根尖乳头干细胞向牙髓牙本质复合体分化能力的实验研究

目的:应用组织工程方法,探讨根尖乳头干细胞(SCAP)分别在炎性环境(肿瘤坏死因子-α)及正常环境下向牙髓牙本质复合分化的可能性.方法:分离大鼠根尖乳头组织,采用酶消化法结合组织块法获得SCAP,鉴定细胞来源,进行MTT生长曲线的测定,分正常组、炎症组(10 ng/mL TNF-α)及空白对照组行体外成骨能力茜素红及免疫组化实验,并将3个组分别移植到大鼠背部皮下观察8/12周后新生组织的形成情况.结果:MTT结果显示10 ng/mLTNF-α组显著高于正常SCAP组,差异有统计学意义(P＜0.5);茜素红染色显示均有矿化结节生成,与炎性组(10 ng/mL TNF-α)相比,正常组SCAP染色显著,矿化结节形成的范围大且呈深橘色;免疫组化染色显示SCAP胞浆中DSP/BSP均有表达;正常、炎症组移植物可见牙髓牙本质样结构形成,且DSP/BSP均阳性表达,空白对照组未见矿化组织形成.结论:SCAP具有高增殖及成骨向分化能力,可进行牙髓牙本质复合体的再生,炎性因子TNF-α对SCAP的生长增殖有促进作用同时不同程度上对SCAP矿化及成牙成骨向分化有抑制作用.     

TNF-α影响鼠根尖乳头干细胞成骨/成牙本质能力的实验研究

目的研究肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)对鼠根尖乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAP)增殖及成骨/成牙本质能力的影响。方法分离大鼠根尖乳头组织,采用酶消化法结合组织块法获得SCAP并通过免疫荧光法进行细胞鉴定;将细胞分为实验组(TNF-α浓度5、10、15、20、30、40、50μg/L)和对照组(TNF-α浓度0μg/L),CCK-8法检测细胞增殖能力;采用碱性磷酸酶活性、茜素红染色及实时定量PCR检测TNF-α对SCAP成骨/成牙本质能力的影响。结果体外培养SCAP符合间充质干细胞来源的特征且具有多向分化能力;细胞增殖能力结果显示:各浓度组均能促进SCAP增殖(P<0.05);ALP活性结果显示:各浓度TNF-α均能明显降低ALP活性(P<0.05);茜素红染色结果显示:随着TNF-α的浓度的增加,染色逐渐变浅,红色结节逐渐变小,形成数量逐渐减少;qRT-PCR结果显示:3 d时,实验组OC、DMP-1表达量明显降低(P<0.05),牙本质涎磷蛋白(DSPP)表达量降低(P>0.05),骨涎蛋白(BSP)表达量稍有增加(P<0.05)。7 d时,OC、DSPP表达量明显降低(P>0.05),DMP-1表达量明显降低(P<0.05),BSP表达量与对照组相比仍稍有增加(P>0.05);14 d时,BSP、OC、DMP-1表达量均明显降低(P<0.05),DSPP表达量稍有增加(P>0.05)。结论炎性因子TNF-α对SCAP的增殖有促进作用同时不同程度抑制SCAP成骨/成牙本质向分化能力。     

TNF-α对人根尖乳头干细胞增殖及分化能力的影响

目的：研究肿瘤坏死因子α（TNF-α）对人根尖乳头干细胞增殖及分化能力的影响。方法：采用组织块法获得人根尖乳头干细胞,免疫荧光法鉴定干细胞表面标志物;经TNF-α刺激后检测对干细胞增殖、克隆形成率及分化能力的影响。结果：免疫荧光显示人波形丝蛋白、STRO-1阳性,角蛋白阴性;10μg/L TNF-α在4天时促进根尖乳头干细胞的增殖,提高克隆形成率;抑制碱性磷酸酶活性及矿化结节形成。结论：炎性因子TNF-α对人根尖乳头干细胞的生物学特性具有一定的影响。     

cAMP信号通路在根尖牙乳头干细胞定向分化中的作用

目的:探讨环磷酸腺苷(cAMP)信号通路对根尖牙乳头干细胞(SCAP)定向分化的影响.方法:酶消化法培养细胞;在矿化诱导液中分别加入信号通路激活剂Forskolin (FOR)和抑制剂H-89;通过茜素红染色和定量分析检测钙盐沉积;QPCR检测相关矿化基因mRNA的表达.结果:激活SCAPs内的cAMP信号后,该细胞茜素红染色增强,并上调矿化基因ALP、OCN、OSX、RUNX2的mRNA表达;而抑制SCAPs中cAMP信号后,该细胞茜素红染色减弱,并下调矿化基因的表达.结论:激活cAMP/PKA信号通路促进SCAPs分化,抑制信号通路则发挥相反作用,说明该信号通路对根尖牙乳头干细胞向成牙/成骨分化有一定的调节作用.     

丹参注射液促进人脱落乳牙牙髓干细胞成骨/成牙分化的实验研究

目的 探讨中药丹参对人脱落乳牙牙髓干细胞(SHEDs)成骨/成牙分化功能的影响.方法 利用50mg/ml的丹参注射液作用于SHEDs细胞,利用成骨/成牙分化诱导培养基诱导SHEDs定向分化.通过检测ALP活性、茜素红染色、钙离子定量分析、成骨/成牙分化相关基因的表达研究 SHEDs 体外成骨/成牙分化能力.Western Blot检测AKT信号分子的表达.结果 50mg/ml的丹参注射液促进SHEDs细胞ALP活性,体外矿化能力及成骨/成牙分化相关基因骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、牙本质涎磷蛋白(Dentin sialophosphoprotein,DSPP)的表达.50mg/ml的丹参注射液促进磷酸化AKT的表达.结论 50mg/ml的丹参注射液具有促进SHEDs细胞体外成骨/成牙分化的潜能,其作用可能与激活AKT信号通路相关.     

HOXC6同型蛋白2对根尖牙乳头干细胞成骨/成牙分化功能的影响

目的 探讨同源盒基因C6同型蛋白2对牙源性间充质细胞成骨/成牙分化的影响.方法 成骨诱导培养基诱导人根尖牙乳头干细胞体外成骨/成牙分化;逆转录病毒转染构建过表达HOXC6-ISO2稳定转染牙乳头干细胞进行HOXC6-ISO2获得性功能研究;碱性磷酸酶活性实验检测成骨/成牙早期分化指标-碱性磷酸酶活性;茜素红染色及钙离子定量分析检测干细胞体外矿化能力;实时荧光定量反转录PCR检测成骨/成牙分化相关基因-Sp7转录因子、Runt相关转录因子2和骨钙素及同源盒基因C6下游基因胰岛素结合蛋白5的表达.结果 结果显示过表达同源盒基因C6同型蛋白2明显抑制牙乳头干细胞的碱性磷酸酶活性;茜素红染色及钙离子定量分析结果显示过表达同源盒基因C6同型蛋白2明显抑制牙乳头干细胞体外矿化能力;实时荧光定量反转录PCR显示过表达同源盒基因C6同型蛋白明显抑制骨钙素的表达,并且抑制下游基因胰岛素结合蛋白5的表达.结论 同源盒基因C6同型蛋白2通过抑制下游基因胰岛素结合蛋白5抑制牙乳头干细胞体外成骨/成牙分化的功能.     

雌激素受体α高表达慢病毒载体对根尖牙乳头干细胞成牙/成骨分化的影响

目的雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)高表达慢病毒载体感染根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAPs),探讨其在SCAPs体外成牙/成骨分化中的作用。方法 ERα高表达慢病毒载体感染SCAPs,Western blot检测ERα的表达,茜素红染色和Western blot检测其对SCAPs成牙/成骨分化的影响。结果体外实验表明,实验组(ERα)ERα的蛋白表达水平较对照组(GFP)明显升高,实验组成牙/成骨向分化标志蛋白(碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、成骨细胞特异性转录因子(osterix,OSX)、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)和骨钙素(osteocalcin,OCN))表达水平在3d或7d的表达均有不同程度上调,与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)。在成骨诱导条件下,实验组(ERα)的矿化结节形成量较对照组(GFP)多,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论慢病毒介导的ERα高表达载体成功在体外上调了目的基因的表达,并促进根尖牙乳头干细胞的成牙/成骨分化。     

糖基化终末产物对人牙周膜干细胞骨向分化能力影响的研究

目的:探讨糖基化终末产物(AGEs-HSA)对人牙周膜干细胞(HPDLSC)骨向分化能力的影响。方法:体外组织块法和有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,流式细胞仪检测牙周膜细胞表型分子CD44、CD146、stor-1、CD90,对其进行干细胞鉴定,将培养出的牙周膜干细胞与不同浓度的AGE-HSA共同培养,并矿化诱导后茜素红染色观察钙结节形成情况、碱性磷酸酶染色观察ALP活性、实时定量聚合酶链反应(real timePCR)检测成骨基因表达情况。结果:流式细胞仪细胞表型分析CD44、CD146、stor-1、CD90表达呈阳性。成骨诱导21 d后茜素红染色,对照组和实验组均出现不同程度的矿化结节,定量分析显示1、10、100、200μg/mLAGEs组矿化能力均比对照组低,差异均有统计学意义(P<0.05);不同浓度的实验组之间矿化能力均有统计学差异(P<0.05),且随着AGEs浓度的升高,矿化能力逐渐降低。成骨诱导7 d ALP染色比较发现各实验组均比对照组减弱。成骨诱导1周后RT-PCR检测各实验组的成骨基因ALP、Runx-2、Col-1、Runx-2 mRNA表达水平均较对照组低,差异有统计学意义(P<0.05);不同浓度的实验组之间各成骨基因的表达也有统计学差异(P<0.05)。结论:AGEs能抑制HPDLSC的骨向分化,并在一定范围内呈浓度依赖性。     

人牙根尖乳头细胞的培养及TNF-α对其增殖的影响

目的:体外培养人根尖乳头细胞,研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)对其增殖活性的影响,并与同一牙的牙髓细胞进行比较,探讨炎症条件下根尖乳头细胞用于牙本质再生的可行性.方法:取15岁阻生牙患者拔除的根尖未发育完成的第三磨牙,用酶消化法进行根尖乳头细胞和牙髓细胞的培养;将含有不同浓度TNF-α(5、10、50ng/mL)的培养液加入第4代细胞中,MTT法检测其对细胞增殖活性的影响.采用SPSS11.0软件包对实验组和对照组数据进行单因素方差分析.结果:根尖乳头细胞呈梭形、多角形或纺锤形,形似成纤维细胞;根尖乳头细胞较牙髓细胞具有更强的增殖活性;在10ng/mL和50ng/mL浓度时,TNF-α能促进2种细胞的增殖.结论:根尖乳头细胞具有较强的增殖活性,尤其在炎性环境下仍具有较强的增殖活性,可能在年轻恒牙根尖周炎经适当治疗后牙根继续发育中发挥重要作用.     

血小板裂解液对人根尖牙乳头干细胞和牙周膜干细胞体内外增殖、矿化能力的影响

目的:研究血小板裂解液(Platelet Lysate,PL)在体内外对人根尖牙乳头干细胞(SCAP)和牙周膜干细胞(PDLSCs)增殖、矿化的干预效应,以期找到PL应用于这两种细胞的最佳方式。方法:在矿化诱导培养体系中按一定体积比加入PL,分别作用于体内、外复合HA-TCP支架材料三维生长的SCAP和PDLSCs,扫描电镜(SEM)以及组织学观察细胞生长、分化情况。结果:体外三维培养模式下,PL能够促进SCAP和PDLSCs的增殖以及矿化细胞外基质的形成,并利于在支架材料上形成完整的细胞膜片(cell sheet)样结构,以上效应对于PDLSCs作用更为显著。而在体内移植模式下,经50 mL/L、10 mL/L PL培养体系预培养的SCAP能形成包含成牙本质细胞样细胞、牙本质样基质和牙髓组织的牙本质牙髓复合体样结构;而PDLSCs经50 mL/LPL干预后,可分化为成牙骨质细胞样细胞,并生成牙骨质样基质、牙周膜样组织。结论:一定体积浓度比的PL能促进SCAP和PDLSCs在体内外的增殖以及成骨、成牙本质分化。     

糖基化终末产物对人牙周膜干细胞增殖及相关基因HSG、cyclinD1表达的影响

目的:探讨糖基化终末产物(AGEs)对人牙周膜干细胞(HPDLSC)增殖能力以及增殖相关基因HSG、cyclinD1的影响。方法:体外组织块法和有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞;成骨、成脂诱导牙周膜细胞,对其进行干细胞鉴定;将培养出的牙周膜干细胞与不同浓度的AGEs 共培养,MTT检测不同浓度下牙周膜干细胞增殖的改变;实时定量聚合酶链反应(real time PCR)检测AGEs刺激后HSG、cyclin D1表达的改变。结果:牙周膜细胞成骨诱导21 d后茜素红染色出现钙化结节;成脂诱导21 d后油红O染色出现脂滴;MTT显示不同浓度的AGEs对HPDLSCs增殖能力的影响有所差别,高浓度(100 mg/L,200 mg/L)明显抑制HPDLSCs的增殖,差异有统计学意义(P<0.05),低浓度(1 mg/L,10 mg/L)对HPDLSCs的增殖能力影响不大,差异无统计学意义;Real time PCR结果显示:AGEs(100 mg/L)刺激3 d后HSG mRNA表达水平较对照组升高、cyclinD1 mRNA的表达水平较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:高浓度的AGEs能抑制人牙周膜干细胞的增殖并能改变HSG、cyclinD1 mRNA的表达。     

人体脂肪基质细胞分离培养及其成骨潜能

目的 :分离人体脂肪基质细胞并诱导培养其成骨表型。方法 :将脂肪抽吸术获取的人体脂肪进行机械分割 ,通过Ⅰ型胶原酶消化后得到脂肪基质细胞 ,在BGJb 培养基中原代培养 10d ,消化传代后用含体积分数 10 ?S及 10 - 8mol/L地塞米松 ,50mg/L左旋抗坏血酸 ,10nmol/L维生素D3 ,10mmol/Lβ 磷酸甘油钠的DMEM /F12培养基中诱导培养 14d ,观察细胞形态 ,绘制细胞生长曲线并对其成骨表型进行鉴定。结果 :脂肪基质细胞呈成纤维细胞样贴壁生长 ,其中的成体干细胞经诱导培养后体积明显增大 ,胞核大面圆 ,胞浆丰富 ,群体倍增时间为 66h。Gomori萘酚磷酸酯法染色显示其胞浆内富含碱性磷酸酶颗粒 ,vonKossa染色表明聚集的细胞团能形成矿化结节。结论 :脂肪基质细胞中的成体干细胞经过矿化诱导培养后可向成骨细胞分化 ,并具有明显的成骨表型     

辛伐他汀对人牙周膜成纤维细胞增殖和成骨分化的影响

目的:评价辛伐他汀对人牙周膜成纤维细胞增殖和成骨分化的影响。方法:采用组织块法进行人牙周膜成纤维细胞的分离培养。在培养液中加入不同浓度的辛伐他汀,分为对照组(0 mol/L)和5个实验组(10-8、10-7、10-6、10-5和10-4mol/L),检测各组细胞增殖能力和碱性磷酸酶活性。通过矿化结节茜素红染色和RT-PCR,评价辛伐他汀对细胞成骨能力和成骨相关基因表达的影响。结果:辛伐他汀浓度为10-7mol/L时,细胞增殖能力显著提高(P﹤0.05)。辛伐他汀浓度为10-8、10-7、10-6和10-5mol/L时,细胞碱性磷酸酶活性均有显著增强(P﹤0.05),其中,10-7mol/L组增强作用最明显。茜素红染色显示,10-7mol/L辛伐他汀能促进细胞矿化结节形成;RT-PCR结果表明,辛伐他汀促进细胞碱性磷酸酶和骨形成蛋白-2基因表达呈时间依赖性增高。结论:10-7mol/L的辛伐他汀不仅有利于人牙周膜成纤维细胞增殖,而且促进其成骨分化和相关基因的表达。     

血小板裂解液对人根尖牙乳头干细胞体外增殖的影响

目的:评价血小板裂解液(PL)对根尖乳头干细胞(SCAP)增殖的影响,为PL代替胎牛血清(FBS)提供依据.方法:用显微镜观察SCAP的生长特征,用流式细胞仪检测细胞的表面标志物,用茜素红染色检测细胞的成骨分化能力.将SCAP分为四组,分别在培养基中加入PL(2％、5％和l0％)和10％ FBS.培养第1、3、5、7d后用MTT检测各组SCAP的增殖情况.结果:流式细胞分析表明SCAP表达CD73、CD90和CD105呈阳性,CD14、CD34和CD45呈阴性.SCAP骨向分化呈阳性.2％ PL与10％ FBS组之间细胞增殖差异不具有统计学意义(P＜0.05),5％ PL组与10％ FBS组之间细胞增殖差异有统计学意义(P＜0.05).结论:在对SCAP的增殖方面,2％ PL与10％ FBS的作用相近.5％ PL强于10％ FBS.     

糖基化终末产物对小鼠骨髓间充质干细胞增殖及相关基因P27、cyclinD1 的影响

目的:探讨糖基化终末产物(AGEs)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖能力以及相关基因P27、cyclinD1的影响。方法:全骨髓法培养小鼠骨髓间充质干细胞;成骨、成脂诱导骨髓间充质细胞,对其进行干细胞鉴定;将培养出的骨髓间充质干细胞与不同浓度的AGEs 共培养,MTT检测不同浓度下骨髓间充质干细胞增殖的改变;实时定量聚合酶链反应(Real time PCR)检测AGEs刺激后P27、cyclin D1表达的改变。结果:小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导21 d后茜素红染色出现钙化结节;成脂诱导21 d后油红O染色出现脂滴;MTT显示不同浓度的AGEs(10、50、100、200 mg/L)均能抑制BMSCs的增殖差异有统计学意义(P<0.05),且随着浓度的增加抑制越明显;Real time PCR结果显示:AGEs(50 mg/L)刺激3 d后P27 mRNA的表达水平较对照组升高,cyclinD1 mRNA的表达水平较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:AGEs能抑制小鼠骨髓间充质干细胞的增殖并能改变P27 、cyclinD1 mRNA的表达。     

根尖牙乳头干细胞细胞膜片构建及其成骨/成牙本质分化性能研究

目的:构建根尖牙乳头干细胞（stem cells from apical papilla, SCAP）细胞膜片,并对其组织学形态和成骨/成牙本质分化性能进行研究,为SCAP细胞膜片应用于年轻恒牙牙髓再生提供实验基础。方法:分离年轻恒牙第三磨牙牙乳头,进行SCAP原代培养。采用流式细胞术检测SCAP表面标志物,茜素红S染色检测其成骨/成牙本质分化。取第3代SCAP,膜片诱导液连续培养14 d,形成细胞膜片。对SCAP细胞膜片进行H-E染色,组织学观察;流式细胞术检测SCAP细胞膜片的细胞周期变化;实时定量PCR（qRT-PCR）检测细胞膜片中Runx2、ALP、Col-I基因表达;Western印迹法检测细胞膜片Runx2、ALP蛋白表达水平。采用SPSS17.0软件包对实验结果进行统计学分析,两样本细胞周期检测和qRT-PCR基因检测均数的比较采用t检验。结果:组织学H-E染色显示,SCAP细胞膜片由5~6层细胞组成,细胞量大,细胞之间排列紧密,且富含细胞外基质。SCAP细胞膜片细胞周期G2+S期所占比例较低,而G1期比例较高,提示SCAP细胞膜片增殖性能受到显著抑制（P<0.05）。同时,qRT-PCR和Western印迹法结果显示,与SCAP相比,SCAP细胞膜片成骨/成牙本质分化能力显著升高（P<0.05）。结论:SCAP细胞膜片富含细胞外基质,且成骨/成牙本质分化能力高于单纯SCAP,SCAP细胞膜片应用于牙髓再生更具有优势。     

唑来膦酸对大鼠颌骨间充质干细胞成骨分化的影响

目的:研究唑来膦酸对大鼠颌骨来源的间充质干细胞增殖、成骨分化及成骨因子RANKL/OPG m RNA表达的影响。方法:体外培养新生SD大鼠颌骨来源的间充质干细胞,观察不同浓度(0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μg/m L)唑来膦酸对细胞增殖的影响。观察较高浓度唑来膦酸对细胞碱性磷酸酶活性、矿化结节形成以及成骨因子RANKL/OPG m RNA表达的影响。结果 :唑来膦酸≥1.0μg/m L能明显抑制细胞增殖,低浓度(0.5μg/m L)则不影响细胞增殖,高浓度唑来膦酸(2.0μg/m L)可抑制碱性磷酸酶活性、矿化结节的形成。高浓度唑来膦酸(2.0μg/m L)能使颌骨间充质干细胞RANKL m RNA表达减少,OPG m RNA表达增加,且明显下调成骨因子RANKL/OPG比率。结论:唑来膦酸在高浓度时明显抑制颌骨来源间充质干细胞的增殖和分化,并通过调节其表面RANKL/OPG m RNA表达,抑制破骨细胞的功能,骨生成与骨吸收同时减少,骨改建过程受抑制。     

bFGF对人根尖牙乳头干细胞成脂分化影响的研究

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在体外对人根尖牙乳头干细胞(stem cellsfrom apical papilla,SCAP)成脂分化的影响。方法:采用酶消化法获得原代SCAP,用含有5 ng/mL bFGF的成脂诱导液对其诱导培养不同时间,显微镜观察细胞形态变化、油红0染色观察SCAP成脂分化能力、RT-PCR检测PPAR-γ2 mRNA表达情况。结果:SCAP在含有5 ng/mL bFGF成脂诱导液中培养3周,细胞中脂滴形成数量多于对照组,而且细胞密度也相对较大,细胞体积小,未见拉长、变大等现象。RT-PCR检测显示,诱导培养1周时,实验组与对照组PPAR-γ2 mRNA表达无显著性差异(P>0.05);培养3周时,实验组PPAR-γ2 mRNA表达量明显高于对照组(P<0.05)。结论:bFGF具有促进SCAP成脂分化的潜能。     

镁离子影响人上颌窦黏膜干细胞体外成骨分化的研究

目的:研究不同浓度镁离子(Mg²⁺)对人上颌窦黏膜干细胞(human maxillary sinus membrane stem cells, hMSMSCs)生物行为的影响。方法:体外提取hMSMSCs后利用流式细胞术和多向分化实验来鉴定其间充质干细胞特征,随后将细胞分别培养在0.8 mmol/L、1.8 mmol/L、2.8 mmol/L和5.8 mmol/L的Mg²⁺浓度下。通过CCK-8实验和Calcein AM/PI染色检测hMSMSCs的细胞黏附和增殖,采用罗丹明鬼笔环肽-DAPI染色评估细胞的黏附伸展。对成骨诱导培养后的hMSMSCs进行ALP活性、ALP染色和茜素红染色,同时利用qRT-PCR实验检测成骨相关生长因子的表达差异。结果:适宜浓度Mg²⁺能有效改善hMSMSCs的黏附、伸展和增殖。1.8 mmol/L Mg²⁺提高了hMSMSCs的ALP活性,并显著改善细胞外钙结节的形成并上调成骨相关基因的表达,而过高浓度的Mg²⁺相对抑制了hMSMSCs的成骨分化...