牙龈卟啉单胞菌感染MG63细胞对细胞周期的影响

目的:通过体外建立牙龈卟啉单胞菌(P. gingivalis)感染MG63细胞模型,探讨P. gingivalis ATCC 33277菌株感染MG63细胞对细胞周期的影响及发生机制。方法:P. gingivalis ATCC 33277菌株感染MG63细胞,MTT法检测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞周期的分布,实时定量PCR和蛋白印记方法检测Cyclin D、Cyclin E的表达。结果:MOI为100∶1,P. gingivalis ATCC 33277菌株感染MG63细胞,能够抑制细胞增殖,同时导致细胞在G1期发生停滞,Cyclin D、Cyclin E基因和蛋白在24 h、48 h均有明显下降,与对照组相比有统计学差异。结论:牙龈卟啉单胞菌感染MG63细胞Cyclin D、Cyclin E基因和蛋白表达下调,抑制细胞的增殖,导致细胞停滞在G1期。     

特定序列寡核苷酸MT01对牙龈卟啉单胞菌感染的成骨细胞的增殖、细胞周期及凋亡的影响

目的 通过观察MT01对感染状态下成骨细胞细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响,探讨MT01对牙周致病菌感染的成骨细胞生物学性能的影响。方法 以人成骨细胞MG63为目的细胞,分别与PBS、MT01、CpG ODN、甲硝唑和庆大霉素共培养3 h后,按感染复数100∶1的比例加入牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌共培养,检测培养24 h和48 h后MG63细胞的增殖、细胞周期及凋亡,以PBS作为空白对照,以牙龈卟啉单胞菌和PBS共培养作为阴性对照。结果MT01+牙龈卟啉单胞菌组细胞增殖高于空白对照组（P<0.05）,G₁期细胞百分比低于阴性对照组,而S期细胞百分比高于阴性对照组（P<0.05）,细胞早期凋亡率低于阴性对照组（P<0.05）。结论 MT01可促进感染状态下成骨细胞的细胞增殖,降低G₁期细胞百分比,促使细胞进入S期并抑制细胞早期凋亡。     

牙龈卟啉单胞菌影响血管内皮细胞增殖和凋亡的实验研究

目的 观察牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivatis,Pg)对血管内皮细胞增殖和凋亡的影响,探讨Pg在动脉粥样硬化发病机制中的作用.方法 建立体外Pg侵入血管内皮细胞模型,甲基噻唑基四唑(MTT)法观察细胞增殖,碘化丙啶染色、流式细胞仪分析细胞周期,Annexin-V-FITC凋亡试剂盒检测细胞凋亡.结果 PgATCC33277侵入后72 h细胞增殖活性降低12.46%,Pg W83侵入后72 h细胞增殖活性降低10.47%(F=786.68,P<0.01);Pg W83侵入后24 h使G1期细胞增加(F=43.23,P<0.01),ATCC 33277侵入后48 h使G1期细胞增加(F=66.72,P<0.01);Pg侵入后24 h即诱导细胞凋亡(F=1074.56,P<0.01).结论 Pg可能通过细胞毒性及诱导凋亡作用,加重血管内皮细胞的局部炎性反应,在动脉粥样硬化炎性病理反应中有重要意义.     

牙龈卟啉单胞菌感染对大鼠血管平滑肌细胞细胞间黏附分子-1表达的影响

目的 观察牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277感染对大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达的影响。方法 建立体外牙龈卟啉单胞菌感染大鼠VSMC模型,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测ICAM-1基因的表达。结果 牙龈卟啉单胞菌感染VSMC 8、16、24 h后,ICAM-1表达明显增多,与空白对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。感染16 h达高峰,感染8 h与感染16、24 h比较,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 牙龈卟啉单胞菌感染可引起VSMC ICAM-1高表达,这提示牙周致病菌可能参与血管壁的炎症反应,在动脉粥样硬化的发生、发展中有重要的意义。     

牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白A参与诱导小鼠牙槽骨吸收

目的探讨牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白(Fim)A是否参与该菌引起牙槽骨吸收的作用。方法用牙龈卟啉单胞菌ATCC33277野生菌株感染BALB/c小鼠,建立其诱导的牙周病动物模型。用ATCC33277及其fimA基因敲出的牙龈卟啉单胞菌KDP150变异菌株分别感染实验动物BALB/c小鼠(每组5只小鼠),测量其牙槽骨的改变情况,且与未接种细菌的阴性对照组相比较,采用t检验进行统计学分析。结果 ATCC33277组小鼠牙槽骨吸收量高于阴性对照组(P0.05),而fimA基因敲除菌株KDP150与对照组相比较,牙槽骨吸收量差异无统计学意义(P0.05)。野生菌株组小鼠牙槽骨吸收量高于fimA基因敲除菌株组(P0.05)。结论牙龈卟啉单胞菌fimA可能是该菌引起牙槽骨吸收的重要毒力因子。     

牙龈卟啉单胞菌rag位点基因分型与细菌毒力的关系研究

目的：探讨牙龈卟啉单胞菌rag位点基因分型与细菌毒性的关系。方法将不同rag基因位点的牙龈卟啉单胞菌W83(rag-1型)、A011/9(rag-2型)、QM220(rag-3型)和ATCC33277(rag-4型)菌株分别刺激中性多形核白细胞,未受刺激的中性多形核白细胞作为对照。采用RT-PCR检测FcγⅢb受体基因,流式细胞术检测中性多形核白细胞凋亡情况,试剂盒检测毒力因子。结果 W83组 FcγⅢb基因相对表达量显著高于其他组( P <0．05),其次为QM220组,显著高于A011/9和ATCC33277组(P<0.05)。流式细胞术检测发现,ATCC33277组细胞凋亡率显著高于其他各组(P<0.05),A011/9组凋亡率显著高于W83组(P<0.05)。各基因分型组LPS、LBP、mCD14、MMP-8 MMP-9、IL-8以及IL-1β均高于对照组(P<0.05)。W83组上述指标显著高于其他各基因型组(P<0.05),QM220组次之,与 A011/9、ATCC33277组比较差异有统计学意义(P <0.05)。 A011/9组在 LPS、LBP、mCD14方面高于ATCC33277组(P<0.05),而MMP-8、MMP-9两者差异无统计学意义(P>0.05)。结论牙龈卟啉单胞菌菌株中rag位点基因分型的细菌毒性rag-1型最强,rag-3型次之,较弱的为rag-2型和rag-4型。     

牙龈卟啉单胞菌入侵血管内皮细胞的实验研究

目的:体外观察牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖的影响,观察Pg对HUVEC的入侵能力,从而探讨Pg对内皮细胞功能损伤的途径,以期为牙周病在动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)发病机制中的作用提供依据。方法:用感染复数(multiplicity of infection,MOI)1:10,1:100PgATCC33277分别干预HUVEC 4h、8h、12h、24h,未受Pg ATCC33277干预的HUVEC作为阴性对照组,倒置显微镜下观察HUVEC形态,CCK-8法测定HUVEC细胞的增殖情况,透射电镜下观察Pg ATCC33277对HUVEC的入侵情况。结果:在24h内,与对照组相比,受Pg ATCC33277感染的HUVEC的细胞形态未见明显影响,仍呈典型的"铺路石"单层贴壁生长,Pg ATCC33277对HUVEC细胞增殖未见明显影响,透射电镜下观察发现Pg ATCC33277可以黏附HUVEC细胞膜表面,入侵HUVEC,直接定植或以空泡的形式存在于细胞的胞质中。结论:Pg可以入侵内皮细胞,以在细胞内定植的方式逃避宿主的防御反应,内皮细胞的形态和增殖未见明显改变,从而形成第二次慢性感染过程,进一步影响内皮细胞正常功能的发挥。     

牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉血管内皮细胞cGMP生成的影响

目的:体外研究牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)cGMP水平的影响。方法:用Pg ATCC 33277分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)1∶10、1∶50、1∶250干预HUVEC,并以未受Pg ATCC 33277干预的HUVEC作为阴性对照,分别培养4、12、36 h,在倒置显微镜下观察各组细胞形态;125I cGMP放射免疫试剂盒检测各组HUVECcGMP的水平。结果:与对照组相比,Pg ATCC 33277分别以MOI 1∶10、1∶50、1∶250干预HUVEC 4、12、36 h后,实验各组HUVEC的细胞形态未见明显改变,仍呈典型的"铺路石"状单层贴壁生长;Pg ATCC 33277 MOI1∶250时可呈时间依赖性地降低HUVEC cGMP水平,而同一时间点内,各浓度组的cGMP水平并无明显差异。结论:短时间内,Pg ATCC 33277对HUVEC的细胞形态无明显影响,但可降低HUVEC cGMP的生成,HUVECNO生物利用度下降。     

血链球菌细菌素对牙龈卟啉单胞菌形貌及力学性质的影响

目的:研究血链球菌细菌素(简称血链素)对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)形貌特征及力学性质的影响。方法:1)复苏、传代并鉴定血链球菌标准菌株ATCC10556、牙龈卟啉单胞菌标准菌株ATCC33277。2)将血链球菌低温高速离心、细胞破碎等方法提取血链素,使之作用于P.g,于37 ℃厌氧培养48 h。3)采用原子力显微镜(AFM)的接触模式,观察血链素作用前后P.g菌体的形貌变化。4)利用AFM测定血链素作用前后P.g的力-距离曲线,并计算黏附力及杨氏模量。结果:1)通过AFM的观察:P.g在血链素的作用下,菌体直径缩小、平均粗糙度及平均峰高度增加(P<0.05)。2)通过AFM的观察:血链素作用后,P.g的黏附力、杨氏模量显著降低(P<0.001)。正常P.g的黏附力平均值为(0.70±0.10) nN、杨氏模量平均值为(5.54±0.16) MPa;经血链素作用后P.g的黏附力平均值为(0.50±0.10) nN、杨氏模量平均值为(3.97±0.64) MPa。结论:1)血链素可引起牙龈卟啉单胞菌形貌特征发生改变。2)血链素可导致牙龈卟啉单胞菌的黏附力及杨氏模量降低。     

小分子RNA干扰沉默Tiam1基因对舌鳞状细胞癌细胞生物学特性的影响

目的:探讨小分子RNA干扰(siRNA)沉默Tiam1基因对舌鳞状细胞癌细胞生物学特性的影响。方法:培养人舌癌细胞SCC-4,随机分为siRNA-Tiam1组、siRNA-对照序列组和空白对照组,利用实时荧光定量PCR技术和Western blot法检测不同转染组细胞中Tiam1基因和蛋白表达,MTT法检测不同转染组细胞增殖情况,利用流式细胞术检测不同转染组细胞凋亡情况,Transwell法检测不同转染组细胞迁移和侵袭能力。结果:siRNA-Tiam1组细胞中Tiam1基因和蛋白相对表达量均低于siRNA-对照序列组和空白对照组(P<0.05);MTT实验结果显示,与siRNA-对照序列组和空白对照组相比,siRNA-Tiam1组细胞24 h、48 h、72 h和96 h时A值均降低(P<0.05);流式细胞检测结果显示,siRNA-Tiam1组细胞凋亡率显著高于siRNA-对照序列组和空白对照组(P<0.05);siRNA-Tiam1组迁移细胞数和侵袭细胞数均低于siRNA-对照序列组和空白对照组(P<0.05)。结论:特异性沉默Tiam1基因可有效抑制舌鳞状细胞癌细胞增殖能力,加速细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭能力。     

牙龈卟啉单胞菌感染对人脐静脉内皮细胞表达IL-8影响的研究

目的 研究牙龈卟啉单胞菌(porphyrmonas gingivalis,P.g)感染时人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelialcell,HUVEC)表达趋化因子白介素-8(interleukin-8,IL-8)的变化,了解P.g对其趋化功能的影响。方法 建立P.g侵入HUVEC的体外模型,采用酶联免疫吸附法(ELISA)研究P.g381和P.g33277菌株感染HUVEC 6、24 h后的培养上清液中IL-8的浓度。结果 ELISA结果显示当P.g381感染HUVEC 6、24 h和P.g33277感染HUVEC 6、24 h时,HUVEC分泌IL-8的水平明显升高(P<0.01);感染24 h时P.g381促进HUVEC表达IL-8的水平高于P.g33277(P<0.01)。结论 P.g侵入HUVEC后可促进其表达IL-8,从而上调其趋化功能,可能与动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发生发展相关。     

牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉内皮细胞一氧化氮生成的影响

目的 观察牙龈卟啉单胞茵(Porphyromonas gingivalis,Pg)对人脐静脉内皮细胞皮细胞功能损伤的途径,以期为牙周病在动脉粥样硬化发病机制中的作用提供依据.方法 应用厌氧罐培养Pg ATCC33277,用感染复数(multiplicity of infection,MOI)1:10、1:100、1:1000的Pg干预HUVEC,未受Pg干预的HUVEC作为阴性对照组,分别于4、8、12、24 h时收集细胞上清液,利用硝酸还原酶法测定细胞上清液中NO的浓度.结果 在24 h内,Pg MOI 1:10、1:100均能促进HUVEC NO的生成,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);Pg MOI 1:1000干预HUVEC后,12 h内可促进HUVEC NO的生成,但与阴性对照组相比差异无统计学意义,24 h时HUVEC NO的生成降低[(57.83±9.09)mmol/L],与其他各组相比差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 Pg对内皮细胞NO的生成有影响.Pg MOI 1:10、1:100能够促进内皮细胞NO的生成,Pg MOI 1:1000则抑制内皮细胞NO的生成.     

脐静脉内皮细胞外泌体和内皮祖细胞外泌体对hDPSCs增殖及迁移能力的比较研究

目的 将人脐静脉内皮细胞外泌体(human umbilical vein endothelial cells-derived exosome,HUVECs-exo)和内皮祖细胞外泌体(endothelial progenitor cells-derived exosome,EPCs-exo)对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)增殖和迁移能力的影响进行比较研究,以期为外泌体在牙髓再生中的应用积累经验。方法 采用超速离心法分离提取外泌体,透射电镜观察外泌体形态,纳米粒子跟踪分析技术(nanoparticle tracking analysis,NTA)检测外泌体粒径大小,Western blot蛋白印迹检测外泌体标志蛋白CD9、CD63、TSG101的表达。将两种外泌体按照5、10、20 μg/mL浓度梯度分别作用于hDPSCs,通过CCK-8实验检测hDPSCs增殖能力,细胞划痕实验和Transwell实验检测hDPSCs迁移能力。结果 透射电镜下观察两种外泌体均呈圆盘状,粒径集中在30～150 nm,阳性表达CD9、CD63、TSG101三种标志蛋白。与对照组(Control组)相比,两种外泌体在不同浓度下均对hDPSCs增殖能力无显著促进作用,差异无统计学意义(P>0.05)。细胞划痕实验和Transwell实验表明,与对照组相比,两种外泌体均可促进hDPSCs迁移,差异有统计学意义(P<0.05),其中10 μg/mL外泌体浓度作用效果最明显(P<0.01)。相同浓度的两种外泌体组间作用效果差异无统计学意义(P>0.05)。结论 本实验成功分离提取到两种细胞来源的外泌体并进行鉴定,将不同浓度的两种细胞来源的外泌体作用于hDPSCs,发现对其增殖能力无明显促进作用,但可以促进其迁移,尤以10 μg/mL外泌体浓度促进迁移效果最为明显。     

RNA干扰XBP1基因表达对口腔鳞状细胞癌生物学特性的影响研究

目的:检测口腔鳞状细胞癌组织中X盒结合蛋白1(XBP1)的表达及观察抑制其表达后对人口腔鳞状细胞癌Tca8113增殖凋亡的影响,并探讨其机制。方法:RT-PCR检测42例口腔鳞状细胞癌及癌旁组织中XBP1基因的mRNA表达;NC-siRNA和XBP1-siRNA转染至Tca8113细胞内,不经任何处理的细胞作为空白对照组,48 h后,CCK8实验、流式细胞仪分别检测XBP1基因转染对细胞增殖、凋亡的影响;Western blot检测Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达的变化。结果:口腔鳞状细胞癌中XBP1基因的mRNA表达显著高于癌旁组织(P<0.01);转染XBP1-siRNA能够显著降低XBP1的蛋白表达,降低细胞的存活率,促进细胞的凋亡,上调Cleaved caspase3蛋白表达,下调β-catenin、Cyclin D1蛋白表达(P<0.01)。结论:RNA干扰沉默XBP1基因表达可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路降低Tca8113增殖及诱导细胞凋亡。     

牙龈卟啉单胞菌侵入对人血管内皮细胞分泌MCP-1影响的研究

目的　通过研究牙龈卟啉单胞菌（porphyrmonas gingivalis,P.g）侵入对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）分泌单核细胞趋化蛋白（MCP-1）的影响,了解P.g对其趋化功能的影响。方法　建立P.g侵入HUVEC的体外模型,采用酶联免疫吸附法（ELISA）研究P.g381和P.g33277菌株侵入HUVEC 6、24 h后的培养上清液中MCP-1浓度。结果　ELISA结果显示当P.g381侵入HUVEC 6、24 h和P.g33277侵入HUVEC 6 h时,HUVEC分泌的MCP-1水平升高（P＜0.01）;P.g33277侵入HUVEC 24 h时,HUVEC分泌的MCP-1水平恢复最初水平（P=0.46）;P.g381诱导HUVEC表达MCP-1的水平高于P.g33277（P＜0.01）。结论　P.g侵入HUVEC后可促进其表达MCP-1,从而上调其趋化功能,在牙周炎与心血管疾病的相关性中可能发挥作用。     

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目的 探讨牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)W83、ATCC33277刺激人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)分泌基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)的变化.方法 本研究于2010年9月至2011年6月在中国医科大学口腔医学院中心实验室进行.将P.gingivalis W83、ATCC33277作用于HPDLFs0、6、12、24、48h后,运用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中MMP-1、TIMP-1质量浓度变化,并计算MMP-1/TIMP-1值.结果 P.gingivalis感染HPDLFs的MMP-1和TIMP-1表达均增强,并呈时间依赖性;且MMP-1/TIMP-1值明显高于未感染的对照组(P＜0.05).P.gingivalis W83感染后MMP-1/TIMP-1值明显高于P.gingivalis ATCC33277(P＜ 0.05).结论 P.gingivalis具有促进HPDLFs分泌MMP-1、TIMP-1的作用,且可造成牙周组织破坏;P.gingivalis W83降解细胞外基质的能力高于P.gingivalisATCC33277.     

基质细胞衍生因子-1/壳聚糖/β-甘油磷酸钠复合生物膜体外生物学特性的实验研究

目的 利用温敏凝胶制备基质细胞衍生因子-1(stromall cell derived factor-1, SDF-1)/壳聚糖(chitosan, CS)/β-甘油磷酸钠(β-sodium glycerphosphate, β-GP)复合生物膜并观察其体外生物学特性。方法 制备CS/β-GP溶液并添加SDF-1混匀,观察其37℃时凝胶时间的变化。将凝胶铺膜、干燥形成SDF-1/CS/β-GP复合生物膜,扫描电镜观察其形貌特征。将复合生物膜置于含细胞培养液的六孔板,静置6、12、24、36、48、60 h后提取上清液(n=3),测定溶液SDF-1浓度变化。将Transwell小室上室中加入骨髓间充质干细胞(BMSCs),下室置入复合生物膜,分为4组(n=3):M0组即对照组(CS/β-GP膜);M1、M2、M3组均为SDF-1/CS/β-GP膜组,分别含100、200、400 ng/mL SDF-1。分别于6、12、24 h对膜下细胞Giemsa染色观察和MTT法测定光密度(OD)值计算细胞增殖率。采用SPSS 19.0进行多因素方差分析。结果 CS/β-GP溶液加入一定量的SDF-1...