大鼠牙源性细胞复合nHAC/PLA支架的体外生物相容性研究

目的：探讨大鼠牙源性上皮细胞（rDECs）、牙源性间充质细胞（rDMCs）分层复合纳米羟基磷灰石-胶原/聚乳酸（nHAC/PLA）支架共生长的生物相容性.方法：①.应用酶消化法和差速消化法分离培养rDECs和rDMCs,经cytokeratin、vimentin免疫荧光染色鉴定其来源.②.应用扫描电镜观测rDECs、rDMCs分层复合nHAC/PLA支架后的生物相容性.结果：①.成功分离培养、鉴定大鼠牙源性上皮细胞和间充质细胞,免疫荧光染色鉴定rDECs、rDMCs分别表达cytokeratin、vimentin,证明rDECs、rDMCs分别来源于牙源性上皮组织、中胚层间充质.②.扫描电镜显示：rDECs、rDMCs复合nHAC/PLA共培养5d后,椭圆形的rDECs和长梭形的rDMCs胞体充分伸展,胞质中胶原纤维和基质分泌丰富,细胞与支架相互交织成网状.10d后,rDECs、rDMCs胞质中基质分泌更加丰富,覆盖部分细胞,并与支架相融合.结论：rDECs、rDMCs在nHAC/PLA支架上增殖、分化旺盛,具有良好的生物相容性.     

用人牙源性上皮和间充质细胞构建组织工程化牙齿样结构的实验研究

目的：以人牙源性上皮和间充质细胞作为种子细胞在裸鼠体内构建牙齿样结构。方法：将体外培养的人牙源性上皮细胞和经生长因子诱导后的牙源性间充质细胞分层接种于经塑形的陶瓷化骨或Collagraft三维支架上，将形成的细胞/支架复合物移植到免疫缺陷小鼠的皮下，建立牙源性上皮细胞复合间充质细胞的体内立体培养模型。14～18周后取材，采用HE染色、改良丽春红三色法、免疫组化和原位杂交方法检测移植物中的组织新生情况。结果：细胞在三维支架上形成了包含釉质样组织和牙本质牙髓复合体的牙齿样结构。新生的釉质样组织表达人成釉蛋白，其周围残留的牙源性上皮细胞表达人釉原蛋白mRNA。同时，人DSP蛋白在牙本质样组织中呈阳性表达。所有对照组标本中均未观察到该现象。结论：以优选出并经塑形的三维支架为载体，在裸鼠体内建立牙源性上皮细胞复合间充质细胞的立体培养模型，成功构建出组织工程化牙齿样结构。     

人牙源性间充质细胞构建牙本质-牙髓复合体样结构的实验研究

目的以复合生长因子的陶瓷化骨和Collagraft为载体建立人牙源性间充质细胞的体内立体培养模型，构建牙本质-牙髓复合体样结构。方法将经生长因子诱导的人牙源性间充质细胞接种于复合同种生长因子的陶瓷化骨和Collagraft复合材料上，将细胞-支架复合物移植到裸鼠皮下，建立牙源性间充质细胞的体内立体培养模型。4周和10周后取材，对移植物进行组织学观察和人牙本质涎蛋白（DSP）的免疫组化染色。结果10周的实验组标本中，植入细胞在复合生长因子支架上形成了较典型的牙本质-牙髓复合体样结构，人DSP在新生牙本质样组织中呈阳性表达。对照组及4周标本中未观察到此现象。结论用人牙源性间充质细胞和复合生长因子的陶瓷化骨或Collagraft支架材料在裸鼠体内可成功构建出牙本质-牙髓复合体样结构。     

猪牙源性间充质与胶原类材料复合移植的实验研究

目的：探讨经体外培养的出生后的猪牙源性间充质细胞成牙能力。方法：将体外培养第4代的猪牙胚细胞接种到胶原凝胶基质中,体外培养3d后进行裸鼠体内移植,6W后取材观察。结果：猪牙胚细胞原代培养过程中可见上皮样细胞与成纤维样细胞混杂存在,传代3次后上皮样细胞消失。细胞胶原基质复合物取材结果显示细胞聚集的区域可见牙本质-牙髓复合体样结构。结论：经体外传代培养后未经体外诱导的牙胚细胞接种到胶原凝胶基质所构建的组织工程牙齿有牙本质-牙髓复合体样结构形成,说明牙胚细胞经体外培养后其所获得的发育信息仍可保持,是研究牙齿发育构建模型及组织工程牙齿的理想的种子细胞。     

犬骨髓基质细胞复合nHAC/CSH裸鼠皮下成骨的实验研究

目的：评价纳米晶羟基磷灰石/胶原/硫酸钙(nHAC/CSH)—犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)复合物体内异位成骨能力。方法：犬骨髓基质细胞(dBMSCs)通过密度梯度离心法分离得到,与nHAC/CSH复合,构建可注射骨,扫描电镜观察细胞生长情况,并将构建的可注射组织工程骨植入裸鼠体内,4周后行HE染色观察异位骨形成情况。结果：扫描电镜观察细胞生长良好,体内研究表明,可注射组织工程骨植入裸鼠皮下4周后有类骨样结构形成。结论：nHAC/CSH复合BMSCs具有良好的成骨活性。     

活性纳米羟基磷灰石复合胶原／聚乳酸材料应用于牙槽嵴扩增的研究

目的:构建下颌牙槽嵴扩增的动物模型,并初步观察nHAC/PLA复合rhBMP-2在下颌皮质骨表面贴附式植骨的成骨能力。方法:制备AnHAC/PLA材料,将HAC/PLA、AnHAC/PLA材料分别植入新西兰兔下颌骨颊侧皮质骨表面,设计皮质骨颊侧制备沟槽的改良术式组,并与无沟槽的普通术式组对比,术后8周通过大体、X线、组织学观察来研究其牙槽骨加宽的能力。结果:AnHAC/PLA材料较nHAC/PLA材料更能良好的增加下颌骨的宽度,在皮质骨表面增加刻槽的改良术式能明显增加材料的成骨情况。结论:AnHAC/PLA材料可以有效地增加牙槽骨宽度。     

人牙源性间充质细胞体内立体培养模型的建立--构建组织工程化牙本质和牙髓组织

目的：以陶瓷化骨和Collagraft复合材料为载体建立人牙源性间充质细胞的体内立体培养模型，构建组织工程化牙本质和牙髓组织。方法：将经生长因子诱导的人牙源性间充质细胞接种于陶瓷化骨和Collagraft复合材料上，将细胞/支架复合物移植到裸鼠皮下，建立牙源性间充质细胞的体内立体培养模型。4周和10周后取材，对移植物进行组织学观察和DSP的免疫组化染色。结果：10周的实验组标本中，植入的细胞在支架上形成了不太典型的牙本质和牙髓样组织，新生的牙本质样组织和其内侧出现极化的细胞均表达人DSP。对照组和4周标本中未观察到此现象。结论：用人牙源性间充质细胞和Collagraft或CBB载体在裸鼠体内可成功构建出组织工程化牙本质和牙髓样组织。     

活性纳米羟基磷灰石复合胶原/聚乳酸材料对拔牙创早期愈合及牙槽嵴吸收影响的实验研究

目的 观察活性纳米羟基磷灰石复合胶原/聚乳酸材料(AnHAC/PLA)促进犬拔牙创早期愈合及减少牙槽嵴吸收的效果。方法 将小块状纳米羟基磷灰石复合胶原/聚乳酸材料(nHAC/PLA)、AnHAC/PLA、自体牙槽松质骨植入犬拔牙创中,并设空白对照。术后4周、8周、12周通过大体观察测量、HE染色和M asson′s三色法染色来观察比较拔牙创骨缺损的修复情况及牙槽嵴的吸收情况。结果 AnHAC/PLA材料修复拔牙创骨缺损及减少牙槽骨吸收的能力强,与自体牙槽松质骨组类似,nHAC/PLA材料的能力较弱,但明显优于空白对照组。结论 AnHAC/PLA可早期修复拔牙创,减少牙槽嵴的吸收。     

纳米羟基磷灰石复合胶原/聚乳酸材料复合兔骨髓基质细胞异位成骨的实验研究

目的：观察nHAC/PLA复合兔BMSCs的异位成骨能力.方法：通过负压吸附使BMSCs与nHAC/PLA材料复合,将nHAC/PLA＋自体BMSCs、自体BMSCs、nHAC/PLA材料分别植入新西兰兔背部肌袋内,术后4、8周通过大体、组织学观察来研究其异位成骨能力.结果：自体BMSCs组与nHAC/PLA材料组在新西兰兔背部肌袋内均无骨质形成,nHAC/PLA＋自体BMSCs组8周时有大量较成熟的骨质形成,同时材料本身部分吸收.结论：通过负压吸附的方法制备出的nHAC/PLA＋自体BMSCs具有良好的异位成骨能力.     

大鼠骨髓间充质细胞诱导成骨的体内外研究

目的研究大鼠骨髓间充质细胞(BMSCs)体内外成骨的能力。方法分离大鼠BMSCs,将原代细胞分别应用普通培养基(CM)、成骨诱导培养基(OM)诱导培养。应用碱性磷酸酶(ALP)活性和钙结节染色法检测体外成骨分化能力。建立裸鼠成骨模型,测定体内成骨能力。结果 OM组可明显诱导BMSCs成骨分化,表现出高水平的ALP活性和基质矿化能力。OM加骨粉组裸鼠培养8周后,镜下观察到广泛的新骨形成,而单纯OM组或骨粉组未见成骨。结论 OM可明显诱导BMSCs体外成骨分化,与骨粉联合应用能诱导体内异位骨形成。     

CFDA SE标记观察人成骨细胞与骨支架材料附着情况的实验研究

目的通过荧光活性染料CFDA SE标记观察人成骨细胞与nano-hydroxyapatite/collagen/Poly L-lactic acid(nHAC/PLA)骨支架材料黏附生长情况。方法用CFDASE标记人成骨细胞,接种于nHAC/PLA骨支架材料上,测定细胞的黏附率。于接种后第1、3、7天检测荧光光度,并用激光共聚焦显微镜观察细胞在支架材料上的生长状况。结果CFDASE标记的人成骨细胞的黏附率为(97.99±1.43)%,未标记的人成骨细胞黏附率为(98.57±1.17)%,两者无统计学差异(P>0.05);随时间增长,nHAC/PLA骨支架材料内的细胞数量增多,沿孔壁生长良好,但总荧光光度值未发生明显变化。结论荧光活性染料CFDASE标记不影响人成骨细胞在nHAC/PLA骨支架材料上的黏附,可作为观察人成骨细胞在nHAC/PLA骨支架材料生长情况的实验手段。     

活性纳米羟基磷灰石复合胶原聚乳酸材料异位成骨性能研究

目的：探讨既具有骨引导性又具有骨诱导性的活性纳米羟基磷灰石复合胶原/聚乳酸（AnHAC/PLA）材料的异位成骨能力,为该材料作为植骨材料应用于临床打下实验基础。方法：通过扫描电镜观察rhBMP-2与nHAC/PLA材料的复合情况,并将nHAC/PLA、rhBMP-2、AnHAC/PLA材料分别植入小鼠股后肌袋内,术后2周、6周通过X线片、组织学观察、成骨量测定来研究AnHAC/PLA的异位成骨能力。结果：rhBMP-2在nHAC/PLA孔隙中均匀分布,6周时AnHAC/PLA组诱导形成的骨量是rhBMP-2组的10.5倍。结论：AnHAC/PLA材料具有良好成骨能力,nHAC/PLA是rhBMP-2理想的缓释载体。     

新型骨支架材料复合物修复兔下颌骨缺损的实验研究

目的研究纳米羟基磷灰石／胶原／聚乳酸／富血小板血浆复合物（nHAC／PLA／PRP）在骨缺损修复过程中的成骨作用。方法制备兔下颌骨10mm×8mm贯穿性缺损．按不添加材料A组、单纯材料（nHAC／PLA）B组、活性材料（nHAC／PLA／PRP）C组加入相应材料．术后2、4、8、12周处死动物,分别从大体、影像学、扫描电镜、组织学方面进行观察．计量新骨面积并进行方差分析。结果影像学观察B、C组2、4、8、12周缺损区密度均高于A组。B、C组之间差异无统计学意义。电镜观察3个组边界区主要由纤维组织包绕．B组边界区可见少量新生骨散在分布．C组纤维组织更致密,可见少量新骨片状分布;组织学观察可见B、C组各时间点骨缺损区新骨形成均优于A组．C组新生骨及新生血管的量较B组多。随着时间延长,各组新骨均有增多．残留的材料减少．有大量骨样组织长人活性材料,骨成熟度增高,残留材料逐渐被活跃生长的骨组织包围并替代。以方差分析对组间新骨面积进行两两比较,结果显示第2、4周两两组间差异有统计学意义．8、12周时A组与B、C组间差异有统计学意义．后两组之间差异无统计学意义。结论由nHAC／PLA和富血小板血浆（PRP）构建的复合材料具有良好的生物相容性、骨传导及骨诱导活性．有望应用于临床修复骨缺损。     

纳米羟基磷灰石复合胶原/聚乳酸材料与骨髓基质细胞体外复合的实验研究

目的了解兔BMSCs与nHAC/PLA材料在体外共培养时细胞与材料复合的情况,进一步验证nHAC/PLA材料作为骨组织工程支架材料的可行性。方法将兔BMSCs与nHAC/PLA材料在体外复合共培养,通过倒置显微镜、扫描电镜观察细胞与材料的复合情况,用MTT法及碱性磷酸酶活性检测法检测材料对细胞增殖、分化的影响。结果BMSCs可以在nHAC/PLA材料表面及孔洞中良好地粘附、迁移、增殖和分化,复合培养5天后nHAC/PLA材料对BMSCs的增殖及分化表现出一定的促进作用。结论nHAC/PLA材料可以作为BMSCs良好的载体。     

bFGF/BMP-2转染大鼠骨髓干细胞体内成牙的研究

目的: 牙胚细胞和成纤维生长因子(Fibroblast growth factor bFGF)/骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2 BMP-2)联合转染的骨髓间充质干细胞 (bone marrow stem cells,BMSCs)混合培养,复合明胶海绵支架构建牙组织工程植入大鼠体内,探究其成牙能力。方法: 取健康SD大鼠128只,随机分为4组:细胞团块组;明胶海绵组;细胞团块+明胶海绵组;空白对照组,不做任何干预,均在全麻下植入大鼠肾被膜下。术后按4个时间点(5、10、14、28 d各8只)分期取材,进行大体组织观察,Masson染色和免疫组化染色。结果: 大体组织和Masson染色:术后5、10、14、28 d形态学观察显示细胞团块+明胶海绵组形成牙样组织。免疫组化:析因分析显示细胞团块+明胶海绵组在5、10、14 d DMP-1、BMP-4、DSP表达量最高且均高于其余各组,随着时间推移表达量逐渐有减小趋势,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论: 牙胚细胞和基因转染BMSCs混合培养,复合明胶海绵构建牙组织工程的体内实验结果形成牙样组织,为组织工程牙的成功构建奠定了一定的基础。     

PLA/PGA组织膜应用于牙槽嵴黏骨膜扩张初探

目的：了解可降解性材料PLA／PGA组织膜应用于牙槽嵴黏骨膜扩张的生物学性能。方法：40只新西兰大耳白兔建立萎缩性牙槽嵴模型和卵巢切除后模型,按照扩张类型随机分成4组,对PLA／PGA组织膜扩张牙槽嵴黏骨膜后,对各观察时段内PLA／PGA组织膜的生物学性能进行定量和定性观察。结果：PLA／PGA组织膜的降解于4周时开始,24周降解基本完成;12周时组织膜使用组新骨生成率为28％,非使用组为7％;24周时使用组骨改建基本完成,非使用组新骨生成率为13％;48周时使用组骨改建完全,非使用组新骨生成率为39％。结论：PLA／PGA组织膜良好的生物学性能对于促进牙槽嵴增高具有较好的应用前景。     

基因重组人骨形成蛋白-2与珊瑚/聚乳酸复合异位诱导成骨的实验研究

目的 :观察基因重组人骨形成蛋白 - 2 (rhBMP - 2 )和珊瑚 /聚乳酸形成复合人工骨的异位诱导成骨活性。方法 :把rhBMP - 2和珊瑚 /聚乳酸形成复合人工骨。进行小鼠肌内种植 1、3、6周后 ,组织学观察其异位诱导成骨活性。结果 :rhBMP - 2赋予珊瑚 /聚乳酸骨诱导能力 ,珊瑚 /聚乳酸则充当rhBMP - 2的载体和释放系统 ,对BMP的活性未产生不利影响。与单纯的珊瑚 /聚乳酸相比 ,这种复合人工骨以软骨内成骨的方式诱导成骨。结论 :rhBMP - 2 /珊瑚 /聚乳酸复合人工骨具有良好的生物相容性和骨诱导活性 ,是一种较理想的骨移植替代材料