细菌脂多糖对破骨细胞发育的抑制作用研究

目的:寻找调节破骨细胞分化成熟的途径.方法:采用细胞核因子-KB受体活化因子配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)体外诱导骨髓单核细胞分化为成熟破骨细胞的培养方法,在培养体系中加入不同浓度细菌脂多糖(LPS),用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察成熟破骨细胞形成情况;实时定量RT-PCR检测LPS处理后破骨细胞前体表达核因子-κB受体活化因子(RANK)和M-CSF受体mRNA.结果:LPS不能刺激骨髓单核细胞形成TRAP阳性的破骨细胞;减少了RANKL诱导的TRAP阳性破骨细胞形成数量;0.2ng/ml和20ng/ml LPS降低了30％和90％RANKL诱导TRAP阳性细胞形成数量(与未加LPS组比较,均P＜0.01);降低破骨细胞前体表达RANK和M-CSFR mRNA.结论:LPS能够抑制RANKL诱导的破骨细胞分化成熟,抑制破骨细胞前体表达RANK和M-CSFR,能够阻断其向成熟分化.     

电离辐射对破骨细胞分化过程中RANK表达的影响及其致骨损伤的分子机制

目的：研究电离辐射对破骨细胞分化过程中核因子κB受体活化因子(RANK) mRNA和蛋白表达的影响,探讨辐射导致骨损伤的分子机制。方法：采用50 μg•L-1 核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞。RQW264.7细胞分为对照组(未处理)、RANKL处理组(50 μg•L-1RANKL处理)、照射处理组(2 Gy γ射线照射)、照射联合RANKL处理组(50　μg•L-1RANK处理+2 Gy γ射线照射)。采用抗酒石酸磷酸酶(TRAP）染色法检测各组破骨细胞的分化状态;采用PCR法检测各组细胞中RANK mRNA的表达水平;采用Western blotting法检测各组细胞中RANK蛋白的表达水平。 结果：RAW264.7细胞经过RANKL诱导7 d后,TRAP染色呈现阳性,表明已经成功分化成为破骨细胞。与对照组比较,RANKL处理组和照射处理组破骨细胞前体细胞中RANK mRNA和蛋白的表达水平上调（P<0.05）;与RANKL处理组比较,照射联合RANKL组破骨细胞前体细胞中RANK mRNA和蛋白表达水平降低（P<0.05）。结论：电离辐射可以促进破骨细胞前体细胞的增殖和成熟,增加其活性,但是对破骨细胞的增殖、成熟与活性却有一定的抑制作用。
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核因子κB受体活化因子在破骨细胞培养中表达时相的研究

目的本研究旨在观察核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factorκB,RANK)在破骨细胞培养中的表达时相。方法采用巨噬细胞集落刺激因子(macrophages colony-stimulating factor,M-CSF)及核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)作为分化诱导因子,诱导大鼠骨髓造血干细胞分化为破骨细胞,RT-PCR检测诱导分化不同时间点(0,3,5,7 d)破骨细胞膜表面RANK mRNA的表达水平。结果 RT-PCR检测结果显示RANK mRNA表达在培养0 d为1.20±0.47,3 d为1.52±0.58,5 d为1.59±0.57,7 d为1.69±0.51。诱导分化后表达量随培养时间延长而增加,各时间点与培养前比较均有统计学差异(P<0.05)。结论在破骨细胞分化的各个时间段RANK均有表达,是体外研究不同因素影响破骨细胞分化及活化的一个特异性指标。     

橄榄苦苷对破骨细胞的分化以及骨吸收功能的影响

目的 探讨橄榄苦苷(oleuropein)对破骨细胞分化成熟以及骨吸收功能的影响及其可能机制.方法 把不同浓度的橄榄苦苷(12.5、25、50 μmol/L)分别加入由核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL)诱导的体外破骨细胞培养体系中,用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resist ant acid phosphatase,TRAP)染色方法观察呈TRAP阳性的多核细胞;RAW264.7细胞也用RANKL诱导,用流式细胞仪分析橄榄苦苷对破骨细胞凋亡的影响;在扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)下观察骨吸收陷窝,并用图像分析软件统计其面积.采用Western blot法检测橄榄苦苷对破骨细胞特异性蛋白组织蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)、激活T细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells 1,NFATC1)及相关信号通路蛋白表达的影响.结果 TRAP染色结果显示,橄榄苦苷能显著抑制RANKL诱导的破骨细胞的形成,且呈浓度依赖性(P＜0.05);橄榄苦苷能下调破骨细胞特异性蛋白CTSK的蛋白表达水平(P＜0.05);橄榄苦苷对破骨细胞的凋亡无明显影响(P＞0.05);橄榄苦苷能显著减少骨吸收陷窝的面积(P＜0.05);橄榄苦苷能够下调NFATC1及磷酸化p38(p-p38)的表达(P＜0.05).结论 橄榄苦苷可以抑制由RANKL诱导的破骨细胞分化以及破骨细胞的骨吸收功能,可能和橄榄苦苷能够下调p38/MAPK信号通路有关.     

唑来膦酸对破骨细胞分化中钙调蛋白､钙调磷酸酶表达的影响

目的:探讨唑来膦酸(zoledronate,ZOL)对破骨细胞分化中钙调蛋白(calmodulin)和钙调磷酸酶(calcineurin)基因表达的影响?方法:小鼠RAW264.7细胞分为A?B两组,均用100 ng/mL核因子κB受体激活蛋白配体(RANKL)诱导4 d;B组细胞在RANKL 诱导第2天加入1×10-6 mol/L ZOL处理48 h?RANKL 诱导4 d后收获细胞,检测破骨细胞生成及calmodulin?calcineurin基因表达情况?结果:B组多核破骨细胞数?吸收陷窝数目及面积分别为(8.8 ± 2.3)个?(6.7 ± 1.2)个和(997.1 ± 14.8)μm2,均显著低于A组的(19.7 ± 2.9)个?(13.3 ± 1.5)个和(1 676.9 ± 24.9) μm2(P < 0.01)?B组calmodulin mRNA及蛋白水平较A组分别降低了51.0%和78.7%(P < 0.05),calcineurin则分别下降了37.0%和69.5%(P < 0.01)?免疫荧光细胞化学显示,B组calmodulin?calcineurin的荧光强度较A组也明显下降?结论:ZOL可显著抑制破骨细胞生成,并下调破骨细胞分化中calmodulin和calcineurin的mRNA和蛋白水平,而calmodulin?calcineurin可能参与了ZOL对破骨细胞形成和功能的抑制?     

阿仑膦酸钠对人工关节磨损微粒刺激破骨细胞分化形成的影响

目的:观察二磷酸盐类药物阿仑膦酸钠对人工关节磨损微粒刺激破骨细胞分化形成的影响,探讨二磷酸盐防治人工关节无菌性松动的可能机制.方法:体外用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导小鼠骨髓造血干细胞分化为破骨前体细胞(osteoclast precursors,OCPs),然后用核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)和M-CSF两种细胞因子协同诱导OCPs向成熟破骨细胞分化,同时在培养体系中加入高分子聚乙烯微粒(103/ml)和不同浓度的阿仑膦酸钠(0.4、2.0、10.0、50.0 μg/ml),对获得的各组破骨细胞行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色计数阳性破骨细胞(核≥3)的数目;提取总RNA用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TRAP mRNA的表达.结果:高分子聚乙烯微粒组TRAP阳性破骨细胞数目和TRAP mRNA的表达显著高于空白对照组(P＜0.05);阿仑膦酸钠组TRAP阳性破骨细胞数目和TRAP mRNA的表达均显著低于高分子聚乙烯组(P＜0.05),且随着阿仑膦酸钠浓度增高TRAP阳性破骨细胞数目和TRAP mRNA的表达呈递减趋势,组间差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:阿仑膦酸钠可以抑制人工关节磨损微粒刺激破骨细胞分化形成.     

唑来膦酸对破骨细胞分化中CaMKⅡδ及下游基因表达的影响

目的 研究唑来膦酸(ZOL)对破骨细胞分化中钙调蛋白依赖性激酶Ⅱδ(CaMKⅡδ)以及下游信号基因表达的影响.方法 将小鼠破骨前体细胞RAW264.7细胞分为对照组和ZOL组;两组细胞均用50 μg/L核因子κB受体激活蛋白配体(RANKL)诱导与第5天收获,ZOL组同时加用1×10-6mol/L ZOL处理2d.5d后收获细胞,检测破骨细胞生成及CaMKⅡδ、活化T细胞核因子蛋白c1(NFATc1)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)及c-Src基因表达情况.结果 ZOL组TRAP+多核破骨细胞数目、牙本质吸收陷窝数目和面积分别是(20.0±3.2)、(18.0±4.2)和(6 335.3士1 043.2)μm2,显著低于对照组的(36.0±8.4)、(37.2±5.0)和(11 636.2±3 661.1)μtm2(P＜0.05或P＜0.01),分别下降了44.4％、51.6％和45.6％.ZOL处理还使破骨细胞分化中CaMKⅡδ及下游因子NFATc1、TRAP和c-Src基因表达产生显著抑制,mRNA水平分别下降了44.1％、49.0％、53.8％和49.6％(P＜0.05或P＜0.01),蛋白水平分别下降了43.5％、32.2％、45.5％和48.0％(P＜0.05或P＜0.01).免疫荧光化学检测显示ZOL组CaMKⅡδ、NFATc1、TRAP和c-Src的荧光强度较对照组也明显减弱.结论 ZOL可显著抑制破骨细胞生成和骨吸收功能,并下调破骨细胞分化中CaMKⅡδ及下游NFATc1、TRAP和c-Src基因表达.     

两种不同细胞培养方法对破骨细胞分化及Notch2基因表达的影响

目的:探讨两种不同培养方法对体外破骨细胞分化的影响,分析破骨细胞分化过程中的关键信号Notch2分子的mRNA和蛋白表达水平的差异,为进一步破骨细胞功能实验奠定基础。方法:单独培养:从4周龄的小鼠腿骨骨髓腔分离骨髓细胞,巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和破骨细胞生成因子(RANKL)诱导大鼠骨髓细胞形成破骨细胞;共培养:从4周龄的小鼠大腿骨骨髓腔分离骨髓细胞,与原代成骨细胞共培养,VitD3和前列腺素E2(PGE2)诱导。对获得的破骨细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色和细胞计数,并测定破骨细胞分化过程中的关键信号Notch2分子的mRNA和蛋白表达水平。结果:两种培养方法获得的破骨细胞均为TRAP染色阳性的多核巨细胞;共培养方法得到的破骨细胞数目为(240±36)个/孔,而单独培养法为(160±23)个/孔。共培养组Notch2分子mRNA表达水平为4.1±1.2,单独培养组为2.4±0.6,共培养组高于单独培养组(P<0.05),共培养组Notch2蛋白表达水平亦高于单独培养组。结论:与通过RANKL和M-CSF诱导破骨细胞分化的培养方法相比,利用成骨细胞和破骨前体共培养可诱导出更多的破骨细胞和高水平的Notch2表达。培养方法影响破骨细胞的数量和Notch2基因的表达水平。     

白细胞介素29抑制破骨细胞分化的研究

目的:新型细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-29具有抗病毒?抗肿瘤?免疫调节等作用,但其在破骨细胞分化中的作用尚未见报道?本研究探讨IL-29对核因子κB受体活化因子配基(receptor activation of nuclear-κB ligand,RANKL)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7(破骨前体细胞)向破骨细胞分化的作用?方法:流式检测IL-29特异性受体IL-28Rα在RAW264.7细胞表面的表达,CCK8法检测IL-29对RAW264.7细胞增殖的影响?不同浓度IL-29重组因子加入到RANKL诱导的RAW264.7向破骨细胞分化的体系中,5 d后通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色检测IL-29对破骨细胞数目的影响?实时荧光定量PCR检测IL-29对破骨细胞标志性基因TRAP?CTR?CTSK及相关基因TRAF6?RANK表达的影响?结果:IL-29呈剂量依赖性抑制RANKL诱导的RAW264.7中破骨细胞的形成,100 ng/mL IL-29可显著抑制破骨细胞的形成以及破骨细胞形成相关基因TRAP?CTR?CTSK?TRAF6?RANK的表达?结论:本研究首次证实IL-29可以抑制破骨细胞形成及其功能?     

晚期糖基化终末产物对破骨细胞分化不同阶段的影响

目的 探究晚期糖基化终末产物（AGEs）对破骨细胞分化不同阶段的影响。方法 利用核因子κB受体活化因子配体（RANKL）于体外诱导小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞进行破骨细胞向分化,通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色确定破骨细胞分化的不同阶段,并将细胞随机分为对照组、分化早期阶段干预组、分化晚期阶段干预组;用CCK-8法检测AGEs作用下的细胞活性;破骨细胞向诱导完成后进行TRAP染色,以RT-PCR 检测RANK、NFATC-1、TRAF-6、TRAP、CTSK的mRNA表达,以Western blot检测CTSK及RANK的蛋白表达。结果 将Raw264.7细胞破骨细胞向分化的前3 d划分为细胞分化早期阶段,之后为细胞分化晚期阶段;100 mg/L的AGEs对Raw264.7细胞的生长无明显影响;早期阶段干预组及晚期阶段干预组的TRAP染色阳性细胞数量均多于对照组,早期阶段干预组与对照组的差异具有统计学意义（P<0.05）;早期阶段干预组及晚期阶段干预组的RANK、NFATC-1、TRAF-6、TRAP、CTSK的mRNA表达均多于对照组,早期阶段干预组与对照组的差异具有统计学意义（P< 0.05）;CTSK及RANK的蛋白表达趋势与相关mRNA表达变化趋势一致。结论 AGEs可能对破骨细胞分化的不同阶段产生不同影响,AGEs于破骨细胞分化早期阶段加入对其分化的促进作用比在晚期阶段加入更明显。     

藁本内酯抑制RANKL诱导RAW264.7向破骨细胞分化及其与GPER相关机制

目的 观察藁本内酯(LIG)对核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导RAW264.7向破骨细胞分化的影响,并探讨该作用与G蛋白偶联雌激素受体(GPER)的相关机制.方法 体外培养RAW264.7细胞,RANKL诱导破骨细胞分化,并用LIG进行干预.通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性检测和TRAP染色法评价破骨...     

NFATc1过表达对唑来膦酸诱发的破骨细胞生成抑制的影响

目的 研究活化T细胞核因子蛋白c1(NFATc1)过表达对唑来膦酸诱发的破骨细胞生成抑制的挽救效应.方法 小鼠NFATc1重组慢病毒转染RAW264.7细胞,验证NFATc1蛋白表达.细胞分为A、B两组,分别转染空白载体和NFATc1重组载体.两组细胞均用50 ng/mL核因子κB受体激活蛋白配体(RANKL)诱导5 d,并在第2天加入1×10-6 mmol/mL 唑来膦酸作用2 d.第6天收获细胞,检测破骨细胞的生成和功能及NFATc1、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、酪氨酸激酶(c-Src)基因的表达情况.结果 NFATc1蛋白在细胞中均有表达.B组TRAP阳性破骨细胞数、牙本质吸收陷窝数目和面积显著高于A组(P<0.01).B组NFATc1、TRAP、c-Src的蛋白水平显著高于A组(P<0.01);B组3个基因mRNA水平显著高于A组(P<0.01).免疫荧光细胞化学检测也得到相似的结果.结论 NFATc1过表达对唑来膦酸诱发的破骨细胞生成及NFATc1、TRAP、c-Src基因表达的抑制具有挽救效应;NFATc1作为Ca2+信号的关键分子,在唑来膦酸诱发的破骨细胞生成抑制中起着关键作用.     

羧甲基赖氨酸对人外周血单核细胞破骨样转化的影响

目的：探讨羧甲基赖氨酸（ CML）对外周血单核细胞破骨样转化的影响。方法：从外周血分离提取单核细胞,分为3组：细胞核因子κB受体活化因子配基（ RANK-L）＋巨噬细胞集落刺激因子（ M-CSF）诱导组（ A组）,CML＋RANK-L＋M-CSF干预组（ B组）,空白对照组（ C组）。利用RANK-L和M-CSF诱导其破骨样转化,每天通过倒置显微镜观察细胞生长形态及计算细胞核个数,培养8d后通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色法观察破骨样细胞的形成,Western blotting 检测破骨细胞标志物组织蛋白酶K蛋白表达。结果：随着培养时间的延长,A组TRAP阳性多核细胞数明显增加,B组TRAP阳性多核细胞数较A组明显减少（P＜0．05）,B组组织蛋白酶K表达亦较A组明显降低（P＜0．05）。结论：CML能够抑制外周血单核细胞向破骨样细胞转化。     

抗坏血酸抑制核因子κB受体活化子配体诱导RAW264.7细胞的分化和功能

目的研究抗坏血酸对核因子κB受体活化子配体(RANKL)诱导体外培养的破骨前体细胞RAW2647形成成熟多核破骨细胞的影响,探讨抗坏血酸在破骨前体细胞分化中的作用及机制。方法利用不同浓度的抗坏血酸与RANKL单独或共同处理RAW2647细胞,MTT法测定细胞增殖,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法观察TRAP阳性多核细胞,逆转录聚合酶链反应(RTPCR)测定破骨细胞表型基因和功能基因的表达,Western印迹方法检测碳酐酶Ⅱ基因蛋白表达,破骨细胞的骨吸收功能用骨吸收陷窝面积计数法分析。结果抗坏血酸和RANKL都抑制RAW2647细胞的增殖(P<005),但它们之间无协同作用。抗坏血酸本身不能诱导RAW2647细胞形成破骨细胞,但可抑制RANKL诱导的TRAP阳性多核破骨细胞形成(P<005)。抗坏血酸下调RANKL诱导的碳酐酶Ⅱ和RANK基因mRNA表达及碳酐酶Ⅱ基因蛋白表达,抑制骨吸收功能(P<005)。结论抗坏血酸能直接抑制RANKL诱导的破骨细胞形成和功能。     

吡格列酮对单核细胞RAW264.7向破骨细胞分化过程中核因子κB受体活化因子的影响

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)在破骨细胞分化过程中的作用及机制.方法 将小鼠单核细胞RAW264.7分为正常对照组、核因子κB受体活化子配体(RANKL)诱导组(使用30μg/L的RANKL诱导RAW264.7向破骨细胞分化)和吡格列酮刺激组(在使用30 μg/L的RANKL诱导破骨细胞分化的同时给予10μmol/L的吡格列酮刺激,持续至分化全程),待破骨细胞分化成熟以后进行破骨细胞染色、计数,并利用实时定量PCR检测单核细胞向破骨细胞分化过程中核因子κB受体活化子(RANK)的mRNA表达量.结果 吡格列酮抑制单核细胞RAW264.7向破骨细胞分化,吡格列酮组的破骨细胞数目(176±58)个/cm2明显低于RANKL诱导组(322±74)个/cm2,差异有统计学意义(P＜0.01);吡格列酮抑制单核细胞RAW264.7分化过程中RANK的mRNA表达量,对照组(1.13±0.26);吡格列酮组(2.16±0.74)明显低于RANKL诱导组(4.94±0.39),差异有统计学意义(P＜0.01).结论 吡格列酮抑制了单核细胞RAW264.7向破骨细胞的分化,这可能与PPARγ激动剂下调了RANK的表达,进一步抑制破骨细胞分化有关.