BH3-only蛋白Noxa在依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡中的作用

［摘要］目的检测Bcl-2家族BH3-only蛋白Noxa在依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡中的作用,为临床治疗以及发现新的治疗靶点寻找理论依据。方法噻唑蓝（MTT）法检测依托泊苷处理后细胞存活率;流式细胞仪Annexin Ⅴ单染法检测依托泊苷诱导的细胞凋亡率;流式细胞仪检测广谱caspase抑制药Z VAD fmk对依托泊苷诱导细胞凋亡的抑制率;半定量逆转录 聚合酶链反应（RT PCR）和Western blot分别检测在依托泊苷诱导前后p53、Noxa的mRNA和蛋白的表达水平。结果依托泊苷以剂量、时间依赖的方式诱导胃腺癌细胞凋亡,SGC 7901细胞系比BGC 823更加敏感。广谱caspase抑制药Z VAD fmk能有效抑制依托泊苷诱导的胃腺癌细胞凋亡,抑制率＞50%。在SGC 7901细胞系中依托泊苷作用4 h后就可以观察到p53和其转录目标Noxa的mRNA很快上调,8 h可观察到其蛋白质含量明显增高;而在BGC 823细胞系中依托泊苷作用前后p53和Noxa的mRNA和蛋白质水平变化不大。结论依托泊苷能诱导胃腺癌细胞发生caspase介导的凋亡;依托泊苷主要通过激活p53和其随后转录激活BH3 only蛋白Noxa来诱导胃腺癌细胞凋亡。     

促凋亡基因PUMA的研究进展及其与肿瘤的关系

PUMA(p53 upregulated modulator of apoptosis,p53上调凋亡调控因子)属于Bcl-2家族中的BH3仅有蛋白,可在包括基因毒性应激、癌基因无受控表达、毒素、氧化还原状态改变、感染及生长因子/细胞因子减少等多种应激诱发的细胞依赖p53及非依赖p53机制凋亡中起关键调节作用。PUMA主要机制是将各种凋亡信号传导给胞体内线粒体,线粒体经过各种过程间接作用于Bcl-2家族成员中的Bax和(或)Bak抑制凋亡作用,阻断抑制凋亡家族因子的抗凋亡作用。PUMA直接与所有已知的抗凋亡Bcl-2家族结合并对抗其阻断的线粒体功能障碍和caspase的激活,将细胞推向凋亡程序。PUMA基因的敲除或抑制会导致凋亡抑制,从而潜在的增加了癌症的危险性和治疗的对抗性。PUMA表达的上调可增加癌细胞对放化疗的敏感性,而抑制PUMA的表达可能会遏制组织损伤和退行性疾病细胞的过度死亡,因此PUMA是细胞死亡刺激的总体感应器,为肿瘤和组织损伤治疗提供了有重要意义的药物靶点方向。     

硼酸钠活化p53诱导人肝癌细胞HepG2凋亡

目的观察硼酸钠(Borax)对人肝癌细胞株Hep G2的生长抑制和诱导凋亡的作用,并初步探讨其作用机制。方法采用MTT法检测不同浓度硼酸钠对Hep G2活力的影响,DAPI染色荧光显微镜及Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术检测硼酸钠诱导细胞凋亡的情况。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测硼酸钠对肿瘤抑制因子p53及其下游基因Bcl-2、Bax、Noxa、Puma mRNA表达的影响。结果与对照组比较,硼酸钠各剂量组均能抑制Hep G2的活力(P<0.01);硼酸钠诱导Hep G2细胞凋亡,不同浓度硼酸钠(0、1.0、2.0、4.0 mmol/L)处理24 h后,晚期凋亡细胞百分比从2.57%分别增加至8.13%、10.4%、15.24%,差异有统计学意义(P<0.01);硼酸钠(4.0 mmol/L)分别作用6、12、24 h后,均可不同程度上调肿瘤抑制因子p53及促凋亡基因Bax、Noxa、Puma mRNA表达,抑制抗凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达,差异有统计学意义(P<0.01)。结论硼酸钠抑制人肝癌细胞Hep G2的生长活性并诱导凋亡,其机制与p53的活化及其下游Bax、Noxa、Puma基因表达上调,以及Bcl-2表达下调有关。     

力达霉素经线粒体依赖通路介导细胞凋亡

力达霉素(lidamycin，LDM)是具有我国自主知识产权的烯二炔类抗生素，具有较强的抗肿瘤活性，其抗肿瘤机制有待深入阐明。本研究主要利用人肝癌BEL-7402和乳腺癌MCF-7细胞研究了力达霉素对线粒体凋亡通路相关因子的影响。通过MTT法检测不同剂量力达霉素对肿瘤细胞增殖毒性；蛋白印迹技术检测线粒体和细胞质细胞色素c、总Bax，Bcl-2及p53表达；RT-PCR检测p53和bax mRNA表达等。结果发现，LDM能迅速激活肿瘤细胞线粒体凋亡通路，在2 h内就引起线粒体中细胞色素c释放至细胞质中。同时Bcl-2家族成员中促凋亡成员Bax持续增加，而抗凋亡成员Bcl-2先增加后减少。p53蛋白在6 h显著增加。Bax蛋白表达升高与其mRNA转录水平升高有关，p53蛋白表达升高与转录后水平有关。 Caspase抑制剂可以部分抑制LDM的增殖毒性。因此LDM可以通过激活细胞色素c启动的线粒体凋亡通路发挥抗肿瘤作用。     

凋亡调节蛋白在手术切除的原发性非小细胞肺癌中的表达

目的 检测凋亡调节蛋白抑癌基因p53和Bcl-2家族在非小细胞肺癌(NSCLC)标本中的相关性和预后意义。方法 采用免疫组化法用特异性针对人体的p53和Bcl-2家族的抗体检测这些凋亡调节基因在50例存档的、手术彻底切除的NSCLC患者标本中的表达情况。分析它们之间的相互关系，并追踪患者的生存情况，分析其表达的预后意义。结果 (1)31例(62％)的NSCLC表达抑癌基因p53，典型的p53染色免疫阳性是细胞核染色。典型的Bcl-2家族蛋白呈胞浆染色．少数也可以呈胞核染色阳性。(2)p53的表达与患者的吸烟史呈正相关(P＜0．05)，p53与Bcl-2的表达呈显著的正相关(P＜0．05)，p53与Bax的表达之间呈显著的负相关(P＜0．05)。(3)p53的表达阴性的肿瘤患者没有发生远处转移，p53的表达与远处转移的发生呈正相关(P＜0．05)。Bcl-2的表达与原发性NSCLC手术切除患者的生存时间(P＜0．05)呈负相关。结论 抑癌基因p53和Bcl-2家族蛋白在NSCLCK中的表达等都很常见。p53突变可能使Bcl-2表达增加，Bax表达减少而增加远处转移的风险。     

作用于Bcl-2家族抗凋亡亚族蛋白的小分子抑制剂的研究进展

细胞的凋亡是维持机体平衡的重要因素。细胞凋亡由一系列细胞因子调控。Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡的关键性调节因子。Bcl-2家族分为抗凋亡和促凋亡两个亚族，他们的相互作用对细胞凋亡信号传导起调控作用。很多肿瘤细胞高表达Bcl-2抗凋亡亚族成员Bcl-2/Bcl-xL。近年来，随着Bcl-2家族各成员的晶体结构相继阐明，人们开始寻找作用于Bcl-2家族抗凋亡亚族蛋白的小分子抑制剂。本文从药物设计角度对该方面的进展作一综述。     

p53凋亡刺激蛋白——一个新的肿瘤抑制家族的研究进展

p53凋亡刺激蛋白家族(Apoptosis-stimulating of p53 protein,ASPP)是近年来新发现的蛋白家族,包括3个成员:ASPP1、ASPP2和iASPP。ASPP蛋白在C端具有保守的锚蛋白重复序列、SH3结构域和脯氨酸富集区。ASPP是首个被发现的能调节p53家族所有成员转录活性的蛋白家族。ASPP1和ASPP2可以特异性增强p53诱导促凋亡基因表达的能力,而iASPP会抑制p53的转录活性,对多种癌细胞的研究发现,AS-PP的异常表达与癌细胞抗肿瘤药物耐受性有关。此外,ASPP在细胞极性、器官形成和IGF信号通路中也起着重要作用。该文结合最新研究进展,对ASPP家族蛋白的结构和功能作一综述。     

九节龙皂苷对小鼠胰腺癌p53、Bcl-2和Bax表达的影响

目的通过观察九节龙皂苷在胰腺癌发病不同阶段中对凋亡调控基因的影响,初步探讨九节龙皂苷防治肿瘤作用可能存在的分子机制。方法利用二甲基苯并蒽诱发的实验性胰腺癌小鼠模型,采用免疫组化染色的方法,分别标记p53、Bcl-2和Bax阳性细胞,分阶段动态观察九节龙皂苷对各种蛋白表达的影响。结果实验开始,预防组、治疗组的p53阳性率与对照组差别就均有统计学意义(P均<0.01);随实验观察时间延长,p53表达达到高峰,Bax则呈逐渐升高趋势,而Bcl-2和Bcl-2/Bax比值分别在第2和第3阶段达到峰值后呈下降趋势。至实验结束时,预防组p53、Bcl-2以及Bcl-2/Bax比值均低于对照组(除p53外,P均<0.05),而治疗组与对照组仅Bax差别具有统计学意义(P<0.01)。结论九节龙皂苷可能通过抑制突变型p53和Bcl-2的表达,诱导细胞凋亡,从而抑制胰腺癌瘤形成和发展。     

肺鳞癌组织中MMP-2,p53,Bcl-2的表达

目的探讨肺鳞癌中MMP-2,p53和Bcl-2的表达及相互关系。方法应用免疫组化法(SP法)检测50例肺鳞癌患者术后的石蜡包埋标本中MMP-2、p53和Bcl-2的表达情况。结果MMP-2在肺鳞癌组织中阳性率76.0%,p53阳性率57.41%,Bcl-2阳性率44.44%,MMP-2的表达与肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移明显相关,而与肿瘤部位、患者年龄无关。MMP-2过度表达与p53基因的突变有关。P53和Bcl-2之间则呈显著负相关(P<0.005)。结论MMP-2的表达与肺鳞癌的侵袭转移性有关。p53基因突变后MMP-2表达增强。Bcl-2与p53在细胞凋亡调控中是相互作用。     

凋亡抑制蛋白survivin在食管鳞癌中的表达及其与p53、Bcl-2相关性研究

目的：探讨survivin的表达在食管鳞癌（ESC）发生、发展中的作用及其与p53、Bcl-2蛋白表达的相互关系。方法：应用免疫组织化学SP法，检测survivin、p53和Bcl-2蛋白在50例ESC组织和20例癌旁正常食管组织中的表达。结果：50例ESC组织中survivin表达阳性率为80．0％，其表达与癌组织浸润深度和淋巴结转移有关（P〈0．05），而与癌组织分化程度无关（P〉0．05）。而20例癌旁正常食管组织中survivin低表达，阳性率为5．0％（P〈0．01）。癌组织中p53和Bcl-2蛋白表达与survivin显著相关（P〈0．05）。结论：survivin在食管癌组织中异常表达，有望成为食管癌基因治疗的新靶点；抑癌基因p53的失活和凋亡相关基因Bcl-2的表达上调与survivin基因的表达可能在食管癌癌变中起协调作用。     

葛根素对人骨肿瘤细胞株 MG63 的增殖抑制和诱导凋亡作用

目的 探讨葛根素对人骨肉瘤细胞株MG63的作用及其机制。方法 取对数生长期的MG63细胞分别用不同浓度的葛根素处理(0,25,50,100 mmol·L^-1)。细胞培养48 h后,利用MTT检测MG63细胞增殖水平;流式细胞术检测细胞凋亡水平,RT-PCR检测PI3K、AKT、Bax、Bcl-2、p53 和 p21 mRNA水平。Western blotting 检测PI3K、AKT、Bax、 Bcl-2、p53和p21表达水平。结果 葛根素浓度依赖性的诱导MG63细胞增殖抑制、凋亡和 Bax 表达,减少PI3K、AKT、Bcl-2、p53和p21表达。结论 葛根素可通过抑制PI3K/AKT/p53信号通路而诱导MG63细胞增殖抑制和凋亡。     

去卵巢大鼠脑内凋亡基因蛋白表达及半枝莲黄酮的干预作用

目的:探讨去卵巢大鼠脑内凋亡基因Bcl-2,Bax和p53的蛋白表达及半枝莲黄酮（Scutellaria barbata flavonoid, SBF）的干预作用。方法:摘除3月龄雌性Sprague-dawley(SD)大鼠卵巢10个月,模拟老年性痴呆（Alzheimer’s disease,AD）模型,采用免疫组化法检测脑内凋亡基因Bcl-2,Bax和p53的蛋白表达,评价SBF对摘除卵巢诱导大鼠神经细胞凋亡的抑制作用。结果:摘除大鼠双侧卵巢可使大脑皮质中Bcl-2,Bax和p53的表达异常改变,Bcl-2阳性表达神经元数量明显减少,Bax和p53阳性表达神经元数量明显增多。去卵巢大鼠连续36 d灌胃（ig）SBF 17.5,35和70 mg?kg-1可不同程度地改善去卵巢大鼠大脑皮层凋亡基因的异常表达。结论:摘除大鼠卵巢10个月可以诱导神经细胞凋亡,SBF对神经细胞凋亡有对抗作用,提示SBF可能有利于对AD的治疗。     

Bcl-2抑制剂BH3模拟物在血液系统恶性肿瘤治疗中的研究进展

细胞凋亡异常是血液系统恶性肿瘤发生的主要机制之一,而Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡调节中起着关键作用,因此靶向Bcl-2家族蛋白药物的研发已成为当前药物开发领域的一大热点。其中BH3模拟物是一类靶向作用于Bcl-2家族蛋白的新型抗肿瘤药物,该类药物可以模拟BH3-only蛋白的BH3结构域与Bcl-2家族蛋白成员相互作用,置换并释放促凋亡蛋白,诱导细胞凋亡,从而实现抗肿瘤作用。近年来研究显示BH3模拟物如ABT-263和ABT-199等在多种血液系统肿瘤中已显示出良好的应用前景,ABT-199单药或与其他药物联用治疗均能提高治疗效果,延长患者的生存时间。     

α干扰素增强顺铂诱导的骨肉瘤细胞凋亡

目的探讨α干扰素对顺铂诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用及其机制。方法使用α干扰素和顺铂单独或联合处理骨肉瘤U2OS(p53正常)和MG63细胞(p53突变),通过MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测凋亡,Hochest 33258荧光染色检测凋亡形态学变化,RT-PCR检测p53的mRNA表达,Western blot法检测p53、p21、Mdm2、Bax、Bcl-2和PARP蛋白水平的表达。结果药物处理72 h,α干扰素单独对U2OS和MG63细胞的生长无影响,但在U2OS而非MG63细胞中增强顺铂引起的生长抑制和凋亡,并增强凋亡形态学改变和PARP裂解。α干扰素+顺铂可增强p53和Bax的表达,减弱Bcl-2的表达,对p21的表达无影响,α干扰素没有增强顺铂引起的p53的mRNA表达。结论α干扰素通过p53通路在骨肉瘤U2OS细胞中增强顺铂诱导的生长抑制和凋亡。     

黄苔胃病患者胃黏膜凋亡基因及相关蛋白的表达

为探讨胃病患者黄苔与胃黏膜组织细胞凋亡之间的关系，选取黄苔胃病患者62例，并与63例白苔胃病患者进行对照，检测胃黏膜PCNA、p53、Bcl-2、Fas凋亡基因相关蛋白。结果表明，黄苔患者p53、Fas表达明显高于白苔患者，而PCNA、Bcl-2表达则与白苔患者无明显差异。结论：黄苔胃病患者伴有促凋亡基因相关蛋白的过度表达，黄苔是胃内有活动性炎症的较灵敏的指标。     

雷帕霉素对肝癌化疗的增敏作用及相关机制研究

目的探讨雷帕霉素(rapamycin)对阿霉素(DOX)治疗肝癌效果的影响以及相关机制。方法 DOX单独或与rapamycin联合处理HepG2、Hep3B 2种肝癌细胞48 h,用MTT法测定细胞的增殖情况;DOX、rapamycin以及两者联合处理HepG2、Hep3B细胞24 h,以流式细胞术检测细胞凋亡率,用Western blot法检测PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白(p-Akt、p-mTOR、p21和p53)的表达。结果 DOX能浓度依赖性抑制HepG2和Hep3B细胞的增殖,且对HepG2细胞的抑制作用明显强于Hep3B细胞;与单用DOX比较,DOX与rapamycin联用对2种细胞增殖的抑制作用明显增加,且增加Hep3B细胞对DOX敏感性的作用尤为显著。DOX作用HepG2和Hep3B细胞24 h,可诱导2种细胞发生不同程度的凋亡,rapamycin单独作用的促凋亡作用不明显,但与DOX联用后能明显增加DOX的促凋亡作用,2种细胞的凋亡率均明显增加。Western blot结果显示,rapamycin能明显上调p-Akt、p21和下调p-mTOR在2种细胞的表达水平,轻度上调p53在HepG2中的表达;DOX能轻度上调p-Akt、p21和下调p-mTOR在2种细胞的表达水平,明显上调p53在HepG2中的表达,Hep3B中无p53表达;两药合用对上述蛋白表达的影响有协同作用。结论 rapamycin能增加DOX对不同p53状态肝癌细胞的增殖抑制和促凋亡作用及肝癌对DOX化疗的敏感性,其机制可能与rapamycin激活凋亡的p53和不依赖p53的p21途径有关。     

凋亡基因蛋白Bcl-2、Bax,p53在子宫内膜异位症组织中的表达及相关研究

目的探讨凋亡调节基因Bcl-2、Bax、p53在子宫内膜异位症发生、发展中的作用。方法免疫组织化学SP法检测子宫内膜异位症患者60例盆腔异位内膜及在位内膜和40例正常子宫内膜组织中Bcl-2、Bax、p53的表达。结果 Bcl-2在异位内膜组表达强于在位内膜及对照组,差异有统计学意义(P值均<0.05),Bax在异位内膜组的染色强度低于在位内膜组和对照组,差异有统计学意义(P值均<0.05);p53在正常子宫内膜及子宫内膜异位症患者在位内膜中均呈阴性表达,在子宫内膜异位症患者异位内膜中的阳性表达率为20%,表达水平显著高于正常子宫内膜及在子宫内膜,差异有统计学意义(P<0.05)。结论凋亡调节基因Bcl-2、Bax、p53在子宫内膜异位症发生、发展中发挥重要作用。     

扇贝多肽对抗UVB辐照所致小鼠胸腺淋巴细胞凋亡的研究

目的研究扇贝多肽(PCF)对中波紫外线(UVB)辐照损伤小鼠胸腺淋巴细胞的保护作用。方法以UVB辐照制备损伤模型,预先给予PCF,应用透视电镜观察细胞超微结构的变化;免疫细胞化学检测细胞p53,Bcl-2,Bax基因蛋白的表达;原位杂交检测细胞P38mRNA的基因表达。结果UVB辐照引起小鼠胸腺淋巴细胞凋亡,PCF能明显减轻UVB辐射损伤引起的细胞超微结构改变。PCF还能抑制突变型p53蛋白和促凋亡蛋白Bax的表达,增强凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达以及抑制P38 mRNA基因的表达。结论PCF对UVB辐照的体外小鼠胸腺淋巴细胞具有明显的保护作用。     

牡荆素对人肝细胞癌SMMC-7721细胞的增殖抑制作用及其机制的影响

目的: 研究牡荆素(vitexin)对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制作用, 并初步探讨其作用机制。方法: 体外培养人肝癌细胞SMMC-7721, 分别采用MTT法和Hoechst33258核染色法检测牡荆素对人肝癌细胞SMMC-7721活力的影响以及观察细胞形态学变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率和线粒体膜电位(ΔΨm) 变化;蛋白免疫印迹法检测p53、Bcl-2、Bax等相关凋亡蛋白水平的表达情况。结果: 牡荆素培养人肝癌细胞SMMC-7721 48, 72, 96 h后能明显抑制细胞增殖, 呈时间-剂量依赖性(P<0.05), 其IC₅₀分别是150.37, 116.24, 90.19 μmol·L^-1。牡荆素作用于人肝癌细胞SMMC-7721 72 h后, 以浓度依赖性方式增加细胞凋亡率、降低线粒体膜电位(ΔΨm) 以及上调p53、Bax、Caspase-3等相关促凋亡蛋白的表达, 下调Bcl-2抗凋亡蛋白的表达。结论: 牡荆素能抑制人肝癌细胞SMMC-7721增殖诱导凋亡, 呈时间-剂量依赖性, 其作用机制可能通过依赖P53途径下调Bcl-2, 上调Casepase-3、Bax、P53、PARP等基因表达, 进而诱导凋亡有关。     

葛根素抑制人子宫颈癌细胞株HeLa细胞增殖研究

目的 探讨葛根素(puerarin)对人子宫颈癌细胞株HeLa的增殖抑制和凋亡诱导作用,并探讨其机制.方法 MTT法检测不同浓度葛根素(0,12.5,25,50)处理48 h对HeLa细胞增殖的影响;流式细胞术检测葛根素对HeLa细胞凋亡的影响.Western blotting 检测葛根素对HeLa细胞Wnt,β-catenin ,Bax,Bcl-2,p53和p21表达水平影响.结果 葛根素对 HeLa细胞增殖有明显的抑制作用,呈明显的剂量-效应依赖性;葛根素明显促进HeLa细胞凋亡;Western blotting检测显示,经葛根素处理72 h后,Wnt,β-catenin ,Bcl-2,p53和p21表达明显下降,呈浓度依赖性.结论 葛根素可诱导HeLa细胞增殖抑制和凋亡, 其作用机制与抑制Wnt/β-catenin 信号通路相关.