观察和流式细胞仪检测三种方法浓缩慢病毒后转染293T细胞的GFP表达情况。结果 荧光显微镜观察结果显示随着转染量的增加,GFP表达率增加,超滤管法浓缩病毒转染293T细胞后GFP的表达效率最高;流式检测显示病毒浓缩液法组2、4、8、16 μl GFP的表达率分别为(2.4±0.1)%、(3.8±0.3)%、(8.2±0.6)%、(12.2±0.3)%;超滤管法组2、4、8、16 μl GFP的表达率分别为(5.4±0.3)%、(7.4±0.4)%、(12.7±0.1)%、(17.3±0.6)%;超速离心法组2、4、8、16 μl GFP的表达率分别为(0.7±0.1)%、(1.2±0.1)%、(2.1±0.1)%、(0.4±0.2)%。超滤管法组与其他两组比较,P<0.05,差异有统计学意义。结论 不同方法浓缩慢病毒后的GFP转染效率不同,三种慢病毒浓缩方法中超滤管法浓缩慢病毒后的GFP转染效率最高。     

3种方法检测宫颈脱落细胞HPV感染结果的分析

目的 探讨3种方法检测宫颈脱落细胞人乳头瘤病毒(HPV)感染的内在联系及与薄层细胞学检测(TCT)结果的相关性.方法 用基因捕获DNA检测法(hC2)捕获样品HPV DNA解链、杂交,检测与宫颈癌高度相关的13种HPV.用实时荧光定量PCR(Q-PCR)法提取样品HPV DNA,扩增核酸在Q-PCR定量仪上检测结果.MPHC提取样品HPV DNA,扩增核酸,将扩增后的产物加到微孔板中进行杂交,加入酶标液,用酶标阅读仪测定结果.后两种方法检测病毒亚型数量与hC2法相同.本实验将hC2法与Q-PCR匹配检测260例宫颈脱落细胞HPV感染;将hC2法与MPHC匹配检测200例宫颈脱落细胞HPV感染情况.结果 3种方法在鳞状上皮异常改变组中,HPV检出阳性率均为100%;在鳞状上皮良性改变组中Q-PCR和MPHC检测HPV阳性结果绝大部分与hC2相符,只有较少部分样品结果在hC2阴性结果的范围内,灵敏度均＞hC2,MPHC假阳性率占2%.结论 HPV检测结果与TCT的结果相结合评价宫颈疾病、宫颈癌及癌前病变是最佳方案.     

血管紧张素Ⅱ2型受体重组腺病毒的扩增及其在INS－1细胞中的转染

目的：利用人胚肾（HEK）293A细胞株扩增含有大鼠血管紧张素Ⅱ2型受体（AT2R）基因的重组腺病毒,并在大鼠胰岛素瘤细胞INS－1细胞株中进行转染,构建AT2R高表达的胰岛β细胞模型。方法利用293A细胞株扩增重组腺病毒Ad－G－AT2R－EGFP和对照病毒Ad－CMV－EGFP,并测定病毒滴度。在INS－1细胞中瞬时转染后利用实时PCR、Western 印迹以及免疫荧光和激光共聚焦技术检测细胞中AT2R与AT1R的表达。结果扩增后得到重组腺病毒Ad－G－AT2R－EGFP和Ad－CMV－EGFP的滴度分别为9×109和8×109 pfu／ml。在INS－1细胞中转染Ad－G－AT2R－EGFP后,AT2R mRNA的表达随病毒感染复数（multiplicity of infection,MOI）值的增加呈剂量依赖性增加。当MOI值为10时,AT2R mRNA的表达达到峰值（P＜0．05）,同时AT2R蛋白的表达明显高于转染了Ad－CMV－EG－FP的细胞和未转染细胞,但AT1R的表达无显著变化。结论成功扩增并得到高滴度且携带有AT2R基因的重组腺病毒载体,并将其转染入INS－1细胞中构建出AT2R高表达的胰岛β细胞模型,为下一步探讨AT2R在胰岛β细胞中的作用奠定了基础。     

小鼠抗人Nanog多克隆抗体的制备及其鉴定

目的用基因免疫方法制备小鼠抗人Nanog多克隆抗体并进行鉴定。方法应用Accelrys软件分析Nanog抗原表位,选择其中免疫原性较强的抗原表位（A16-V101）,从Nanog cDNA全长质粒中扩增其cDNA（258bp）序列,克隆到pBQAP-TT构建基因免疫载体,鉴定正确后与辅助载体pCMVi-GMCSF和pCMVi-Fh31。同时免疫小鼠,12周后用ELISA方法检测血清抗体滴度,Western blot方法鉴定抗体对人肾组织的特异性。同时将Nanog-AAV2病毒转染到HKC细胞,免疫荧光定位Nanog在细胞的表达。结果成功构建了Nanog基因免疫载体,经酶切及序列分析鉴定完全正确。ELISA结果显示抗体滴度为1：32000。Western blot结果显示小鼠抗Nanog多克隆抗体识别人肾组织34kD的Nanog蛋白。免疫荧光结果表明转染的Nanog基因主要表达在HKC细胞细胞核。结论用基因免疫的方法可以成功制备高效价和高特异性抗Nanog多克隆抗体。     

H5N1型流感病毒M1蛋白的基因克隆与表达

目的：克隆、表达A型H5N1流感病毒基质蛋白M1,为研制新的流感快速检测方法奠定基础。方法：应用PCR方法扩增M1的全基因序列,克隆至PET32a载体上,经测序分析确认后,转化感受态大肠杆菌BL21（DE23）,经IPTG诱导表达M1蛋白后,对其表达产物进行SDS-Page和Western Bloting分析。结果：SDS-Page电泳显示M1蛋白在BL21（DE23）大肠杆菌中成功表达,Western Bloting分析显示表达产物可以与M1多克隆抗体发生特异性反应。结论：成功克隆和表达了流感病毒H5N1的基质蛋白M1,为进一步制备高滴度单克隆抗体、研制新的流感检测方法奠定了基础。     

乙型脑炎病毒NS5蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的表达纯化乙型脑炎病毒非结构蛋白NS5,并制备其多克隆抗体。方法通过PCR法扩增编码NS5蛋白的全长基因,将其克隆到原核表达载体pET28a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,并通过Ni柱亲和层析纯化重组蛋白。用纯化后的重组蛋白免疫BALB/c鼠制备多克隆抗体。采用间接免疫荧光法检测抗体效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果与结论成功获得了可溶性表达的NS5蛋白,制备了多克隆抗体,效价为1∶1000,能够特异性识别乙型脑炎病毒感染细胞中表达的NS5蛋白,为进一步研究NS5蛋白的生物学功能奠定了基础。     

AMPKα信号途径参与吡格列酮对人肝癌细胞的凋亡诱导作用

目的观察吡格列酮干预对体外培养的HepG2细胞凋亡和细胞周期的影响,并探讨其药理作用机制。方法以不同浓度的吡格列酮干预体外培养HepG2细胞,采用流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期以及激活的胱天蛋白酶（Caspase）3蛋白表达,RT-PCR检测PPARγmRNA的表达,Western印迹检测PPARγ蛋白、磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPKα）蛋白和磷酸化AMPKα（p-AMPKα）蛋白的表达;并将PPARγ小干扰RNA（pGCsi-PPARγ）表达质粒转染HepG2细胞,观察PPARγ基因沉默后吡格列酮对细胞凋亡作用的影响。结果不同浓度的吡格列酮干预HepG2细胞后,诱导细胞的凋亡,在此过程中G0/G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例明显减少,并呈一定的剂量依赖关系;但在上述过程中,PPARγmRNA和蛋白的表达没有显著变化;吡格列酮在高浓度（20μmol/L）时对pGCsi-PPARγ表达质粒转染的HepG2细胞仍表现出凋亡诱导作用。不同浓度的吡格列酮干预后未见激活的caspase 3表达峰,对NF-κB的DNA结合活性也无明显影响,但其在高浓度（20μmol/L）时明显增加对照组和pGCsi-PPARγ转染组p-AMPKα的表达,而总AMPKα则无明显变化。结论吡格列酮能够干扰细胞周期、诱导其凋亡,这种作用不是完全通过PPARγ依赖途径实现的,AMPKα信号途径参与上述过程。     

青海地区藏族妇女宫颈癌HPV谱的研究

目的：探讨人乳头状瘤病毒（human papilloma virus,HPV）各亚型在青海藏族宫颈癌患者及正常人群中的分布及其差异,分析藏族宫颈癌的HPV谱。方法：采用导流杂交基因芯片技术,对284例青海藏族宫颈癌患者及50例正常妇女宫颈组织中的HPV21种亚型（包括13种高危亚型,5种低危亚型和3种中国人群常见亚型）进行检测。结果：①284例宫颈癌组织中HPV（包括单一感染及多重感染）,阳性率为86.27%（245/284）;50例对照组中HPV阳性率为8.0%（4/50）。②HPV21种亚型中15种被检测到,6种未检测到。HPV单一感染率及总感染率在宫颈鳞癌及其他类型的宫颈癌中的比例明显高于宫颈腺癌（x^2=4.51,P〈0.05）,而多重感染在各病理类型的宫颈癌中的比例无显著性（x^2=0.09,P〉0.05）。结论：青海藏族宫颈癌患者及正常人群中以HPV16感染为主,其次为HPV18,HPV31等。     

肝特异性假病毒转运系统的构建

目的:探索一种针对慢性乙型肝炎的特异性长效基因治疗手段.方法:改造乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)为基因治疗载体,敲除其所有的开放阅读框(open reading frames,ORFs),同时保留包装信号序列,并且插入增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)作为报告基因.同时构建辅助细胞系,为上述病毒载体(假病毒)提供包装所需要的病毒蛋白.以该假病毒载体转染辅助细胞系,以酶联免疫方法检测细胞培养上清中乙型肝炎病毒抗原,并在荧光显微镜下观察EGFP的表达,用透射电镜观察培养上清中的病毒颗粒,同时用实时定量PCR的方法对分泌到细胞培养上清中的假病毒进行了定量检测.结果与结论:以假病毒载体转染辅助细胞后,电镜观察到培养上清中乙肝病毒的丹氏粒(Dane particle).实时定量PCR分析结果显示,细胞分泌到培养上清的假病毒含量达103拷贝/μl.ELISA结果显示该上清中同时表达了HBV表面抗原和e抗原,通过荧光显微镜观察发现外源基因绿色荧光蛋白获得有效表达.     

宫颈细胞学结果为ASCUS患者HPV感染状况及临床意义研究

目的探讨细胞学结果为不典型鳞状上皮细胞不能明确意义（ASCUS）的人乳头状瘤病毒（HPV）感染状况及临床意义。方法对120例ASCUS患者进行阴道镜检查及活检,其中85例患者同时进行HPV检测。结果在120例ASCUS患者中,上皮内瘤变（CIN）的发生率为35％,高级别CIN及宫颈癌发生率为12％,阴道镜检查与病理结果符合率为47．6％。HPV检测阳性率为65％,组织病理证实：其中高级别CIN8例,宫颈癌2例,CINI和宫颈炎分别为20例、25例,HPV阳性组CIN检出率明显高于阴性组（P〈0．05）。各组HPV混合型感染率无显著差异。结论细胞学结果为ASCUS患者．病理活检差异大,HPV检测可为患者提供有效、合理的处理方案。     

翡翠贻贝多糖抑制流感病毒在狗肾细胞中增殖的研究

目的研究翡翠贻贝多糖对流感病毒在狗肾细胞（MDCK）中增殖的抑制作用。方法采用血凝滴度测定研究翡翠贻贝多糖对MDCK细胞培养甲型流感病毒的抑制作用;通过联合用药试验研究翡翠贻贝多糖对利巴韦林抗流感病毒的协同效应。结果翡翠贻贝多糖能显著降低MDCK细胞培养流感病毒的血凝滴度;翡翠贻贝多糖与利巴韦林联合使用时,能显著抑制MDCK细胞培养流感病毒的增殖并具有相加效应。结论翡翠贻贝多糖能明显抑制MDCK细胞培养流感病毒的增殖,对利巴韦林抗流感病毒具有相加效应,具有开发成抗流感病毒生物制剂的前景。     

北京市房山区甲型H1N1流感抗体血清流行病学调查

 目的 了解北京市房山区人群甲型H1N1流感免疫水平,为完善该区甲型H1N1流感疫情防控措施提供科学依据.方法 选择房山区常住人口784名,按照年龄组进行分层和问卷调查,采集血清标本进行甲型H1N1流感病毒血凝抑制(hemagglutination-inhibition,HI)抗体检测,比较不同人群甲型H1N1流感保护性抗体阳性率和抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT).结果 784名调查对象甲型H1N1抗体阳性率为40.9%(321/784),抗体几何平均滴度为1∶ 18.39.6~15岁年龄组抗体阳性率最高(57.5%),其次是16~24岁年龄组(54.7%),而≥60岁年龄组HI抗体阳性率最低(21.2%).非条件多因素logistic回归分析显示,年龄及接种甲型H1N1流感疫苗与HI抗体阳性呈显著性相关.结论 房山区有超过40%的人群具有甲型H1N1流感保护性抗体,普通人群中已经建立一定的免疫屏障.     

HMME-PDT对原代培养瘢痕成纤维细胞中Cyc表达的影响

目的观察血卟啉单甲醚(hematoporphyrin monomethyl ether,HMME)-光动力学疗法(photodynamic therapy,PDT)对增生性瘢痕成纤维细胞(hypertrophic scar fibroblast,HSF)中细胞色素C(cytochrome C,Cyc)表达的影响。方法采用组织块法原代培养瘢痕组织来源的成纤维细胞,建立HSF的传代细胞系,实验用第4～6代细胞。取对数生长期的HSF细胞,分为对照组和HMME-PDT组,其中HMME-PDT组的处理方法为培养的HSF与4μg/ml的HMME避光孵育3h,PDT治疗采用波长为630nm的激光,功率密度10mW/cm2,能量密度2.5J/cm2,两组细胞爬片细胞经固定、打孔后加入Cyc(1∶50)抗体以及FITC标记的二抗(1∶100),荧光显微镜下观察Cyc的荧光强度。用PI单染后经FCM检测细胞凋亡率。每标本计数105个细胞,实验重复5次。结果对照组HSF的细胞浆中Cyc-FITC荧光微弱,PDT组荧光显著增强;PI染色分析表明对照组凋亡率低(2.45±0.22%),PDT组的凋亡率显著升高(30.54±3.78%),二者相比差异有显著意义(P0.05)。结论光动力治疗后导致的线粒体功能障碍可能在瘢痕成纤维细胞凋亡中发挥了重要作用。