人子宫内膜细胞的纯化、培养方法的改进及细胞保存

目的探讨不同月经周期的人子宫内膜细胞的纯化、培养方法的改进及细胞保存方法。方法将16例人正常子宫内膜组织(其中增生期和分泌期各8例)采用0.1%胶原酶消化及二次消化,100目及400目滤网分离,腺上皮细胞根据不同月经周期差时贴壁法提纯等方法进行分离、纯化,采用0.4μm孔径的共培小室与间质上皮细胞共培养。光镜观察细胞形态,免疫荧光细胞染色鉴定细胞纯度。P1代间质上皮细胞冻存3个月后复苏。结果 15例分离、培养成功。间质细胞及腺上皮细胞纯度均可达95%以上。共培养推迟了腺上皮细胞自发凋亡时间,间质细胞在体外可稳定传代且冻存复苏不影响其活力及纯度。结论采用胶原酶二次消化法和不同的时间段选择性贴壁法可高效率、高纯度的分离出子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞,间质上皮细胞可进行冻存复苏。     

Modification of purifying and culturing methods and conservation for human endometrial cells

目的 探讨不同月经周期的人子宫内膜细胞的纯化、培养方法的改进及细胞保存方法.方法 将16例人正常子宫内膜组织(其中增生期和分泌期各8例)采用0.1％胶原酶消化及二次消化,100目及400目滤网分离,腺上皮细胞根据不同月经周期差时贴壁法提纯等方法进行分离、纯化,采用0.4 μm孔径的共培小室与间质上皮细胞共培养.光镜观察细胞形态,免疫荧光细胞染色鉴定细胞纯度.P1代间质上皮细胞冻存3个月后复苏.结果 15例分离、培养成功.间质细胞及腺上皮细胞纯度均可达95％以上.共培养推迟了腺上皮细胞自发凋亡时间,间质细胞在体外可稳定传代且冻存复苏不影响其活力及纯度.结论 采用胶原酶二次消化法和不同的时间段选择性贴壁法可高效率、高纯度的分离出子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞,间质上皮细胞可进行冻存复苏.     

体外培养子宫腺肌病在位内膜细胞促性腺激素释放激素受体的表达

目的研究促性腺激素释放激素受体(GnRH-R)在子宫腺肌病在位内膜组织中的表达,探讨GnRH-R与子宫腺肌病的关系,为临床治疗子宫腺肌病提供理论依据。方法分离腺上皮细胞及间质细胞进行体外培养,应用免疫组织化学的方法检测上述细胞中GnRH-R的表达,分析其在子宫腺肌病的表达。结果Gn-RH-R在子宫腺肌病在位内膜腺上皮细胞100%表达,增殖期和分泌期表达差异无统计学意义(P>0.05),基质细胞无表达。结论GnRH-R在子宫腺肌病在位内膜腺上皮细胞有表达,在基质细胞无表达。     

子宫内膜胎盘蛋白14和CA-125在子宫内膜异位症患者中的表达

目的 探讨子宫内膜胎盘蛋白14(PP14)及CA-125的检测在子宫内膜异位症(EM)患者的表达及临床意义.方法 50例EM患者:增生期轻型10例、重型20例,分泌期轻型10例、重型10例.选择30例正常妇女为对照:增生期15例,分泌期15例.ELISA测定血清PP14,化学发光法测定血清CA-125.分析其在EM类型和月经周期的表达差异.结果 重型EM组增生期和分泌期血清PPl4和CA-125水平均高于轻型组和对照组(P＜0.05).轻型EM组增生期血清PP14水平高于对照组(P＜0.05).血清PP14检测诊断EM的敏感度明显高于CA-125(93.3% vs.63.3%)(P＜0.05).结论 重型EM患者增生期和分泌期血清PP14和CA-125水平均明显高于轻型EM和正常妇女.血清PP14检测诊断EM的敏感度明显高于CA-125.     

促红细胞生成素在子宫内膜异位症组织中的表达及意义

目的探讨促红细胞生成素(Epo)在子宫内膜异位症(Ems)发生发展中的作用及其临床意义。方法采用免疫组织化学SP法,分别检测Epo在30例子宫内膜异位症患者的异位内膜、在位内膜及30例非子宫内膜异位症患者正常内膜组织中的表达。结果Epo染色阳性细胞主要集中于腺上皮细胞的胞浆中,周围间质细胞无明显着色。异位内膜和在位内膜的表达明显高于正常内膜(P<0.01);异位内膜和在位内膜的表达差异无统计学意义(P>0.05);增生期和分泌期比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论Epo可能在子宫内膜异位症的发生发展中起着重要作用。     

基于在位和异位内膜Bcl-w蛋白表达的子宫内膜异位症机制探讨

目的 探讨凋亡抑制基因Bcl-w在子宫内膜异位症的发生发展中的作用.方法 采用免疫组织化学染色法(SP法)检测凋亡抑制基因Bcl-w分别在正常子宫内膜组织、子宫内膜异位症患者的异位内膜组织和在位内膜组织中的表达水平.结果 Bcl-w在子宫内膜的腺上皮细胞和间质细胞中均有表达,以腺上皮细胞浆中表达明显,偶有细胞膜和细胞核表达.异位子宫内膜组和在位子宫内膜组Bcl-w的表达高于正常子宫内膜组,差异有统计学意义(均P＜ 0.01);Bcl-w在异位子宫内膜组的表达高于在位子宫内膜组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 凋亡抑制基因Bcl-w在子宫内膜异位症的发生发展中起着很重要的作用.     

子宫内膜异位症患者在位子宫内膜Fas、FasL的表达及其意义

目的检测子宫内膜异位症患者在位子宫内膜Fas及其配体(FasL)的表达,探讨其在子宫内膜异位症发生机制中的作用.方法采用免疫组织化学法(SP法)对45例盆腔子宫内膜异位症和44例壁间型子宫肌瘤患者在位子宫内膜进行Fas、FasL表达检测.结果(1)对照组Fas、FasL主要表达于子宫内膜腺上皮细胞胞浆和/或胞膜.增生期Fas、FasL表达显著低于分泌期(P＜0.05).(2)子宫内膜异位症组Fas、FasL亦主要表达于子宫内膜腺上皮细胞胞浆和/或胞膜.增生期与分泌期Fas、FasL表达差异无显著意义.(3)与对照组比较,子宫内膜异位症组分泌期Fas、FasL表达显著低于对照组(P＜0.05).结论子宫内膜周期性生理变化与Fas及其配体的表达水平改变有关.子宫内膜异位症在位子宫内膜分泌期凋亡敏感性降低.推测这种具有抗凋亡活性的子宫内膜细胞逆流至盆腹腔后,因其Fas低水平表达,得以逃避机体免疫清除系统的影响而在异位存活、种植,为子宫内膜异位症的发生创造了先决条件.     

子宫内膜异位症患者在位于宫内膜Fas、FasL的表达及其意义

目的 检测子宫内膜异位症患者在位子宫内膜Fas及其配体（FasL)的表达,探讨其在子宫内膜异位症发生机制中的作用。方法 采用免疫组织化学法（SP法）对45例盆腔子宫内膜异位症和44例壁间型子宫肌瘤患者在位于宫内膜进行了Fas、FasL表达检测。结果 （1）对照组Fas、FasL主要表达子宫内膜腺上皮细胞浆和／或胞膜。增生期Fas、FasL表达显著低于分泌期（P＜0．05）。（2）子宫内膜异异位症组Fas、FasL亦主要表达于子宫内膜腺上皮细胞包浆和／或胞膜。增生期与分泌箕期Fas、FasL表达差异无显著意义。（3）与对照组比较,子宫内膜异位症组分泌期Fas、FasL表达显著低于对照组（P＜0．05）。结论 子宫内膜周期性生理变化与Fas及其配体的表达水平改变有关。子宫内膜异位症在位子宫内膜分泌期凋亡敏感性降低。推测这种具有抗凋亡活性的子宫内膜细胞逆流至盆腹腔后,因其Fas低水平表达,得以逃避机体免疫清除系统的影响而在异位存活、种植,为子宫内膜异位症的发生创造了先决条件。     

微RNA-125b靶向调控M2型丙酮酸激酶影响宫颈癌SiHa细胞机制验证

目的探讨宫颈癌细胞中微RNA(miR)-125b和M2型丙酮酸激酶(PKM2)的表达以及miR-125b对PKM2基因的调控作用,从而确定miR-125b下游调控的靶基因,阐明其在宫颈癌发生发展中可能的分子机制。方法培养宫颈癌SiHa细胞及正常上皮细胞(293T细胞),利用细胞转染技术过表达或沉默miR-125b。实验分为实验组:miR-125b mimics(M组)、miR-125b inhibitor(I组);阴性对照组:miR-125b mimics negative con-trol(MNC组)、miR-125b inhibitor negative control(INC组);空白对照组(B组):未进行转染。采用实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测各组细胞中miR-125b的含量。采用免疫荧光及蛋白质印迹法检测各组细胞中PKM2蛋白的表达。结果与293T细胞相比,宫颈癌SiHa细胞中miR-125b的表达下调(0.82±0.05)(P<0.05),PKM2表达上调(3.4±0.5)倍(P<0.05)。SiHa细胞转染成功后,免疫荧光检测miR-125b模拟物组表达PKM2蛋白的细胞数目(1.0±0.7)低于模拟物阴性对照组表达PKM2蛋白的细胞数目(3.6±0.5)(P<0.05);miR-125b抑制物组中表达PKM2蛋白的细胞数目(6.0±0.7)高于抑制物阴性对照组表达PKM2蛋白的细胞数目(3.6±1.3)(P<0.05)。蛋白质印迹法检测miR-125b模拟物组的PKM2蛋白相对表达量(0.239±0.042)低于模拟物阴性对照组的PKM2蛋白相对表达量(0.314±0.018)(P<0.05);miR-125b抑制物组的PKM2蛋白表达水平(0.40±0.03)高于抑制物阴性对照组的PKM2蛋白表达水平(0.34±0.04)(P<0.05)。结论与正常上皮细胞相比,宫颈癌SiHa细胞中miR-125b表达下调,而PKM2蛋白表达上调;宫颈癌细胞中miR-125b表达下调可能会通过增加PKM2的表达,从而增强其糖酵解作用,促进肿瘤的生长。     

EM患者子宫内膜组织的ESCs中miR-539表达水平及其靶向MMP-9对ESCs侵袭和迁移的影响

目的 探究子宫内膜异位症（EM）患者子宫内膜组织的子宫内膜基质细胞（ESCs）中miR-539表达水平, 以及miR-539靶向基质金属蛋白酶9（MMP-9）对ESCs侵袭和迁移的影响。方法 收集60例EM患者子宫内膜异位 组织及47例正常子宫内膜组织,分离ESCs原代培养,实时荧光定量PCR检测miR-539和MMP-9 mRNA表达水平, 并采用双荧光素酶报告基因检测其靶向关系。利用Lipofectamine 3000试剂转染ESCs,并将其分为miR-539 mimics 组、mimics NC组、miR-539 inhibitors组和inhibitors NC组。CCK-8检测各组细胞增殖情况;划痕实验检测细胞迁移; Transwell检测细胞侵袭;Western blot法检测各组细胞中MMP-9蛋白表达水平。结果 EM组miR-539 mRNA水平 显著低于对照组,MMP-9 mRNA水平显著高于对照组（P＜0.05）。双荧光素酶报告实验结果显示miR-539与MMP-9 具有明显的靶向关系（P＜0.05）。与mimics NC组相比,miR-539 mimics组ESCs细胞增殖、划痕愈合率、侵袭细胞数 量及MMP-9蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）;与inhibitors NC组相比,miR-539 inhibitors组ESCs细胞增殖、划痕 愈合率、侵袭细胞数量及MMP-9蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）。结论 miR-539可靶向调节MMP-9表达水 平,影响ESCs的增殖、迁移和侵袭。     

miR-301b在调节脂肪细胞分化中的作用

摘要： 目的 研究 miR-301b 在调节间充质干细胞向脂肪细胞分化过程中的作用。方法 对小鼠骨髓基质细胞 ST2 进行脂肪细胞诱导分化, 并利用 qRT-PCR 检测细胞分化过程中成脂分化诱导组相对于阴性对照组的 miR-301b 表达变化。对 ST2 细胞转染 miR-301b mimics 并进行成脂诱导分化, 利用 qRT-PCR 和 Western blot 技术检测 miR- 301b mimics 转染组和阴性对照片段 （NC） 转染组细胞的脂肪特异性基因和蛋白表达水平的变化。结果 成脂分化诱导组 miR-301b 相对表达水平 （0.219±0.021） 较对照组 （1.000±0.425） 减少 （P＜0.05）。miR-301b mimics 转染组的脂肪细胞特异性转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体 （PPARγ）、 CCAAT 增强子结合蛋白 （C/EBPα） 和脂肪型脂肪酸结合蛋白 （aP2） 的相对表达量均较 NC 转染组降低 （P＜0.05）。miR-310b mimics 转染组与 NC 转染组相比, 标志基因aP2、 转录因子PPARγ 和C/EBPα 蛋白的表达量均减少 （P＜0.05）。结论 miR-301b可抑制脂肪细胞分化。     

稳定过表达miR-125b对乳腺癌MCF-7细胞转移能力的影响

目的：通过构建稳定表达miR-125b的真核表达载体以探讨miR-125b对乳腺癌MCF-7细胞转移能力的影响。方法：构建重组质粒pSilencer 4．1-miR-125b并转染MCF-7细胞,通过G418筛选得到稳定过表达miR-125b的乳腺癌细胞系MCF-7-miR—125b,并结合二维划痕愈伤实验、三维Transwell侵袭小室实验和集落形成实验考察过表达miR-125b对乳腺癌细胞系转移能力的影响。结果：成功获得了稳定过表达miR-125b的乳腺癌细胞系MCF-7-miR-125b,其在二维和三维水平的迁移能力均明显强于MCF-7细胞,细胞新生克隆数较MCF-7亦有显著提高。结论：miR—125b可使乳腺癌细胞转移能力增强。     

microRNA-125b在脓毒症急性肺损伤中的表达及其与炎症因子水平相关性

摘要：目的探讨microRNA-125b（miR-125b）在脓毒症急性肺损伤中的表达及其与炎症因子的相关性。方法 腹腔注射脂多糖（LPS）诱导急性肺损伤大鼠模型,对照组注射等量的生理盐水（n=20）;各模型组（n=20）大鼠注射LPS 4、8、12及24 h后取其肺组织,HE染色观察病理学变化;PCR检测各组各时点肺组织中miR-125b、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与白细胞介素-6（IL-6）变化。Pearson相关性分析实验组肺组织中miR-125b的表达与TNF-α、IL-6水平的相关性。NR8383细胞培养后分组,对照组不进行LPS刺激,实验组加入LPS刺激4 h、8 h、12 h及24 h时收集细胞,检测各组miR-125b、TNF-α与IL-6的含量变化。另NR8383细胞设3组,阴性对照组只转染空表达质粒,miR-125b mimic组转染miR-125b mimic表达质粒,miR-125b inhibitor组转染miR-125b inhibitor质粒。PCR测各组细胞中miR-125b 表达情况,Western blot测Notch1的表达情况。结果LPS各处理组大鼠模型肺组织严重出血、水肿及大量炎症细胞浸润。与对照组比较,在注射LPS 4、8、12以24 h后,实验组大鼠肺组织中miR-125b显著降低;而肺组织中TNF-α与IL-6水平则升高,其中在LPS注射4 h后,TNF-α与IL-6的表达水平达到峰值（P＜0.05）。实验组肺组织中miR-125b的表达与TNF-α及IL-6呈负相关（r 分别为-0.599、-0.580;P＜0.05）。在LPS诱导的第4、8、12、24 h,实验组NR8383细胞系miR-125b表达水平均低于对照组,而TNF-α、IL-6的表达水平均高于对照组（P＜0.05）。与阴性对照组比较,miR-125b mimic组miR-125b 相对表达量升高、Notch1蛋白相对表达量则降低（P＜0.05）,miR-125binhibitor组miR-125b 相对表达量降低、Notch1蛋白相对表达量升高（P＜0.05）;与miR-125b mimic组比较,miR-125binhibitor组miR-125b 相对表达量降低、Notch1蛋白相对表达量升高（P＜0.05）。结论在脓毒症急性肺损伤中,microRNA-125b可能通过调控Notch1蛋白的表达,影响炎症因子TNF-α与IL-6的表达,参与其免疫炎症调控过程。     

miR-15a在子宫内膜癌组织中的表达变化及临床意义

目的 探讨miR-15a在子宫内膜癌组织中表达变化及临床意义,分析miR-15a在子宫内膜癌发生发展过程中的可能机制.方法 通过荧光定量PCR法测定68例子宫内膜癌组织和68例癌旁组织的miR-15a表达情况;分别将无关序列模拟物(非转染组)、miR-15a模拟物(转染组)转染入RL95-2人子宫内膜癌细胞,设立阴性对照组,比较3组的miR-15a和基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达情况;并通过Transwell肿瘤细胞侵袭试验和Transwell肿瘤细胞迁移试验检测RL95-2细胞的侵袭力和迁移能力.结果 子宫内膜癌组织miR-15a相对表达量明显低于癌旁组织(P<0.05);miR-15a相对表达量与子宫内膜癌患者的FIGO分期、淋巴结转移、肌层浸润程度、分化程度相关(P<0.05);转染组miR-15a相对表达量明显高于未转染组和对照组,MMP-2相对表达量明显低于未转染组和对照组(P<0.05);转染组侵袭力与迁移力均明显低于未转染组和对照组(P<0.05).结论 在子宫内膜癌患者中miR-15a以低表达为主,且与淋巴结转移、分化程度、肌层浸润程度、FIGO分期有关,miR-15a作为抑癌基因可能是通过抑制MMP-2蛋白发挥抑制癌细胞转移及侵袭的作用.     

MicroRNA-mediated suppression of P-glycoprotein by quantum dots in lung cancer cells

The interactions between adenosine triphosphate-binding cassette (ABC) transporters and nano-sized materials are attracting increasing attention, due to their great potential in overcoming the multidrug resistance (MDR) phenomena in cancer treatment. However, the inner mechanisms involved in the interactions are largely unknown. In this study, two commercial quantum dots (QDs), CdSe/ZnS-MPA and CdSe/ZnS-GSH, were tested for their interactions with P-glycoprotein (P-gp), as well as the relating mechanisms in lung cancer (A549) cells. Both QDs significantly suppressed the gene and protein expressions of P-gp in A549 cells. To explain this, the gene expressions of nine relating microRNAs (miRNAs) were evaluated. The results indicated a shared up-regulation of miR-34b and miR-185 by both QDs. Furthermore, mimics and inhibitors of miR-34b and miR-185 significantly enhanced and suppressed the gene and protein expressions of P-gp, respectively, confirming the modulatory function of these two miRNAs on P-gp. Interestingly, expressions of both miRNAs were suppressed during treatment with Cd²⁺ and doxorubicin, which induced the expression of P-gp, indicating the universality of these miRNAs-related mechanisms. Thus, as miR-34b and miR-185 participated in the suppression of P-gp functions in A549 cells they could be interesting targets for the treatment of lung cancer.     

miR-539增强顺铂对非小细胞肺癌耐药株的杀伤作用研究

目的 研究miR-539对顺铂诱导的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)耐药细胞株凋亡的影响.方法 通过荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测NSCLC细胞系和人正常支气管上皮细胞16HBE中miR-539表达情况;通过转染miR-539建立miR-539过表达细胞系,观察miR-539过表达对顺铂抑制NSCLC细胞生长率的影响,检测细胞凋亡水平及相关基因的表达.结果 NSCLC细胞系中miR-539表达水平低于人正常支气管上皮细胞(P<0.01).阴性对照组培养48、72、96 h NCI-H460细胞增殖率均明显低于空白对照组,转染miR-539组培养不同时间NCI-H460细胞增殖率均明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01).阴性对照组和转染miR-539组NCI-H460细胞凋亡率高于空白对照组(P<0.05).阴性对照组和转染miR-539组的Bcl-2、Bcl-xL基因表达量均低于空白对照组,且转染miR-539组低于阴性对照组,而Bim、Bax、P53、Myc基因表达量高于空白对照组,且转染miR-539组高于阴性对照组(P<0.05,P<0.01).结论 miR-539能够增强顺铂对NSCLC耐药细胞株的杀伤作用,可作为NSCLC基因治疗的有效靶点.     

microRNA-103b在急性淋巴细胞白血病患者中的表达及意义

目的：微小RNA（ microRNA,miRNA）是一类长度为21-25nt的内源性单链非编码RNA小分子。本研究旨在探讨miR-103b在急性淋巴细胞白血病（ ALL）中的表达及临床意义。方法用实时定量聚合酶链反应（ qRT-PCR）技术检测80例初诊ALL患者和20例正常人骨髓单个核细胞标本中miR-103b的相对表达量,并与患者临床资料进行相关性分析。结果 miR-103b在ALL患者中的相对表达量高于正常对照组（ P ＜0创．05）,但其在急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）及急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）中的表达水平差异无统计学意义（ P ＞0．05）,miR-103b的表达与是否存在bcr-abl融合基因及其mRNA的表达水平无相关性（ P ＞0．05）。结论 miR-103b在ALL患者中表达上调,可作为临床诊断ALL的潜在分子标记物,bcr-abl融合基因的表达对miR-103b在ALL中的表达无明显影响。