IFN-γ刺激培养未成熟树突状细胞免疫耐受效应机制研究

目的通过γ-干扰素(IFN-γ)刺激培养未成熟树突状细胞,研究在体外IFN-γ诱导未成熟树突状细胞免疫耐受的效应机制。方法采用经典的GM-CSF+IL-4诱导方案,以获得细胞表面缺乏共刺激分子的大鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞,经IFN-γ刺激培养后,通过外源性抗原T细胞表位pCol(28-40)多肽培养,流式细胞仪检测表面MHCⅡ类分子及共刺激分子CD80、CD86,DC表面相对特异性标记OX62的情况,将脾脏分离淋巴细胞分为3组,即对照组、imDC组和imDCIFN-γ组,采用MTT法检测各组淋巴细胞增殖情况,Anneix-V-Flous检测各组淋巴细胞凋亡,ELISA法检测体外培养脾细胞上清液Th1/Th2型细胞因子,观察体外CD4+T细胞Th亚群的分化情况。结果 IFN-γ刺激培养的未成熟树突细胞通过外源性抗原T细胞表位pCol(28-40)多肽培养后低表达表面MHCⅡ类分子(14.01%)及共刺激分子CD80(4.78%)、CD86(19.79%),同样低表达DC表面相对特异性标记OX62(15.31%,P<0.05,n=4);MTT法检测共培养的脾淋巴细胞imDC组i、mDCIFN-γ组与对照组增殖...     

树突状细胞肿瘤疫苗研究进展

树突状细胞（dendriti ccells,Dc）是目前发现的功能最强的专职抗原递呈细胞,成熟DC表面高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子,共刺激分子（CD40、CD80、CD86等）和黏附分子（LFA-3、ICAM-1等）,而有效将肿瘤抗原提呈给T细胞,T细胞与DC结合后,大量分泌IL-12,诱导Th0细胞向Th1细胞分化,增强细胞免疫应答,有利于肿瘤清除。DC尚能分泌多种趋化因子,作用于初始型T细胞,增强T细胞的激活,使DC具有高水平抗肿瘤免疫功能,以DC为基础的肿瘤疫苗成为肿瘤免疫治疗的新策略和研究方向,并获得快速发展。现将近期DC肿瘤疫苗研究进展做一综述。     

ROS对树突细胞表型和功能成熟作用的研究进展

树突状细胞(DC)是体内最有效的抗原提呈细胞,可以将抗原提呈给T淋巴细胞,诱生抗原特异性CTL,在免疫反应中发挥重要作用. 活性氧(ROS)、自由基(RF)是体内一系列重要的生物活性分子,大量研究表明ROS参与包括NF-κB在内的多种信号途径,诱导重要的免疫系统基因的表达. 氧化应激诱导树突状细胞几种与T细胞相互作用的表面标志分子的表达上调,包括MHCⅡ类分子(DR和DQ)及共刺激分子CD40、CD80和CD86,并通过下调由甘露糖受体介导的胞饮作用来诱导DC早期成熟. 另外ROS处理过的DC比正常细胞更能刺激T淋巴细胞增殖,此作用可以被自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)和别嘌呤醇抑制. 本文就ROS对树突细胞表型和功能成熟作用的研究进展予以综述.     

树突状细胞在细菌、原虫感染免疫中的作用

树突状细胞(DC)是专职抗原提呈细胞(APC)，广泛分布于全身各个组织器官。微生物感染机体后，不成熟DC经模式识别受体(如Toll样受体，TLR)识别微生物抗原并成熟，其吞噬活性下降，而细胞表面分子(如MHC．Ⅰ、Ⅱ类分子)、共刺激分子(CD40、CD80、CD86、CD54)、黏附分子以及细胞因子(IL-12、IL-10、IFN-α)表达增强，能有效地刺激初始性T细胞的     

乳腺癌干细胞的树突状细胞疫苗对细胞毒性T淋巴细胞增殖的影响

目的探讨加载人类乳腺癌干细胞（BSC）的树突状细胞（DC）疫苗对细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活化效果的影响。方法从11例乳腺癌患者中分离并评价BSC,探讨BSC作为DC疫苗抗原的适用性,并在体外评估了杀伤BSC的能力。结果BSC表达高水平的干细胞相关分子CD44+、CD24-和CD133+,乳腺癌贴壁细胞表达CD44+、CD24＋和低CD133+。在体内,富集的乳腺癌细胞球表现出比贴壁细胞更强的致瘤能力。使用BSC裂解物的DC疫苗接种引发针对BSC的特异性T细胞应答。DC疫苗接种刺激Th1应答并诱导IFN-γ产生,与活化的CTL数量呈正相关。结论乳腺癌细胞球细胞具有干细胞特性和强致瘤功能,使用BSC抗原的DC接种可引发有效的抗原特异性Th1应答,进一步激活抗原特异性CTL并诱导IFN-γ产生。     

IL-15调节树突状细胞功能进而抗肿瘤机制研究

IL-15是一种新近发现的细胞因子,具有与IL-2 类似的作用,如激活T 细胞、B 细胞和NK细胞,并可介导这些细胞的增殖活化。IL-15还具备IL-2 所没有的优势,如能促进CD8+ 记忆性T 细胞的增殖活化,且不激活调节性T细胞(Tregs),解除Tregs对T 细胞的抑制作用。以上都显示了IL-15 在免疫调节中的重要作用。已有文献报道,将表达IL-15及其受体的鼠乳腺癌细胞注入小鼠体内,这些肿瘤细胞可以激发其对自身抗原的提呈能力,促进CTL增殖活化及IFN-γ的分泌,从而起到抗肿瘤作用。因此我们猜测IL-15可能会对专职性抗原提呈细胞,如树突状细胞(DC)也产生类似作用。此外相关文献报道,尼古丁可以增强DC的功能并通过激活MAPK和PI3K-AKT途径上调DC表面分子的表达。这些表面分子与我们前期实验中IL-15刺激后DC表面上调的分子大致相同,但是IL-15发挥其作用是否也是通过激活相似的信号通路还有待进一步研究。我们以C57小鼠髓系DC(BMDC)为研究对象,首先以流式细胞术检测IL-15受体是否在DC表面表达,然后以微量IL-15作用于DC后通过流式细胞术、蛋白质印迹法等检测DC表面分子表达量的变化。进而以BrdU增殖实验、ELISA及体内抗肿瘤实验检测IL-15是否可以增强DC介导的T细胞增殖活化以及CTL杀伤效应。最后通过应用信号通路阻断剂阻断相应的激酶结合BrdU增殖实验、蛋白质印迹等方法探究IL-15上调DC表面分子表达的作用机制。前期结果:DC表面确实存在IL-15受体,且IL-15可使DC表面MHCⅠ/Ⅱ、CD80、CD40等共刺激分子表达量上调。预期实验结果:在IL-15的作用下,DC介导的T细胞增殖活化及CTL的杀伤效应增强;使用相应信号通路阻断剂可以使DC表面分子表达量下降且DC介导的T细胞的增殖活化程度下降。 综上所述,IL-15可以通过上调DC表面MHCⅠ/Ⅱ,CD80,CD40等共刺激分子促进T细胞增殖活化以及CTL的杀伤效应。这种作用在适应性免疫应答以及抗肿瘤治疗中可能发挥重要作用,显示了IL-15的临床使用潜力。     

MHC-I类分子呈递外源性抗原的机制新进展

广泛存在于组织细胞中的主要组织相容性复合体 (majorhistocompatibilitycomplex ,MHC)编码的分子能与经抗原呈递细胞 (antigen presentingcell,APC)加工处理后的抗原肽结合成为激活相应细胞毒性T淋巴细胞 (cytotoxicTlymphocyte ,CTL)的始动信号之一。鉴于MHC的结构十分复杂 ,抗原呈递处理的机制仍有许多不明确。以往人们认为MHC I类分子只呈递内源性抗原肽并激活相应的CD8+ T细胞转化为致敏的CTL发挥细胞毒性作用。MHC II类分子呈递外源性抗原肽 ,激活CD4 +T细胞发挥其调理作用 ,启动体液免疫。近年来的研究表明由于特殊的A…     

Tc17细胞：一组新型的细胞毒性T细胞

细胞毒性T细胞(cytotoxic T cells,Tc细胞)是一组由初始CD8+T细胞活化后分化而成的具有细胞毒性的效应细胞,又称为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)。受自身MHCⅠ类分子的限制,并在抗原提呈细胞的协同刺激信号作用下进一步活化,形成可以特异性杀伤靶细胞的效应细胞毒性T细胞。依据分泌的细胞因子的不同,经典的     

树突状细胞在肿瘤免疫治疗中的应用

肿瘤的主动免疫治疗近年来一直是肿瘤治疗研究的热点。随着人们对免疫应答、T细胞活化机制认识的逐渐深入,抗原递呈细胞对肿瘤相关抗原(tumorassociatedantigenTAA)俘获、加工以及激活T细胞,从而启动抗肿瘤免疫反应越来越受到重视。树突状细胞(dendriticcellsDCs)起源于骨髓CD34 造血干细胞,是目前已知体内抗原递呈能力最强的抗原递呈细胞。它们特征性地高水平表达与抗原递呈有关的主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类和Ⅱ类分子,并高水平表达刺激分子CD80(B7 -1)、CD86(B7-2)、CD40、CD50等以及某些粘附分子,其本身也可以产生多种细胞因子如干扰素α(IFN -α)、白介素12(IL -12)、肿瘤坏死因子(TNF)等。DCs介导免疫反应的途径主要有:1.DC摄取、加工抗原,再转运至细胞内主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类和Ⅱ类分子富含区,形成MHC -肽复合体,在细胞表面表达并激活T细胞,CD8 细胞毒T细胞被MHC -Ⅰ类复合物分子激活,CD4 辅助T细胞被MHC -Ⅱ类复合物激活。2.DC可以自身分泌或诱导其他细胞分泌IL -12、白介素15(IL -15)等...     

CpG ODN对人胃癌BGC 823细胞RNA转染的脐血树突状细胞诱导CTL活性影响的研究

目的探讨肿瘤细胞RNA转染脐血树突状细胞对CTL特异性抗肿瘤作用的影响,以及CpG ODN对脐血DC的免疫佐剂作用。方法分离脐血单个核细胞,经SCF、GM-CSF和IL-4诱导和BGC823RNA转染形成成熟DC,加入CpG ODN,通过形态学、表面标志和DC诱导T细胞增殖和CTL杀伤活性判断CpG ODN对DC功能的影响。结果肿瘤RNA转染后DC高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和CD54、CD80和CD86,对T细胞的促增殖作用和CTL杀伤活性显著增强,P〈0.01。CpG ODN能显著促进DC功能。结论从脐血中诱导出DC,经肿瘤细胞RNA转染,可使DC表达MHC分子、协同刺激分子、黏附分子以及活化T细胞能力显著增强,CpG ODN具有增强DC抗原提呈功能的作用。     

负载冻融抗原的DC诱导特异性CTL杀伤U937细胞的实验研究

目的　探讨树突状细胞 (DC)负载白血病细胞株U937冻融抗原 ,体外诱导细胞毒性T细胞 (CTL) ,使其对U937细胞产生特异性杀伤作用。方法　应用基因重组人白介素 4 (rhIL 4 )、基因重组人粒 /单细胞集落刺激因(rhGM CSF)联合培养体系自正常人骨髓单个核细胞诱导产生DC ,使其负载U937冻融抗原 ,致敏T淋巴细胞 ,产生CTL。观察负载U937冻融抗原的DC对所激发的T淋巴细胞表型及功能的影响及CTL对U937细胞的特异性杀伤活性。结果　负载U937冻融抗原后DC的CD1a表达率较培养前明显增高 (P <0 .0 1) ,CD86、CD11c、HLA DR表达也较培养前明显增高 (P <0 .0 1) ,而CD83、CD14与培养前相比无明显变化 (P >0 .0 5 )。且负载U937冻融抗原DC诱导的CTL中 ,CD3+ CD8+ T细胞比例较诱导前明显增高 (P <0 .0 1)。U937冻融抗原负载DC诱导CTL对U937细胞及K5 6 2细胞的杀伤率分别为 (6 6 .96± 6 .2 1) %和 (9.81± 4 .4 5 ) % ,两者有极显著性差异 (P <0 .0 0 1)。结论　经rhGM CSF、rhIL 4培养产生的DC为CD14 -CD1a+ 的DC ,能诱导CTL产生明显的特异性杀伤作用 ;负载U937冻融抗原DC诱导的CTL中的CD3+ CD8+ T细胞比例明显增高 ,提示CD8+ T细胞在抗肿瘤免疫中具有极其重要的作用。     

脐静脉内皮细胞诱导脐血单个核细胞向树突状细胞的分化

目的探讨人脐静脉内皮细胞对人脐血单个核细胞(UBMCs)向树突状细胞(DC)分化的影响,建立更便捷、更经济体外培养DC的方法。方法胶原酶消化分离出脐静脉内皮细胞(HUVEC),经鉴定和体外培养扩增后,使其平铺生长于Tran-swell板上室底部,将UBMCs接种到Transwell小室内,同时加入EC9706细胞冻融形成的蛋白质抗原,与HUVEC共培养,使UBMCs与HUVEC紧密接触并从Transwell板上室迁移到下室,收集Transwell板下室细胞,流式细胞术检测下室细胞DC相关表面标志CD80、CD40、CD83、CD1a和MHC分子;通过MTT法检测肿瘤负载的UBDC诱导CTL对靶细胞的特异性杀伤作用。结果经HUVEC诱导并负载了肿瘤细胞抗原的DC CD80、CD40、CD83、CD1a和MHC-Ⅱ类分子表达增加,产生的细胞毒性T细胞(CTL)可特异性杀伤食管癌细胞EC9706;与细胞因子诱导DC活化的CTL对EC9706的杀伤率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用Transwell小室以人原代脐静脉内皮细胞诱导脐血单个核细胞分化的DC是可行的一种实验方法。     

MAGE-3抗原肽致敏DC疫苗抗膀胱癌细胞的体外实验

目的探讨黑色素瘤MAGE-3抗原肽致敏的树突状细胞(DC)疫苗体外抗膀胱癌细胞增殖作用及其分子机制。方法采用Ficoll法从HLA-A2型外周血中分离单核细胞,细胞因子GM-CSF和白细胞介素4(IL-4) 诱导扩增DC细胞后经MAGE-3抗原肽致敏,致敏DC细胞和同型T淋巴细胞共培养法诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。MTT法检测抗原肽致敏DC对T淋巴细胞增殖的影响,CTL对靶细胞BIU-87的杀伤作用。采用流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡和凋亡相关蛋白变化。结果MAGE-3抗原肽致敏的DC对T淋巴细胞增殖率具有明显提高作用,高于无关抗原致敏DC及未致敏DC。经MAGE-3九肽冲击的DC可有效诱导对MAGE-3阳性细胞BIU-87杀伤的CTL活性,而无关抗原肽及未经抗原肽致敏的DC则不具备其杀伤能力。结论MAGE-3九肽致敏DC能显著促进T淋巴细胞增殖并诱导有效杀伤靶细胞的CTL作用。     

大鼠OX-62+树突状细胞的体外诱导及生物学特性

目的 :从大鼠骨髓中有效地诱导、培养OX 6 2 + 树突状细胞 (dendriticcells,DC) ,观察其表型及功能特征。方法 :大鼠骨髓细胞培养 3h ,贴壁细胞加入含重组大鼠GM CSF和IL 4 ,继续培养 6～ 12d ,淘洗法去非粘附细胞中的Fc受体阳性细胞 ,流式细胞仪分析细胞表型及抗原摄取能力 ,混合淋巴细胞反应检测其刺激同种T细胞增殖能力 ,ELISA测定分泌IL 12水平。结果 :培养DC90 %以上表达OX 6 2。培养 6d的OX 6 2 + DCs具有不成熟表型 ,表达中等水平的MHCII抗原和低水平的CD80、CD86、ICAM 1;分泌少量IL 12 ;具有较强的摄取抗原能力 ,但刺激同种T细胞增殖能力极低。培养 12d的OX 6 2 + DC已经成熟 ,MHCII、CD8、CD86、ICAM 1表达明显增加 ;分泌IL 12增加 ;摄取抗原能力下降 ;刺激同种T细胞增殖能力明显增强。结论 :成功建立了体外大量扩增大鼠骨髓OX 6 2 + DC的新方法。     

应用自动磁性细胞分选器分选人CD_4~+CD_(25)~+调节T细胞

目的:建立应用自动磁性细胞分选器(autoMACS)分选人CD4+CD2+5免疫调节T细胞(Tregs)的方法。方法:应用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,应用autoMACS分选其中的CD4+CD2+5T细胞,流式细胞技术检测分选细胞的纯度。结果:分别从5.7×107及5.6×107外周血单个核细胞中分选出6.9×105及6.7×105个CD4+CD2+5T细胞,其纯度>98%。结论:应用autoMACS可高效分选出高纯度的CD4+CD25+T细胞,为深入研究其功能打下了基础。     

黏蛋白1(MUC1)致敏的树突状细胞疫苗体外抗肿瘤实验研究

目的 研究以CpG作为免疫佐剂,应用黏蛋白1（MUC1）致敏树突状细胞（DC）制备疫苗在体外诱导的特异性抗肿瘤作用。方法 健康人外周血采用密度梯度离心法,分离外周血单核细胞（PBMC）,应用GM-CSF、IL-4、TNF-α等细胞因子体外培养诱导DC,观察细胞形态,并通过流式细胞术检测成熟DC细胞标志物CD80、CD86。再应用CpG作为免疫佐剂,MUC1作为抗原致敏DC制备疫苗,致敏的DC与T细胞混合培养,观察其诱导T淋巴细胞增殖能力。诱导产生的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）与肿瘤靶细胞以5：1、10：1、20：1的效靶比共孵育,MTT法检测CTL杀伤活性。结果 DC表型检测结果为CD80+细胞占70.4％,CD86⁺细胞占72.0％,呈现成熟DC表型。MUC1致敏的DC疫苗与淋巴细胞混合培养显示,DC疫苗具有刺激T细胞增殖活化的作用,其中DC+CpG+MUC1组明显高于MUC1+DC或CpG+DC组,差异有统计学意义（P<0.01）。DC疫苗诱导产生的特异性CTL对肿瘤细胞的杀伤作用较单独T细胞组或DC组明显增强,差异有统计学意义（P<0.01）。并随着效靶比增大,其杀伤作用呈逐渐增强。结论 经CpG和MUC1致敏的DC疫苗在体外可诱导产生特异性抗肿瘤免疫效应。     

C57BL／6小鼠树突状细胞的培养及其诱导细胞毒性T淋巴细胞对FBL-3细胞杀伤效应的研究

目的探讨C57BL／6小鼠树突状细胞（DC）的培养及其诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对FBL-3细胞的杀伤效应。方法应用GM—CSF和114培养C57BL／6小鼠骨髓DC,用冻融法制备FBL-3细胞抗原致敏DC,用3H—TdR法检测T细胞增殖反应的能力,标准的4h51cr释放测定法检测CTL杀伤活性。结果用IL4和GM—CSF联合培养小鼠骨髓细胞3天后,可见细胞形态发生改变,细胞形态不规则。培养第6～8天,细胞表面出现较多毛刺样突起,拉长,为典型的DC特征。流式细胞仪检测DC表面分子有CD80、CD86、H-2Kd及I-Ad表达。FBL-3细胞冻融组和PBS组的DC在体外均可以诱导T细胞增殖,冻融组的DC体外诱导T细胞增殖能力明显高于PBS组。冻融组DC体外诱导的CTL对FBL-3细胞有明显的细胞毒作用。结论应用IL-4联合GM—CSF培养C57BL／6小鼠骨髓细胞,可大量扩增成熟DC,培养的DC符合其自身的特性;用冻融法制备FBL-3细胞抗原致敏DC,可以诱导T细胞细胞大量增殖,并能诱导出杀伤效应较强的CTL。     

老年COPD患者细胞免疫指标的观察

目的了解老年COPD患者T淋巴细胞功能的特点.方法所有患者均在入院3天内清晨空腹抽取外周静脉血检测T淋巴细胞功能,两组均以CD4^＋及CD8^＋T淋巴细胞绝对计数、CD4^＋/CD8^＋T比值为观察指标.结果观察组中CD4^＋淋巴细胞绝对计数和CD4^＋/CD8^＋T比值明显低于对照组（P＜0.05）,而两组中CD8^＋T淋巴细胞绝对计数没有显著性差异（P＞0.05）.结论提示老年COPD患者的细胞免疫功能受到抑制.     

树突状细胞介导的肝癌免疫治疗实验研究

目的探讨以树突状细胞（DC）为介导的原发性肝癌免疫治疗新方法。方法采用肝癌细胞制备肿瘤细胞性抗原冲击致敏体外培养的DC,体外混合淋巴细胞反应检测抗原致敏DC;刺激同基因T淋巴细胞增殖的能力,观察负载肿瘤抗原的DC;体内外诱导产生肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）及其抗肿瘤能力。结果经肝癌细胞抗原致敏的DC;能诱导较强的自体T细胞增殖,且诱导特异性CTL,该CTL对自体肝癌细胞具有很强的杀伤活性,杀伤率明显高于DC和未经肝癌细胞抗原致敏的DC;激活的CTL及T淋巴细胞的杀伤率,而对非同种肿瘤细胞无明显的杀伤作用,经BEL7402肿瘤细胞抗原致敏的DC;经皮下免疫小鼠可诱导有效的免疫保护作用,可抵抗野生型BEL7402细胞的再攻击,肿瘤生长受到明显抑制,瘤体出现延迟,生长减慢。结论DC具有强大的刺激T淋巴细胞增殖和诱导产生特异性CTL的能力,在体内外均能激发特异性抗肿瘤免疫应答。     

埃泼斯坦-巴尔病毒潜伏膜蛋白2A特异性细胞毒性T淋巴细胞的体外诱导研究

目的：利用含埃泼斯坦-巴尔病毒(Epstein—Barr virus，EBV)潜伏膜蛋白2A重组痘苗病毒(rVV—LMP2A)感染的人树突状细胞(DC)体外诱导EBV—LMP2A特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。方法：rVV—LMP2A感染的DC分别在培养第1、8天刺激相同MHC背景的人外周血单个核细胞(PBMC)，在IL-2作用下体外诱导EBV特异性CTL。培养第15天乳酸脱氢酶法检测CTL的特异性杀伤活性。结果：诱导的CTL对rVV—LMP2A感染的靶细胞在效靶比为5：1、10：1和15：1时，特异性杀伤率分别为63．5％、65．5％和67．9％。结论：rVV—LMP2A感染的DC刺激相同MHC背景的PBMC可诱导出较高杀伤活性的EBV特异性CTL。