组织工程血管种子细胞的培养

目的:为构建组织工程血管提供种子细胞。方法:全麻下取兔的主动脉,分别采用酶消化法和组织块贴壁法培养血管内皮细胞和平滑肌细胞,并传代、免疫组化鉴定及倒置显微镜下形态学观察。结果:成功地培养出血管内皮细胞和平滑肌细胞并传代。倒置显微镜下血管内皮细胞呈“鹅卵石”形态,平滑肌细胞呈典型的“峰-谷”状。免疫组化鉴定内皮细胞Ⅷ因子(+),平滑肌细胞α-肌动蛋白(+)。结论:所培养的血管内皮细胞和平滑肌细胞为研究组织工程血管提供了细胞来源。     

骨组织工程再血管化种子细胞来源：兔肾微血管内皮细胞体外培养及其细胞表型的研究

背景：在骨组织工程研究中，面临从体外实验过渡到体内成骨时如何快速血管化的问题，尽早建立血运才能保留组织工程骨的成骨优势。在体外短时间内能大量扩增且纯度较高的细胞，才能成为组织工程化骨再血管化理想的种子细胞。目的：探索肾微血管内皮细胞的体外培养方法，并对其进行鉴定和表型研究，拟为骨组织工程再血管化提供理想的种子细胞。设计：单一样本研究。单位：苏州大学附属儿童医院骨科。苏州大学生命科学院生物技术研究所。材料：实验于2003-05／2004-04在苏州大学附属儿童医院骨科实验室完成。实验材料为C02培养箱，M199，胎牛血清，Ⅳ型胶原酶，40g／L多聚甲醛，20g／L戊二醛，EGGF，鼠抗人第八因子单克隆抗体(抗FⅧ-RAg)，多标记免疫分析系统(1420，WALLAC BLCTOR^2)，离心机，倒置显微镜，免疫荧光显微镜等。方法：采用三步梯度筛网法，先获得较高纯度的肾血管球，再应用肾血管球外植法体外培养肾微血管内皮细胞。进一步对肾微血管内皮细胞进行免疫组化法的Ⅷ因子相关抗原鉴定，用透射电镜观察细胞浆Weibel-Palade小体，以及采用间接免疫荧光法检测CD31，CD34及CD44表达。主要观察指标：肾微血管内皮细胞形态、活性及表型。结果：体外培养出纯度很高的血管内皮细胞并培养了11代。此外，免疫组化显示Ⅷ因子相关抗原阳性，电镜下观察到Weibel-Palade小体，以及间接免疫荧光检出CD31，CD34表达阳性，而12D44阴性。结论：本实验方法可成功培养出肾微血管内皮细胞，且后者表达CD31，CD34细胞表型。     

血管组织工程种子细胞原代培养技术的改良

背景:如何获取高质量的种子细胞是构建组织工程血管的先决问题。目的:改良血管组织工程种子细胞原代培养技术并观察其生物学特性。设计、时间及地点:以细胞为培养对象,观察性实验,于2006-12/2008-03在江西省分子医学重点实验室完成。材料:新西兰家兔,体质量2kg左右,用于血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的原代培养。方法:以胶原酶胰酶序贯消化法获得血管内皮细胞、快捷贴壁法培养血管平滑肌细胞。主要观察指标:免疫细胞化学法对两者进行鉴定;流式细胞术检测第2代和第6代血管内皮细胞的增殖指数。结果:培养的种子细胞符合各自特征,免疫细胞化学鉴定其为血管内皮细胞和血管平滑肌细胞。内皮细胞第2代和第6代细胞增殖指数分别为(20.87±2.05)%和(9.75±1.76)%。结论:胶原酶胰酶序贯消化法和快捷贴壁法可以较稳定地获取血管内皮细胞及血管平滑肌细胞;第2代的内皮细胞较第6代更适用于构建组织工程血管。     

血管组织工程中单根主动脉培养的内皮细胞和平滑肌细胞形态学和生长增殖

目的：探索体外培养及扩增同一来源内皮细胞和平滑肌细胞的有效方法，为研究内皮细胞和平滑肌细胞相互关系和体外构建组织工程血管提供理论和实践基础。方法：在体外用酶消化法和组织块贴壁法分别建立内皮细胞和平滑肌细胞的原代，并应用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸钠传代培养。应用光镜、透身电镜和细胞计数对内皮细胞和平滑肌细胞的形态和增殖进行研究。结果：酶消化法和植块培养法可以有效的建立起内皮细胞和平滑肌细胞的原代。讨论：内皮细胞和平滑肌细胞作为血管构成的基本细胞，对于它们的形态学、体外培养和扩增以及相互关系的研究具有重要的意义。     

小径人工血管内皮化种子细胞的实验研究

目的：为小径人工血管内皮化种子细胞的实验研究提供理想的种子细胞来源。方法：收集健康成人骨髓，通过Ficoll离心法获得骨髓单个核细胞，置于纤维连接蛋白预衬的DMEM培养基中，用血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)加以诱导，并通过荧光显微镜和免疫组化分析等方法对诱导后的细胞进行形态学观察和鉴定。结果：在VEGF、bFGF等诱导因子存在的条件下．骨髓单个核细胞分化成为内皮细胞，倒置荧光微镜下呈典形的“纺锤样”梭形细胞，单层细胞贴壁生长融合时呈铺路石样排列，免疫组化示VWF抗体染色阳性，CD34抗体染色阴性。结论：成人骨髓单个核细胞在特定培养条件下可诱导分化成为内皮细胞，可作为小径人工血管内皮化理想的种子细胞。     

231培养液培养成人大隐静脉平滑肌细胞

目的：应用231培养基培养成人大隐静脉平滑肌细胞探讨其有效方法。 方法：实验于2004-11／2005-3在首都医科大学附属北京安贞医院北京心肺血管疾病研究所中心实验室完成。①平滑肌细胞分离：40例冠状动脉旁路移植术患者（年龄43-74岁）术中废弃的大隐静脉，经患者同意无菌取2.0-3.0cm。2．5以胰蛋白酶溶液吹打消化15min，去除内皮细胞，同时松动平滑肌细胞，便于细胞游离出组织块生长。将血管剪成2．0-3．0mm^2的小块贴到培养瓶底，加入完全231培养液3mL，直立放入37℃、体积分数为0．05的CO2、饱和湿度的培养箱中，24h后将培养瓶放平使培养液浸没组织块继续培养。②平滑肌细胞传代：当细胞延组织块周围密集成片生长时，即可传代。③平滑肌细胞形态观察：应用倒置显微镜观察平滑肌细胞生长状况，记录生长曲线，观察各生长时期变化。④平滑肌细胞鉴定：应用透射电镜和免疫组织化学方法鉴定平滑肌细胞。 结果：①大隐静脉平滑肌细胞形态观察结果：大隐静脉平滑肌细胞原代培养沿组织块长出时间为2-14d，经过7d潜伏期细胞进入对散生长期，细胞呈“峰谷”长势。原代细胞培养第（25&;#177;2．1）天传第l代，传代24h后进入对数生长期，细胞传lO代以上仍保持良好的形态结构。培养成功率100％。培养过程中未见杂细胞或微生物污染。②大隐静脉平滑肌细胞鉴定结果：电镜下观察，胞浆内富含肌丝，纵。向平行排列，胞内有密体，具有平滑肌细胞特征；抗α平滑肌肌动蛋白免疫组织化学染色后可见胞浆内染成褐色呈细丝网状，所有细胞均呈阳性染色。证实培养细胞为平滑肌细胞。 结论：利用消化贴块方法分离人大隐静脉平滑肌细胞，应用231培养基进行培养，不仅培养成功率高，并且可产生高纯度及多数量的平滑肌细胞。技术具有操作简便，污染机会少，为心血管疾病研究和组织工程学研究及应用提供可靠的细胞模型。     

骨髓间充质干细胞定向分化为心脏瓣膜构成细胞及鉴定

背景:心脏瓣膜的组成成分中不是只有内皮细胞发挥作用,成纤维细胞、平滑肌细胞等均参与心脏瓣膜基质成分构建.目的:建立可以在体外获得大量内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞的简便方法,并对获得细胞进行形态观察及表面标志鉴定.方法:全髓贴壁法获取大鼠原代骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增,第3代细胞在特定条件下分别向内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞方向诱导分化,每日于倒置显微镜下观察细胞生长情况,并对诱导分化的细胞行免疫细胞化学检测.结果与结论:骨髓间充质干细胞在特定条件下诱导培养后,诱导后的细胞分别具有内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的特点.提示骨髓间充质干细胞在体外可以定向分化为内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞.     

实验犬浅静脉内皮细胞原位获取及体外培养

背景:自体血管内皮细胞数量有限且体外长期培养传代后存在功能老化,是目前制约组织工程血管发展的问题.目的:实验拟验证通过体外分离和大规模培养方式为组织工程动脉支架体外内皮化提供血管内皮细胞的可行性.设计、时间及地点:重复测量设计,实验于2007-03/12在复旦大学附属中山医院中心实验室完成.材料:健康杂种犬6只,雌雄不拘,体质量35～40kg,用于获取血管内皮细胞.方法:将犬麻醉后前肢隐静脉原位插管,采用Ⅰ型胶原酶消化法获取血管内皮细胞,体外培养、传代并大规模扩增.采用微格法每日计数培养的细胞总数.主要观察指标:倒置显微镜观察细胞生长情况,透射电镜和细胞免疫化学进行细胞鉴定,检测原代和传代细胞的条件培养液中6-酮-前列腺素F1°和Ⅷ因子相关抗原的含量.结果:倒置显微镜下观察静脉内皮细胞呈典型的"纺锤样"梭形细胞,单层细胞贴壁生长至融合时呈铺路石样排列.透射电镜下见内皮细胞胞浆中特征性Weibel-Palade小体.细胞免疫化学显示血管内皮细胞Ⅷ因子相关抗原抗体染色阳性.原代及传代细胞培养上清液中6-酮-前列腺素F1°和Ⅷ因子相关抗原的含量差异无显著性意义(P＞0.05).结论:实验成功培养、传代并大规模扩增静脉血管内皮细胞.所培养的静脉内皮细胞可以为组织工程动脉支架体外内皮化提供足够数量和功能良好的细胞.     

骨组织工程再血管化种子细胞来源:兔肾微血管内皮细胞体外培养及其细胞表型的研究

背景在骨组织工程研究中,面临从体外实验过渡到体内成骨时如何快速血管化的问题,尽早建立血运才能保留组织工程骨的成骨优势.在体外短时间内能大量扩增且纯度较高的细胞,才能成为组织工程化骨再血管化理想的种子细胞.目的探索肾微血管内皮细胞的体外培养方法,并对其进行鉴定和表型研究,拟为骨组织工程再血管化提供理想的种子细胞.设计单一样本研究.单位苏州大学附属儿童医院骨科,苏州大学生命科学院生物技术研究所.材料实验于2003-05/2004-04在苏州大学附属儿童医院骨科实验室完成.实验材料为CO2培养箱,M199,胎牛血清,Ⅳ型胶原酶,40 g/L多聚甲醛,20 g/L戊二醛,ECGF,鼠抗人第八因子单克隆抗体(抗FⅧ-RAg),多标记免疫分析系统(1 420,WALLAC BLCTOR2),离心机,倒置显微镜,免疫荧光显微镜等.方法采用三步梯度筛网法,先获得较高纯度的肾血管球,再应用肾血管球外植法体外培养肾微血管内皮细胞.进一步对肾微血管内皮细胞进行免疫组化法的Ⅷ因子相关抗原鉴定,用透射电镜观察细胞浆Weibel-Palade小体,以及采用间接免疫荧光法检测CD31,CD34及CD44表达.主要观察指标肾微血管内皮细胞形态、活性及表型.结果体外培养出纯度很高的血管内皮细胞并培养了11代.此外,免疫组化显示Ⅷ因子相关抗原阳性,电镜下观察到Weibel-Palade小体,以及间接免疫荧光检出CD31,CD34表达阳性,而CD44阴性.结论本实验方法可成功培养出肾微血管内皮细胞,且后者表达CD31,CD34细胞表型.     

构建组织工程皮肤种子细胞的人血管内皮细胞的培养

目的 探讨如何以简便快捷的方法获得大量生长状态良好的人血管内皮细胞，以作为构建含血管组织工程皮肤的种子细胞。方法 以新生儿脐带静脉作为细胞来源，用消化法获得血管内皮细胞，用本实验室设计的方法对细胞进行纯化培养，倒置显微镜观察细胞形态，结合免疫组化检测(第Ⅷ因子)和透射电留(Weibel-Palade小体)签定细胞来源。结果 用本实验室的纯化方法获得的血管内皮细胞未见成纤维细胞污染，细胞增殖旺盛，处于良好的生长状态。结论 结果表明本实验方法可以获得大量处于良好生长状态的高纯度血管内皮细胞，可以用于含血管组织工程皮肤的构建。     

大鼠肺微血管内皮细胞培养方法的对比和改进

背景：肺微血管内皮细胞的分离和培养国外多采用消化培养法，对培养基和其他实验条件要求较高。国内大部分采用组织块贴壁培养法。 目的：比较消化法和组织块法培养肺微血管内皮细胞的差异，并进行改进，以获取大量纯化的肺微血管内皮细胞。 设计、时间及地点：细胞水平的观察对比实验，于2006—09／2007—09在解放军第四军医大学分子生物与生化实验室完成。材料：选用Wistar大鼠30只，按随机 数字表法分为2组，组织块法培养组及消化法培养组各15只。 方法：分别采用组织块法与消化法进行肺微血管内皮细胞原代培养，并在培养过程中进行如下改进：①加大灌注大鼠肺脏的磷酸盐缓冲液液体量并改进灌注方法。②改进大鼠肺脏脏层胸膜的去除方法。 主要观察指标：通过形态学观察、免疫组织化学染色、扫描电镜、描绘生长曲线等方法对培养的细胞进行鉴定。 结果：①组织块法培养的肺微血管内皮细胞在细胞活力、增殖速度方面明显优于消化法（P〈0．01）。②组织块法获得的肺微血管内皮细胞倒置显微镜下呈典型铺路石样排列，AgⅧ相关抗原免疫组化染色呈阳性，扫描电镜下观察可见细胞表面有丰富的微绒毛。 结论：相对于消化法，组织块法培养的肺微血管内皮细胞更具活力，增殖速度也更快。     

血管内皮生长因子受体KDR表达情况检测

目的：检测血管内皮生长因子受体KDR在不同肿瘤细胞和组织中的表达情况。方法：采用细胞酶联免疫和免疫组化法，利用抗KDR单克隆抗体，检测KDR在不同肿瘤细胞和组织表面的表达情况。结果：发现KDR在人肝癌细胞SMMC-7721和人胚胎脐静脉内皮细胞(HUVEC)表面表达阳性，在人正常细胞Wish细胞和人平滑肌细胞表面表达呈阴性。在乳腺癌组织的血管内皮细胞表达阳性，而在乳腺炎和膀胱癌组织的血管内皮细胞表达呈阴性。结论：KDR的特异性表达，可为肿瘤的靶向治疗提供一个很好的靶位点。     

兔结膜杯状细胞的无血清培养法

目的 探索无血清培养系统用于结膜上皮杯状细胞培养的可行性。方法 用不含血清培养液进行组织块培养,通过倒置相差显微镜观察细胞形态,并应用特殊组化染色和免疫组化方法对培养杯状细胞进行鉴定。结果 倒置相差显微镜下可见在无血清培养液中杯状细胞形态与活体组织中相似,免疫组化法证实部分细胞PAS和MUC5AC呈阳性染色。结论 兔结膜杯状细胞可通过无血清培养法在体外培养,并保持活体细胞特性,为进一步研究杯状细胞相关的眼表疾病及药理毒理作用提供有效的细胞模型。     

人脐带内皮细胞与平滑肌细胞的分离培养特照

目的：如何便捷有效地获取种子细胞是构建组织工程皮肤、角膜、血管等成功与否的关键，实验对人胎儿脐带内皮细胞和平滑肌细胞的分离、纯化、培养扩增技术进行探讨。方法：实验于2006—11在暨南大学医学院完成。①实验材料：剖宫产正常胎儿脐带由暨南大学第一临床学院提供，产妇均知情同意。②实验方法：配制培养液，A液为在M199培养液中加入20％胎牛血清、20mg，L肝素、10μg／L碱性成纤维细胞生长因子，B液为在M199培养基中加入10％胎牛血清、250mg／L G418。取脐带15-20cm，采用胶原酶“灌注消化法”获取脐带内皮细胞制成悬液，静置0．5h后利用成纤维细胞短时间内贴壁的特点，把尚未贴壁细胞吸出重新接种于含有A液的培养瓶，初步去除部分成纤维细胞，细胞贴壁24h后将培养液换为B液，继续培养3d，去除成纤维细胞，然后再用A液扩大培养。从消化完脐静脉内皮细胞的脐带中剥取脐动脉，刮除内皮细胞，将血管条剪成小块均匀贴于培养瓶底，培养瓶内加入含20％小牛血清的DMEM培养液2mL，缓慢竖直培养瓶，以培养液刚未浸没培养块为最佳，放入37℃、体积分数为0．05的CO2培养箱内干涸8h后，将培养瓶轻轻翻转，使植块刚浸入培养液中，绝对静置3d，以后每3d换液1次，待植块周围生长晕的细胞融合成片时，即可传代，传代后DMEM培养液的血清浓度由原来的20％改为5％，且在培养液中加入0．2L肝素。⑧实验评估：通过倒置相差显微镜观察细胞生长情况，分别以第Ⅷ因子、α-肌动蛋白免疫组织化学染色法鉴定内皮细胞和平滑肌细胞。结果：①内皮细胞的生长观察：接种24h后，镜下可见刚贴壁的细胞呈圆形，逐渐转变为多角形或梭形，胞间可见有成纤维细胞混杂，加入B液3d后成纤维细胞逐渐死亡。传代细胞呈“铺路石”样，细胞周围特别是近胞核处可见明显光晕，为典型的内皮细胞生长特点。②内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原的检测：胞浆丰富且有棕黄色颗粒，细胞核不着色，呈阳性反应。⑧平滑肌细胞的生长观察：镜下组织块贴壁后5～7d可见有少数细胞从植块边缘游出，第10-15天植块周围形成明显的细胞生长晕．细胞呈长梭形、带状或三角状，有1-4个细胞核，可见半透明颗粒，第20-25天细胞密集、平行排列，形成“峰谷样”结构，是平滑肌细胞的特征性生长表现。④平滑肌细胞特异性α-肌动蛋白单克隆抗体检测：胞浆内可见棕黄色细丝，为特异性α-平滑肌肌动蛋白，细胞核不着色。结论：以胎儿脐带作为种子细胞的来源，成功分离后通过调节培养液的成分，既能排除成纤维细胞的污染又可以令内皮细胞和平滑肌细胞快速增殖。     

组织块贴壁法培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞的特征

目的：采用组织块贴壁法培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞，并应用光镜、电镜和免疫组织化学方法观察细胞各生长时期的形态变化。方法：实验于2004—02／08在中国医科大学基础医学院药理实验室完成。选择健康清洁级Wistar大鼠30只，体质量150—180g，无菌条件下取全段主动脉中膜组织修剪成1mm&;#215;1mm大小的组织块直接贴壁于一次性塑料培养皿中，组织块间距0．5cm，保证细胞从组织块游出后有足够的生长空间并保持局部细胞密度的均匀，发现漂起的组织块及时清理，于37℃孵箱内放置1．5h左右使组织块与壁贴附后，缓慢加入改良Eagle培养液培养3～5d，待有细胞从组织块周围游出后换液。当细胞长满培养皿时即可传代。采用倒置相差显微镜和透射电镜及抗α-平滑肌肌动蛋白免疫组织化学方法观察主动脉平滑肌细胞的形态。绘制主动脉平滑肌细胞生长曲线，观察各生长时期的变化，并评估其培养方法的优点。结果：30只大鼠全部进入结果分析。①技术方法优点：贴块方便，直接一次性贴壁使污染机会少，随组织块生长随时清理漂起的组织块，可减少对其他组织块的毒性作用，并增加已游离出的细胞生长空间。②原代培养血管平滑肌细胞：光镜观察形态多样，大小略有差异，胞体较小，胞质折光性强。③传代血管平滑肌细胞：光镜下观察呈现特征性“峰”、“谷”状生长。电镜下观察：细胞形态不规则，胞浆内有肌丝，纵向平行排列，有密区，具备平滑肌细胞特征。免疫组织化学染色后可见细胞浆中大量平行条状棕黄染色、胞核不着色，所有细胞均染色，呈阳性。④主动脉平滑肌细胞生长曲线：血管平滑肌细胞生长曲线近似“S”形，传代后第1天细胞数有所减少，经过2d潜伏适应期后进入对数生长期，持续两三天进入平台期。结论：组织块贴壁法培养技术具有操作简便，污染机会少，有足够细胞生长空间的优点，经光镜和电镜观察培养出新的主动脉血管平滑肌细胞具有平滑肌细胞特征，免疫组织化学染色也显示所有细胞均呈阳性。传代培养后第2天进入对数生长期，持续两三天进入平台期，可产生纯度高及数量多的平滑肌细胞。     

231培养液培养成人大隐静脉平滑肌细胞

目的:应用231培养基培养成人大隐静脉平滑肌细胞探讨其有效方法。方法:实验于2004-11/2005-3在首都医科大学附属北京安贞医院北京心肺血管疾病研究所中心实验室完成。①平滑肌细胞分离:40例冠状动脉旁路移植术患者(年龄43～74岁)术中废弃的大隐静脉,经患者同意无菌取2.0～3.0cm。2.5g/L胰蛋白酶溶液吹打消化15min,去除内皮细胞,同时松动平滑肌细胞,便于细胞游离出组织块生长。将血管剪成2.0～3.0mm2的小块贴到培养瓶底,加入完全231培养液3mL,直立放入37℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度的培养箱中,24h后将培养瓶放平使培养液浸没组织块继续培养。②平滑肌细胞传代:当细胞延组织块周围密集成片生长时,即可传代。③平滑肌细胞形态观察:应用倒置显微镜观察平滑肌细胞生长状况,记录生长曲线,观察各生长时期变化。④平滑肌细胞鉴定:应用透射电镜和免疫组织化学方法鉴定平滑肌细胞。结果:①大隐静脉平滑肌细胞形态观察结果:大隐静脉平滑肌细胞原代培养沿组织块长出时间为2～14d,经过7d潜伏期细胞进入对数生长期,细胞呈“峰谷”长势。原代细胞培养第(25±2.1)天传第1代,传代24h后进入对数生长期,细胞传10代以上仍保持良好的形态结构。培养成功率100%。培养过程中未见杂细胞或微生物污染。②大隐静脉平滑肌细胞鉴定结果:电镜下观察,胞浆内富含肌丝,纵向平行排列,胞内有密体,具有平滑肌细胞特征;抗α平滑肌肌动蛋白免疫组织化学染色后可见胞浆内染成褐色呈细丝网状,所有细胞均呈阳性染色。证实培养细胞为平滑肌细胞。结论:利用消化贴块方法分离人大隐静脉平滑肌细胞,应用231培养基进行培养,不仅培养成功率高,并且可产生高纯度及多数量的平滑肌细胞。技术具有操作简便,污染机会少,为心血管疾病研究和组织工程学研究及应用提供可靠的细胞模型。     

构建组织工程皮肤种子细胞的人血管内皮细胞的培养

目的探讨如何以简便快捷的方法获得大量生长状态良好的人血管内皮细胞,以作为构建含血管组织工程皮肤的种子细胞。方法以新生儿脐带静脉作为细胞来源,用消化法获得血管内皮细胞,用本实验室设计的方法对细胞进行纯化培养,倒置显微镜观察细胞形态,结合免疫组化检测(第Ⅷ因子)和透射电镜(Weibel-Palade小体)鉴定细胞来源。结果用本实验室的纯化方法获得的血管内皮细胞未见成纤维细胞污染,细胞增殖旺盛,处于良好的生长状态。结论结果表明本实验方法可以获得大量处于良好生长状态的高纯度血管内皮细胞,可以用于含血管组织工程皮肤的构建。     

组织工程研究中关于血管平滑肌细胞和血管内皮细胞的培养

血管内皮细胞和平滑肌细胞是执行血管生理功能的必要物质基础。因此,获取足够量的、健康有活力的种子细胞是血管组织工程研究将要解决的关键技术问题。组织块法培养的血管平滑肌细胞获得率高、增殖快、合成表型的细胞比例大,应选择组织块法分离培养的平滑肌细胞作为血管组织工程种子细胞来源。     

骨髓基质细胞向血管内皮细胞分化的体外培养研究

目的：研究骨髓基质细胞(marrow stromal cells，MSCs)向血管内皮细胞分化的可能性，以及内皮细胞特异性标志的表达。方法：实验选用7周龄清洁级雄性SD大鼠4只，抽取SD大鼠骨髓，进行体外培养和连续传代，获得较纯的MSCs。采用第4代的MSCs，以内皮细胞无血清条件培养液，表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)进行体外诱导，相差显微镜下观察各组细胞形态变化，以免疫组化方法鉴定内皮细胞特征样蛋白Ⅷ因子的表达阳性率，并通过透射电镜观察内皮细胞特异性W-P小体。结果：诱导前MSCs多呈扁平、多突起形态，诱导后形态均发生变化，10d细胞呈扁圆形，20d后细胞之间渐呈集落状、铺路石样排列。免疫组化检测Ⅷ因子阳性比例接近70％。透射电镜显示诱导后细胞内出现内皮细胞特异性W-P小体。结论：成体中的MSCs在一定诱导条件下可以表现内皮细胞样特征，是临床治疗缺血性疾病理想的移植用种子细胞。     

脂肪源干细胞向血管内皮细胞的分化

背景：脂肪来源干细胞在体内储备丰富,体外增殖快速,具有多向分化潜能,是目前组织工程种子细胞的研究热点。近年来越来越多的研究表明脂肪干细胞在一定条件下可被诱导分化为内皮细胞,促进血管生成。t目的：观察兔脂肪干细胞体外分离培养及诱导分化为血管内皮细胞的生物学特性。方法：取兔附睾处脂肪,采用胶原酶消化分离获得脂肪干细胞,体外培养至第3代后加入血管内皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子联合诱导分化,对诱导前后细胞进行形态学观察、生长曲线测定、免疫组织化学染色及流式细胞仪表型检测。结果与结论：兔脂肪干细胞生长旺盛,第3代兔脂肪干细胞呈成纤维细胞样,生长曲线呈“S”型,15代以内细胞形态未见明显变化。免疫荧光法检测Vimentin阳性,流式细胞仪检测CD44表达阳性,CD31表达阴性;诱导后细胞CD31表达阳性,CD44表达阴性。第3代兔脂肪干细胞向血管内皮细胞诱导分化21d显微镜下呈铺路石样形态,血管内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原染色细胞阳性,透射电镜下可见W-P小体。提示脂肪干细胞在体外可诱导分化为血管内皮细胞,可为组织工程血管提供理想的种子细胞。