血管内皮生长因子对兔肾血管内皮细胞体外培养的影响

目的 探索血管内皮生长因子（VEGF）对兔肾血管内皮细胞（MVECs）体外培养的影响。方法采用三步梯度筛网法,获得纯度较高的肾血管球,0．5％胶原酶Ⅳ37℃消化15～20min,离心沉淀获取血管内皮细胞,分加与不加VEGF培养。对培养的细胞用倒置显微镜观察常规形态,用免疫组化法进行第Ⅷ因子相关抗原鉴定,用透射电镜观察细胞浆Weibel-Palade小体,用间接免疫荧光法检测CD31、CD34及CD44的表达。结果加VEGF的MVECs原代3d铺满瓶底,3～4d传一代;不加VEGF的MVECs原代7～12d铺满瓶底,7～8d传一代。鉴定时两种培养的MVECs表达是一致的。倒置显微镜观察细胞铺满瓶底时呈典型的铺路卵石样结构,免疫组化法第Ⅷ因子相关抗原阳性,透射电镜观察到细胞浆中的Weibel-Palade小体,间接免疫荧光法检测CD31、CD34表达阳性,CD44阴性。结论VEGF对MVECs体外培养的影响无显著意义。     

川芎嗪对血管内皮细胞损伤的保护作用

用 H2 O2 (75μmol· L-1,4h)诱导人胎儿脐静脉内皮细胞 (HUVECs)损伤 ,研究川芎嗪对血管内皮细胞损伤的保护作用 .噻唑蓝 (MTT)比色法检测细胞活性 ,放射免疫法测定细胞培养液中的内皮素样免疫反应物 (ir- ET)水平及前列环素代谢物6-酮前列腺素 1α(6- keto- PGF1α)含量 ,硫代巴比妥酸法测定细胞内脂质过氧化产物丙二醛 (MDA)含量 ,生化自动分析仪测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性 .结果显示川芎嗪 0 .3- 1 .2 mmol·L-1对正常 HUVECs具有促进增殖作用 ,并浓度依赖性拮抗 H2 O2 抑制增殖作用 .川芎嗪 0 .3和 0 .6mmol· L-1使细胞培养液中 6- keto- PGF1α含量升高 ,ir- ET含量降低 ,说明增加前列环素释放 ,减少内皮素基础释放量 ,并部分拮抗 H2 O2 损伤HUVECs所致 LDH,内皮素释放增加 ,前列环素释放减少和 MDA生成增加的作用 .提示川芎嗪具有保护 H2 O2 致血管内皮细胞损伤的作用 ,其机理可能与其抗脂质过氧化作用有关     

不同剂量白酒对大鼠内皮细胞微颗粒水平的影响

【摘要】 目的 探讨不同剂量白酒对大鼠内皮细胞微颗粒水平的影响。 方法 60只雄性SD大鼠随机分成4组：白酒大剂量组（A组）、中剂量组（B组）、小剂量组（C组）和对照组（D组）,每组15只。白酒灌胃8周,采用流式细胞术检测各组大鼠血浆中CD31+/CD42-内皮微颗粒的水平,并比较其与白酒剂量的关系。 结果 与D组相比,A、B组大鼠血浆内皮细胞微颗粒水平显著升高（P<0.05）,C组改变不明显（P>0.05）。 结论 大、中剂量白酒灌胃对大鼠血管内皮细胞功能有损害作用,呈明显的量效关系;小剂量白酒灌胃对大鼠血管内皮细胞功能无损害作用,是否有保护作用仍需进一步研究     

ATP和凝血酶诱导的血管内皮细胞Ca~(2+)内流比较

采用fura 2荧光测定细胞 [Ca2 +]i 变化技术 ,在培养的牛主动脉内皮细胞上观察ATP和凝血酶诱导的Ca2 +内流的特性 .ATP和凝血酶均能诱导内皮细胞 [Ca2 +]i 呈双相升高 ,它们诱导的Ca2 +释放是环匹阿尼酸 (CPA)敏感Ca2 +池的一部分 .ATP诱导的Ca2 +释放和Ca2 +内流不完全通过激活磷脂酶C介导 ,而凝血酶诱导的Ca2 +释放和Ca2 +内流则完全通过激活磷脂酶C介导 .硝苯地平对ATP和凝血酶诱导的Ca2 +内流均无影响 ;SK&F 96 36 5与三七皂甙 2A对凝血酶诱导的Ca2 +内流没有影响 ,但可抑制ATP诱导的Ca2 +内流 ,且此作用比它们对CPA诱导Ca2 +内流的抑制作用小 .SK&F 96 36 5和三七皂甙 2A敏感的Ca2 +内流的特性不同 .结果表明ATP和凝血酶激活不同受体 ,引起Ca2 +内流的机理不同     

SD新生大鼠耳蜗螺旋神经元的原代培养

目的建立用自制的鼠尾胶原联合胰酶消化法原代培养SD新生大鼠耳蜗螺旋神经元。方法采用出生3 d内的SD大鼠,取螺旋神经节组织,通过胰酶消化后在自制鼠尾胶原包被的培养皿中进行原代培养,应用神经微丝蛋白进行免疫组化鉴定。结果获得的螺旋神经元细胞在体外能较快地贴壁,可以存活、生长,细胞形态良好。结论自制鼠尾胶原联合胰酶消化的培养方法可获得良好状态的螺旋神经元细胞,为原代培养螺旋神经元提供了新思路。     

脐血内皮细胞体外人工血管内皮化的研究

目的　寻找来源方便的内皮细胞 ,解决人工血管内皮化问题。方法　收集胎儿脐血 ,Ficoll离心获得单核细胞 ,置内皮细胞培养液中 ,诱导内皮细胞祖细胞转化为内皮细胞并扩增 ;作光镜、扫描电镜形态学观察 ,免疫细胞化学定性、流式细胞仪定量测定 ;采用旋转贴壁培养法 ,使内皮细胞衬里人工血管腔面。结果　 1.脐血内皮细胞祖细胞在培养第 5天 ,细胞扩增 3 6± 1 7倍 ,并开始转化为内皮细胞 ,在以后的二周内保持增殖。 2 .免疫细胞化学检测显示 :内皮细胞培养早期 ,Ⅷ因子、CD34、CD31、VEGFR 2表达均为阳性 ,后期除Ⅷ因子有较高表达外 ,其他指标表达阴性。 3 .形态学观察 :在普通玻璃培养瓶中 ,内皮细胞呈铺路石形、单层贴壁生长 ;应用旋转贴壁培养法 ,内皮细胞呈片状生长 ,并贴壁于人工血管腔面 ,符合人工血管内皮化要求。结论　循环内皮细胞能在体外诱导、培养、扩增 ,并能保持一定的生物学活性 ,可作为人工血管内皮研究 ,有望应用于临床。     

SD大鼠血管内皮细胞损伤模型的制作方法

目的 建立SD大鼠血管内皮细胞损伤模型.方法 SD大鼠随机分为正常对照组和模型组.模型组大鼠皮下注射稀释1.5倍的肾上腺素0.05mg·100g~(-1)(tid),连续5d.于d 4起,每2次给药间将大鼠置于0℃冰水中5min.正常对照组则皮下注射等量NS.于d6,2组大鼠自颈总动脉取血,分别测定CEC计数、t-PA、PAI活性、6-keto-PGF_(1a)含量及血小板最大聚集率.结果 模型组较正常对照组大鼠CEC计数、PAI活性、血小板最大聚集率明显升高(P<0.01),t-PA活性、6-keto-PGFl_(1a)含量降低(P＜0.01;P＜0.05).结论 大剂量肾上腺素加冰泳刺激能造成SD大鼠血管内皮细胞损伤.     

大鼠主动脉内皮细胞原代培养的研究

目的建立简单有效且重复性高的大鼠主动脉血管内皮细胞体外原代培养技术。方法取大鼠主动脉,将主动脉内膜暴露于外,采用不同浓度的Ⅰ型胶原酶以及不同消化时间对组织块进行预消化,然后将大鼠主动脉切成小块按内膜朝下贴在鼠尾胶原包被的培养瓶上进行培养。结果2.0g·L-1型胶原酶消化1h的组织块细胞迁出速度且组织迁出率明显提高(P<0.05),组织贴壁后24h即可见内皮细胞从组织块周围游离出来,呈短梭形或类三角形,d4～5即可进行传代培养,传代后d3～4即可融合成单层,呈典型“铺路石”状排列,经免疫组化S-P法鉴定有第Ⅷ因子相关抗原存在,进一步确认其为内皮细胞。结论经2.0g·L-1Ⅰ型胶原酶消化1h的组织块,组织块迁出率及内皮细胞迁出速度明显提高,从而大大缩短原代培养的时间。     

差速贴壁法培养大鼠骨髓内皮祖细胞的实验研究

目的:探索一种经济、可靠、稳定、高纯度的内皮祖细胞培养方法。方法:采用密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓血管内皮祖细胞,于包被人纤连蛋白的25mL培养瓶中贴壁培养,收集48h后的未贴壁细胞培养至第7天,通过细胞摄取DiL-acLDL、结合FITC-UEA-1的荧光双染阳性率从功能角度鉴定细胞,并通过流式细胞术动态测定细胞表面抗原CD133、flk-1、VE-cadherin(CD144)及CD31进一步鉴定。结果:48h未贴壁细胞培养,细胞呈短梭形、多角形,胞体小;可见到大量典型的内皮祖细胞克隆;细胞摄取DiL-acLDL,结合FITC-UEA-1荧光双染阳性率为(87.0±6.0)%。细胞表面抗原CD133、flk-1、CD144和CD31阳性率分别为61.01%、8.55%、6.18%和8.20%。结论:差速贴壁法是一种经济、可靠、稳定、高纯度的内皮祖细胞培养方法。     

人骨髓来源内皮前体细胞体外培养和鉴定的研究

目的:明确人骨髓单个核细胞中是否存在内皮前体细胞(EPCs),探讨从人骨髓中分离、培养EPCs的方法及体外进行EPCs的鉴定。方法:采集正常人骨髓单个核细胞进行体外培养,应用流式细胞术进行内皮细胞表面标记物检测,应用免疫荧光术对培养细胞进行内皮细胞功能特性检测。结果:人骨髓单个核细胞经体外培养,收获细胞可以表达内皮细胞的特异性抗原,包括CD34、VWF、KDR等,并显示出能摄取乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL),结合荆豆凝集素(UEA-1)等内皮细胞的特性。结论:人骨髓中存在具有内皮细胞潜能的EPCs,其具有内皮细胞的表型特征和功能,有希望作为种子细胞用于冠心病的血管新生治疗。     

沙利度胺联合曲安奈德抑制人脐静脉内皮细胞增殖的研究

目的:研究沙利度胺(thalidomide)联合曲安奈德对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的药物作用.方法:Ⅰ型胶原酶消化法原代培养HUVEC, Ⅷ因子相关抗原检测法鉴定细胞.沙利度胺溶于0.5%二甲基亚砜(DMSO)中,分为3组.A组为沙利度胺组,分4个浓度梯度,分别为10、25、50和75 mg/L;B组为沙利度胺+曲安奈德组,为含1 mg/L曲安奈德的各浓度沙利度胺;C组为对照组.HUVEC传代植入96孔板,细胞密度为1×10~4/mL,过夜,加入不同浓度的药物,处理72 h; 在酶标仪570 nm波长处读取吸光度(A)值. 结果: 2组药物均对HUVEC的增殖有明显的抑制作用 (P < 0.01),抑制作用与药物浓度呈正相关;与A组相比,B组对HUVEC抑制作用更强(P < 0.05).结论:沙利度胺及曲安奈德对血管内皮细胞增殖有明显作用,这两类药物在治疗新生血管性疾病中可发挥一定作用.     

Isolation and In Vitro Culture of Vascular Endothelial Cells from Mice

In cardiovascular disorders, understanding of endothelial cell (EC) function is essential to elucidate the disease mechanism. Although the mouse model has many advantages for in vivo and in vitro research, efficient procedures for the isolation and propagation of primary mouse EC have been problematic. We describe a high yield process for isolation and in vitro culture of primary EC from mouse arteries (aorta, braches of superior mesenteric artery, and cerebral arteries from the circle of Willis). Mouse arteries were carefully dissected without damage under a light microscope, and small pieces of the vessels were transferred on/in a Matrigel matrix enriched with endothelial growth supplement. Primary cells that proliferated in Matrigel were propagated in advanced DMEM with fetal calf serum or platelet-derived serum, EC growth supplement, and heparin. To improve the purity of the cell culture, we applied shearing stress and anti-fibroblast antibody. EC were characterized by a monolayer cobble stone appearance, positive staining with acetylated low density lipoprotein labeled with 1,1''-dioctadecyl-3,3,3'',3''-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate, RT-PCR using primers for von-Willebrand factor, and determination of the protein level endothelial nitric oxide synthase. Our simple, efficient method would facilitate in vitro functional investigations of EC from mouse vessels.     

血小板微颗粒对人脐静脉内皮细胞VEGF表达的影响

目的:探讨血小板微颗粒( PMPs)影响内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)释放的可能机制及其临床意义.方法:常规培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)CRL-1730,配制不同干预浓度的PMPs与HUVECs共培养不同时间,应用半定量逆转录聚合酶链反应技术测定内皮细胞VEGF、VEGFⅡ型受体Fh/KDR、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)以及胞外信号调节激酶(ERK)mRNA的表达水平.结果:(1)VEGF mRNA的表达水平在0mg/L组高于PMPs10、30、50、100 mg/L干预组(均P＜0.05),VEGFⅡ型受体Flt/KDR mRNA表达水平在0mg/L组低于PMPs10、30、50、100 mg/L(均P＜ 0.05).ERK mRNA表达水平在PMPs50mg/L组高于0mg/L组(P=0.004),PI3K mRNA表达水平在PMPs100 mg/L组高于0 mg/L组(P=0.004).(2)50 mg/L PMPs干预细胞,VEGF mRNA的表达水平在0h组高于4h、24 h组(P＜0.05),KDR mRNA的表达水平在0h组低于4h、24h组(均P＜0.05),PI3K mRNA的表达水平在0h组低于24 h组(P=0.004).结论:PMPs可能通过VEGF受体,激活其下游信号转导通路,发挥促进血管和血管发生为基础的生物学效应.     

闭塞性周围动脉粥样硬化患者血管内皮损伤的研究

目的:观察闭塞性周围动脉粥样硬化(ASO)患者的凝血和纤溶系统功能的变化,探讨ASO患者的内皮损伤机制。方法:选择ASO患者82例(患者组)和健康对照80例(对照组),采用流式细胞仪测定循环内皮细胞(CEC)和内皮祖细胞(EPCs)数量。采用酶联免疫吸附法测定凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)。采用血液凝固仪测定凝血因子Ⅶ活性(FⅦ:A)、纤维蛋白原(FIB)、vW因子抗原水平(vWF∶Ag)、组织型纤溶酶原激活物活性(t-PA∶A)及纤溶酶原活化抑制物活性(PAI∶A)水平。以vWF∶Ag参考范围上限(150%)作为医学决定水平,将患者组分为vWF∶Ag正常组(38例)和vWF∶Ag增高组(44例)。结果:患者组PAI∶A、FⅦ∶A、FIB、vWF∶Ag、TAT和CEC高于对照组,EPCs低于对照组,vWF∶Ag增高组的PAI∶A、FⅦ∶A和TAT均高于vWF∶Ag正常组,差异有统计学意义(均P<0.01);患者组vWF∶Ag与FⅦ∶A、PAI∶A、TAT均呈正相关(P<0.01)。结论:ASO患者存在较严重的血管内皮损伤,内皮细胞大量脱落,且损伤后的修复能力不足,其纤溶和凝血系统功能紊乱和血管内皮损伤程度相关。     

高浓度大鼠肝实质细胞与非实质细胞共培养的细胞功能研究

目的:高浓度肝实质细胞与非实质细胞原代共培养,研究其功能活性。方法:应用原位胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞,获得有活性的肝细胞,并应用高浓度实质和非实质肝细胞共培养的方法原代培养（共培养组）,并以微囊肝细胞培养为对照组（微囊组）进行了比较。结果:两组均维持白蛋白分泌、尿素合成功能7天;共培养组的白蛋白分泌与微囊组一样为下降趋势,共培养组从（0.870±0.102）降至（0.492±0.040）g·L-1·10-6cells·24h-1,微囊组从（1.147±0.099）降至（0.375±0.012）g·L-1·10-6cells·24h-1;共培养组的肝细胞第4天后维持在一个较稳定的水平,而微囊组肝细胞前3天明显高于共培养组,而后两天显著低于共培养组（P<0.05）。共培养组的尿素合成功能,由（4.50±0.56）降至（4.37±0.19）μmol·L-1·10-6cells·90min-1,微囊组由（5.42±0.81）降至（3.60±0.33）μmol·L-1·10-6cells·90min-1,前3天微囊组高于共培养组,后2天共培养组明显高于微囊组（P<0.05）。共培养2～7天肝细胞的对氨基苯甲酸（PABA）浓度稳定在 7.2～9.9mg/L·10-6cells·24h-1。结论:高浓度肝实质细胞与非实质细胞共培养,可使肝细胞的特异性功能维持7d,而且较微囊肝细胞更适合应用于中空纤维舱型生物人工肝。     

大鼠肝细胞的原代培养及鉴定

目的：探讨大鼠肝细胞原代培养的方法及细胞的鉴定。方法：采用胶原酶消化获取大鼠肝细胞进行纯化、培养。并采用免疫组织化学方法对其进行鉴定。结果：培养的肝细胞产量高、活力好，用相差显微镜对不同生长时期的肝细胞进行观察证实了细胞贴壁后变平变薄，双核细胞和多核细胞呈岛状连接的形态学特性，采用抗大鼠细胞角蛋白（ck18）的特异抗体进行免疫组化细胞爬片鉴定，经SP染色DAB显色后，阳性着色部位在胞浆呈棕黄色颗粒，阴性对照未见着色。结论：成功地体外培养了大鼠肝细胞并对其进行了鉴定，为进一步的实验研究奠定了基础。     

血管内皮生长因子及其受体在原发性胆囊癌中的分布及意义

目的：探讨血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）在原发性胆囊癌（ＰＧＣ）生长、转移等生物学行为中的作用。方法：采用免疫组织化学ＬＤＰ法研究４７例ＰＧＣ组织中ＶＥＧＦ及其受体（ＫＤＲ）的定位与表达。结果：ＰＧＣ组织中ＶＥＧＦ表达的阳性率为６５．９６％,阳性物质主要位于肿瘤细胞浆,ＫＤＲ阳性物质位于癌细胞及癌组织旁的血管内皮细胞。ＶＥＧＦ表达在ＰＧＣ高分化型（６２．８６％）,Ｎｗｖｉｎ临床分期Ⅰ～Ⅲ（５６．２５