Tim-3在单核细胞增生李斯特菌脑膜炎小鼠中的作用研究

目的 构建李斯特菌脑膜炎小鼠模型,以评价T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域分子3(Tim-3)在李斯特菌脑膜炎小鼠中的可能作用.方法 体内实验通过延髓池注射李斯特菌的方法构建半数致死量的李斯特菌脑膜炎小鼠模型,应用Tim-3敲除(knock out,KO)模式小鼠和Tim-3抗体评价Tim-3对李斯特菌脑膜炎的作用.体外实...     

COX-2抑制剂塞来昔布对诱导性肝癌Bax、Bcl-2表达影响的实验研究

目的探讨选择性COX-2抑制剂—塞来昔布对诱导性肝癌细胞凋亡基因Bax、Bcl-2表达的影响及其可能的机制。方法将25只雄性Wister大鼠随机分为对照组(n=5)、模型组(n=10)和塞来昔布组(n=10)。模型组和塞来昔布组大鼠均每周一次腹腔注射二乙基亚硝胺,同时塞来昔布组每天给与塞来昔布溶液灌胃,模型组每天给与相同体积的生理盐水灌胃,对照组不做任何处理。20周后行MRI扫描后处死大鼠,取大鼠肝组织行HE染色、免疫组化检测和Western blot检测。结果1)模型组大鼠存活率为40%(4/10),塞来昔布组大鼠存活率为70%(7/10);2)MRI平扫显示模型组肝脏肿瘤直径为(1.064±0.441)cm,塞来昔布组大鼠肝脏肿瘤直径为(0.415±0.154)cm(P<0.05),另有3只为重度肝硬化;3)免疫组化结果显示,正常组大鼠肝组织中COX-2、Bcl-2阳性细胞数(48.352±25.300)个/mm^2、(314.286±78.323)个/mm^2明显少于模型组(970.696±138.246)个/mm^2、(953.686±69.910)个/mm^2,而Bax阳性细胞数则降低(956.040±61.381)个/mm^2 VS(681.319±50.600)。应用塞来昔布后,COX-2、Bcl-2阳性细胞数明显降低(513.736±127.309)个/mm^2、(703.300±56.033)个/mm^2,Bax阳性细胞数则升高(767.399±53.120)个/mm^2,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果表明,正常组大鼠肝组织中COX-2、Bcl-2蛋白相对表达量(0.089±0.042)、(0.181±0.043)明显低于模型组(0.663±0.102)、(0.617±0.069),而Bax蛋白相对表达量则降低(0.768±0.180)VS(0.328±0.034)。应用塞来昔布后,COX-2、Bcl-2蛋白相对表达量明显降低(0.333±0.120)、(0.411±0.075),而Bax蛋白相对表达量明显升高(0.428±0.027),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论塞来昔布可以通过降低Bcl-2的蛋白表达,增加Bax的蛋白表达抑制肝癌的生成和促进HCC细胞的凋亡。     

Nrf2调控自噬对于宫颈癌发生发展的作用及机制研究

目的研究宫颈癌组织中核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)及细胞自噬人蛋白的表达情况,探讨Nrf2调控自噬对宫颈癌发生发展的作用机制。方法收集2018年1月－12月在新疆医科大学第一附属医院妇产科就诊的50例宫颈癌标本及癌旁组织,免疫组化检测组织标本中Beclin1、LC3、p62、Nrf2的表达情况;在宫颈癌SiHa细胞株内分别转染Nrf2 siRNA及p62 siRNA后,Western Blot检测Nrf2、p62、Bcl2、Bax蛋白表达情况,MTT检测细胞增殖情况。结果免疫组化结果显示Beclin1、LC3在宫颈癌组织内显著低表达,分别为18.0%（9/50）和20.0%（10/50）,而p62和Nrf2在宫颈癌组织内显著高表达,分别为78.0%（39/50）和86.0%（43/50）,差异有统计学意义（P<0.05）。分别在宫颈癌SiHa细胞株内转染Nrf2 siRNA及p62 siRNA后,细胞内Nrf2与p62表达呈正相关,且均能显著促进细胞凋亡,差异有统计学意义（P<0.05）。细胞增殖在Nrf2 siRNA和p62 siRNA组显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）。结论宫颈癌细胞内,Nrf2与p62存在环形正向调控作用,且抑制Nrf2和p62的表达后可以显著促进细胞凋亡,抑制细胞增殖。     

选择性COX-2抑制剂celecoxib对子宫肌瘤细胞的增殖抑制及其分子机制

目的探讨环氧合酶-2（COX-2）选择性抑制剂塞来昔布（celecoxib）对子宫肌瘤细胞的增殖抑制作用和分子机制。方法给予原代培养的子宫肌瘤细胞不同浓度的celecoxib处理,MTT法测定细胞生长抑制率;半定量RT-PCR法检测子宫肌瘤细胞Wnt信号通路的关键基因Wnt5b、β-catenin、c-myc的表达及塞来昔布对子宫肌瘤细胞增殖活化的影响。结果塞来昔布可显著抑制体外培养的人子宫肌瘤细胞增殖,随着药物剂量的增加和时间的延长,子宫肌瘤细胞的增殖和活化明显抑制,呈剂量和时间依赖性,而这种作用是通过抑制Wnt信号通路实现的。结论子宫肌瘤细胞中存在Wnt信号通路且celecoxib在体外能抑制此通路活化,从而抑制肌瘤细胞的增殖。     

紫草素抑制ERK1/2-NF-κB通路对大鼠心房颤动的改善作用

目的 探讨紫草素通过细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)/核转录因子-κB(NF-κB)介导心肌细胞纤维化对大鼠心房颤动(简称房颤)的改善作用.方法 30只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、紫草素组,每组10只.紫草素组大鼠以4 mg/kg紫草素灌胃给药,正常对照组和模型组大鼠等量生理盐水灌胃,1次/d,连续...     

MEBT/MEBO对慢性难愈合创面组织内Nrf2 / HO-1 / NQO1 信号通路的影响

【摘要】 目的 探讨皮肤再生医疗技术 (MEBT/ MEBO) 对大鼠慢性难愈合创面组织内核转录因子红系 2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶1(HO-1)/ 醌氧化还原酶1(NQO1)信号通路的影响。 方法 选取90只SPF级 Wistar雄性大鼠适应性饲养1周后,采用随机数表法将其随机分为空白组、对照组、模型组、MEBO 组和贝复新组,每组18只。 其中空白组大鼠只做备皮处理, 对照组大鼠建立急性创面模型, 模型组、MEBO组和贝复新组大鼠建立慢性难愈合创面模型。模型建立后,空白组大鼠备皮处皮肤及对照组、模型组大鼠创面予以生理盐水纱布换药处理, MEBO组大鼠创面予以湿润烧伤膏(MEBO)药纱换药处理,贝复新组大鼠创面予以重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶药纱换药处理, 对比观察各组大鼠创面愈合率、组织病理学变化情况以及皮肤/ 创面组织内丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白与 HO-1、NQO1 mRNA 表达水平。结果 干预第 3 天, 各组大鼠创面愈合率尤以对照组最高、贝复新组次之 (P均＜0.05); 干预第 7、14 天, 各组大鼠创面愈合率尤以 MEBO 组最高、贝复新组次之 (P均＜0.05)。 HE 染色结果显示, 干预第 3、7、14 天,对照组、MEBO 组和贝复新组大鼠创面组织内坏死细胞及炎性细胞逐渐减少, 成纤维细胞与毛细血管逐渐增多,而模型组大鼠创面组织内坏死细胞和炎性细胞减少不明显; Masson 染色结果显示, 干预第 3、7、14 天, 对照组?MEBO 组和贝复新组大鼠创面组织内胶原纤维由细少且紊乱逐渐趋于粗大且平整, 而模型组大鼠创面组织内胶原纤维虽逐渐增粗、增多, 但排列仍较紊乱。 干预第 7 天, 对照组、MEBO 组和贝复新组大鼠创面组织内 MDA 表达水平均明显低于模型组 (P均＜0.05); 干预第 3、7 天, 对照组、MEBO 组和贝复新组大鼠创面组织内 SOD 表达水平均明显高于模型组 (P均＜0.05)。 干预第 3、7 天, MEBO 组和贝复新组大鼠创面组织内 Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白以及 HO-1、NQO1 mRNA 表达水平均明显高于空白组、对照组和模型组 (P均＜0.05), 且干预第 7天, MEBO 组大鼠创面组织内 Nrf2、HO-1 蛋白以及 HO-1 mRNA 表达水平均明显低于贝复新组 (P均＜0.05)。结论 MEBT/ MEBO 可能能够通过激活 Nrf2 / HO-1 / NQO1 信号通路减轻大鼠慢性难愈合创面氧化应激损伤, 促进创面再生修复。     

Sirt3介导的SOD2在电离辐射中的作用研究

目的 观察293T细胞经不同剂量¹³⁷Cs γ射线照射后,细胞中沉默信息调节因子3（sirt3）及相关抗氧化因子的变化,研究sirt3基因在辐射防护中的抗氧化活性机理。方法 采用¹³⁷Cs对293T细胞分别进行2、4、8 和16 Gy照射,采用Real-Time PCR的方法,检测照后6、12、24和48 h,细胞中sirt3和超氧化物歧化酶2（SOD2）mRNA的表达水平变化;采用免疫印迹法,检测细胞中sirt3和SOD2蛋白水平随时间的变化;采用siRNA干扰和抑制剂处理的方法,检测sirt3与SOD2的作用关系;采用SOD Assay Kit-WST试剂盒检测细胞中SOD2酶活力的变化;流式细胞术检测细胞中活性氧（ROS）随时间的变化。结果 各组细胞中sirt3和SOD2的mRNA水平和蛋白质水平均表现出不同程度的上升,与0 Gy组比较,分别在12 h（t=6.75、13.59、6.59、10.13,P<0.05）和24 h（t=6.80、8.73、11.09,P<0.05）达到最大值;sirt3 siRNA干扰和抑制剂处理结果显示sirt3是SOD2的上游调控因子;照射24 h后细胞中SOD2的活性显著增加,与0 Gy组比较,差异有统计学意义（t=46.04、23.19、26.28、14.70,P<0.05）,细胞中ROS水平也发生相应变化。结论 sirt3可能通过对细胞中SOD2的表达量及活性的调控加强抗氧化保护系统,为临床辐射防护和治疗提供实验依据。     

甲状腺素通过ERK1/2通路促进整合素αvβ3阳性分化型甲状腺癌进展的研究

目的探讨甲状腺素(T4)能否通过整合素αvβ3影响分化型甲状腺癌(DTC)细胞增殖、转移潜能及其分子机制。方法体外培养甲状腺乳头状癌TPC-1、K1及甲状腺滤泡状癌(FTC)133细胞株, 采用免疫荧光和流式细胞术分析细胞表面整合素αvβ3的表达水平。给予T4、四碘甲状腺乙酸(Tetrac)、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)多肽单独或联合处理DTC细胞后, 应用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法及Transwell小室迁移和侵袭实验检测细胞增殖和转移潜能的变化。通过小干扰RNA(siRNA)转染模型验证整合素αv或β3亚基沉默能否逆转T4对DTC细胞的作用。利用Western blot法检测下游信号蛋白磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)1/2、总细胞外信号调节激酶(ERK)1/2的表达水平。应用丝裂原活化蛋白激酶的激酶(MEK)1/2的抑制剂GSK1120212阻断ERK1/2磷酸化, 检测其对T4处理细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。多组间比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用Tukey法。结果 TPC-1、K1和FTC133细胞整合素αvβ3表达均呈阳性, 相对平均荧光强度...     

Tim-3抗体的生物学活性及应用研究

目的：制备抗人Tim-3单抗并评价其生物学活性,为干预Tim-3表达失调引发的疾病提供实验基础。方法制备重组人Tim-3蛋白,常规方法免疫BALB/c小鼠,筛选出阳性克隆,并对其识别、中和活性进行体内外验证,探讨其作为免疫干预手段的可行性。结果①获得一株能够分泌具有较好结合活性的抗人Tim-3单克隆抗体细胞株（克隆号L3D）,其分泌的免疫球蛋白亚型为IgG2a;②流式实验结果表明,该抗体能够结合人U937细胞上的Tim-3分子,且与小鼠RAW 264．7细胞上Tim-3有一定的交叉结合活性;③该抗体能够阻断Gal-9分子诱导的人THP1细胞凋亡,具有良好的体外中和活性;④体内注射L3D,显示该抗体能够显著加重脓毒血症模型小鼠病情,提高炎性因子的表达水平,显示出其良好的体内中和活性。结论成功制备一株分泌抗人Tim-3抗体的细胞株,其良好的结合及中和活性为基于Tim-3表达异常相关疾病的干预提供了实验基础。     

Tim-3对巨噬细胞功能的调节作用研究

目的探讨Tim-3对巨噬细胞功能的调节作用及其机制。方法通过RNA干扰降低Tim-3在巨噬细胞表面的表达,构建一种稳定低表达Tim-3的RAW264.7巨噬细胞系;以野生型及低表达Tim-3的巨噬细胞为研究对象,探讨Tim-3对巨噬细胞活性及表型的影响。结果将含Tim-3 siRNA及NC对照序列的载体经脂质体分别转染细胞系RAW264.7,以G418加压筛选,获得低表达Tim-3的巨噬细胞稳定株。功能实验显示,激活Tim-3通路促进了巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6。同时发现Tim-3通路可以影响CD80/CD86共刺激分子在巨噬细胞表面的表达,并进而影响巨噬细胞的抗原呈递功能,促进Th1、Th17细胞的极化。结论成功构建了重组载体Tim3 siRNA,建立了稳定低表达Tim-3的巨噬细胞系,初步研究结果提示Tim-3信号通路在促进TNF-α、IL-6分泌及调节巨噬细胞共刺激分子表达,促进Th1、Th17细胞分化中发挥重要作用。     

Role of Nrf2-antioxidant in radioprotection by root extract of Inula racemosa

Abstract

Purpose: Inula racemosa, a Trans-Himalayan plant is an important medicinal herb. In this study, the radio-modulatory efficacy of aqueous root extract of I. racemosa was investigated.

Materials and methods: Normal Kidney Epithelium cells were treated with extract (50–200?μg/ml) and exposed to 3?Gy of γ-radiation, while C57BL/6 mice were administered with extract (300–600?mg/kg BW) intraperitoneally prior to exposure to 7.5?Gy of γ-radiation to assess radiation modulatory efficacy.

Results: The administration of extract (30?min and 1?h) prior to radiation exposure improved the survival of NKE cells (as measured by proliferation), restored MMP and ROS levels as compared to radiation-exposed alone cells. These cells showed up-regulated Nrf2 protein levels at 7?h and increased expression of HO-1 and NOQ1 protein at 24?h In mice, the 30 days whole body survival study demonstrated that extract pre-treatment increases survival or delays the onset of radiation-induced mortality as against 70% mortality of 7.5?Gy of γ-radiation.

Conclusions: The aqueous extract of roots of I. racemosa enhanced the survival of irradiated NKE cells and rescued C57BL/6 mice against WBI-induced mortality. The radiation modulation efficacy was mediated through cumulative activation of HO-1 and NQO1 downstream of Nrf2 translocation in NKE cells.

Abbreviations:

ARE: Antioxidant Response Element; FITC: Fluorescein isothiocyanate; GCS: Glutamylcysteine synthase; HO-1: Heme oxygenase-1; LPS: Lipopolysacharide; MRP: Multidrug Resistance-Associated Proteins; NQO1: NAD(P)H Quinone Dehydrogenase 1; NRH: Quinone Oxidoreductase 2 (NQO2); PBS: Phosphate Buffer Saline; PKA: Protein Kinase A; PKC: Protein Kinase C; PI3-kinase: Phosphatidylinositol 3-Kinase; SRB: Sulforhodamine B; UV: Ultra-Violet radiation     

PI3KAktCOX-2途径在人宫颈癌HeLa细胞放射抗拒中的作用

目的 探讨PI3K/Akt/COX-2途径在人宫颈癌HeLa细胞放射抗拒中作用的分子机制。 方法 COX-2抑制剂塞来昔布单独及联合PI3K抑制剂LY294002作用HeLa细胞24 h,X射线不同剂量照射,利用克隆形成法计算细胞存活率,单击多靶模型拟合细胞存活曲线,计算D_q、D₀、SF₂值和放射增敏比(SER);应用Western blot方法检测Akt、磷酸化Akt、COX-2、Bad和磷酸化Bad蛋白的表达;应用RT-PCR检测COX-2和Bad mRNA的表达。结果 塞来昔布单独及联合LY294002作用HeLa细胞组D_q、D₀、SF₂明显低于单纯照射组;X射线照射后,能够活化HeLa细胞PI3K/Akt/COX-2途径,塞来昔布能够多靶点抑制PI3K/Akt/COX-2途径的活化。结论 PI3K/Akt/COX-2途径的活化是HeLa细胞放射抗拒的重要原因,PI3K/Akt与COX-2之间存在正反馈的调节,抑制PI3K/Akt/COX-2途径的活化能够提高HeLa细胞放射敏感性。     

还原型谷胱甘肽调控Nrf2/iNOS信号对DR大鼠视网膜的保护机制

目的 探讨还原型谷胱甘肽调控Nrf2/iNOS信号对DR大鼠视网膜的保护机制.方法 选取48只SD大鼠,随机分成健康组、病变组、他汀组、甘肽组,每组均为12只大鼠,除健康组外其余组别均建立糖尿病视网膜病变大鼠模型,建模成功后健康组与病变组不进行用药,他汀组大鼠给予辛伐他汀灌胃,甘肽组大鼠采用还原型谷胱甘肽干预,各组大鼠...     

青蒿琥酯逆转Eca109/ABCG2细胞对阿霉素耐药的作用及机制

目的研究青蒿琥酯(Art)逆转食管癌耐药细胞Eca109/ABCG2对阿霉素(ADM)耐药的作用及其机制。方法采用不同浓度的青蒿琥酯(Art,0、0.01、0.1、1μmol/L),阿霉素(ADM,0、0.02、0.2、2、20mg/L),Art(0.01、0.1、1μmol/L)+ADM(0.02、0.2、2、20mg/L)处理Eca109/ABCG2细胞48h,然后以MTT法检测细胞生长抑制率。采用ADM(0、0.02、0.2、2mg/L),Art(0、0.01、0.1、1μmol/L)和ADM(0.2mg/L)+Art(0.01、0.1、1μmol/L)处理细胞,48h后以流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率及细胞内ADM含量,72h后检测细胞内ABCG2蛋白的表达。结果与单独应用Art或ADM相比,Art+ADM处理后,Eca109/ABCG2细胞的生长抑制率、凋亡率和细胞内ADM含量均显著增加(P<0.05),而细胞内ABCG2蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论 Art可通过下调Eca109/ABCG2细胞ABCG2蛋白表达,增加细胞内ADM的药物浓度,从而增强疗效、逆转耐药。     

西罗莫司阻断mTOR通路对大鼠肾纤维化的保护作用及其机制研究

目的 研究西罗莫司(Sir)阻断哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路对大鼠急性完全性梗阻所致肾脏纤维化的保护作用及其机制.方法 健康雄性Wistar大鼠42只,随机分为3组(n=14).单侧输尿管结扎组(UUO组):采用单侧输尿管结扎法建立大鼠肾纤维化模型;Sir组:从建模前1d开始每日给予Sir 2mg/kg灌胃直至实验结束;假手术组:除结扎输尿管外其他过程同UUO组.分别于实验第7天和第14天处死大鼠,取梗阻肾脏,通过病理学观察比较各组肾脏及肾小管扩张程度,并测定肾盂内梗阻性尿液的钠、钾、钙离子浓度,同时采用免疫组化法观察细胞增殖核抗原(PCNA)的表达,TUNEL法观察细胞凋亡情况,定量PCR测定纤维化相关的microRNA分子mir-155、mir-143、mir-29c的表达情况.结果 第7和第14天时,与对照组比较,UUO组和Sir组患侧肾脏均明显扩大,肾小管明显扩张,但Sir组患侧肾脏扩大程度明显小于UUO组(P＜0.01).肾小管扩张程度低于UUO组(P＜0.01).与UUO组比较,Sir组肾小管损伤程度、间质渗出、肾脏纤维化程度均明显减轻,肾盂内尿液的钠、钾、钙离子浓度明显下降(P＜0.05),PCNA阳性和凋亡细胞比例明显降低(P＜0.001).3组间比较mir-155、mir-143表达无明显差异,UUO组mir-29c表达下降,明显低于Sir组和假手术组(P＜0.01),而Sir组与假手术组比较无明显差异.结论 Sir抑制mTOR通路可以显著延缓急性完全性梗阻所致的大鼠肾脏纤维化的进展.