犀角地黄汤合方对DC激活ITP患者T细胞增殖分化的影响

目的 观察犀角地黄汤合方含药血清对树突状细胞（DC）激活T细胞增殖分化的影响及其对免疫性血小板减少症（ITP）的作用机制。方法 将10只雄性SD大鼠随机分为含药血清组和空白血清组,每组5只,分别使用犀角地黄汤合方和蒸馏水连续灌胃3 d,腹主动脉取血制备含药血清和空白血清。分选15例健康志愿者及8例ITP患者CD4⁺ T细胞,将荷载血小板抗原的DC与CD4⁺ T细胞共培养,采用随机数字表法分为对照组,模型组,犀角地黄汤合方低、中、高剂量组。对照组为荷载血小板抗原的DC与健康志愿者CD4⁺ T细胞,模型组和犀角地黄汤合方低、中、高剂量组为荷载血小板抗原的DC与ITP患者的CD4⁺ T细胞,其中对照组和模型组加入大鼠空白血清,犀角地黄汤合方低、中、高剂量组分别加入体积分数为5%、10%及20%大鼠含药血清。流式细胞术（FCM）检测CD4⁺ T细胞的增殖情况,各组调节性T细胞（Treg）和效应性T细胞（Teff）的比例以及CD4⁺ T表面程序性死亡受体-1（PD-1）的表达量;酶联免疫吸附试验检测各组细胞上清液中促炎因子白细胞介素（IL）-2、干扰素-γ（IFN-γ）、IL-17以及抑炎因子转化因子-β（TGF-β）、IL-10的表达量。结果 与对照组比较,模型组CD4⁺ T细胞增殖百分比、Teff细胞比例以及促炎因子IL-2、IFN-γ和IL-17升高（P<0.05）,Treg细胞比例、CD4⁺ T细胞表面PD-1表达量以及抑炎因子TGF-β、IL-10水平降低（P<0.05）;与模型组比较,犀角地黄汤合方低、中、高剂量组CD4⁺ T细胞增殖百分比、Teff细胞比例依次降低,Treg细胞比例、CD4⁺ T细胞表面PD-1表达量和抑炎因子IL-10、TGF-β升高（P<0.05）,促炎因子IL-2的量降低（P<0.05）;与模型组相比,犀角地黄汤合方中、高剂量组IFN-γ和IL-17降低（P<0.05）。结论 犀角地黄汤合方尤其是高剂量组含药血清能够在体外调节ITP患者CD4⁺ T细胞的过度增殖分化及细胞因子的分泌,这可能是犀角地黄汤合方治疗ITP机制之一。     

自然衰老对小鼠免疫功能的影响

目的探讨自然衰老对小鼠免疫功能的影响。方法测量8周龄(青年组)和16月龄(老年组)ICR雄性小鼠各8只体重和免疫器官指数。流式细胞术检测两组小鼠脾脏组织和外周血中T淋巴细胞亚群(CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺)、髓源性抑制细胞(MDSC)及其亚型单核细胞样MDSC(M-MDSC)细胞比例,分析两种细胞比例相关性。结果与青年组比较,老年组体重、脾脏指数和肾脏指数升高(P<0.05),脾脏组织中CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺细胞比例降低,而CD4⁺/CD8⁺比值升高(P<0.05或P<0.01),外周血中CD3⁺和CD4⁺细胞比例降低(P<0.05),脾脏组织和外周血中MDSC和M-MDSC细胞比例升高(P<0.01)。老年组CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺细胞比例与MDSC、M-MDS...     

血吸虫可溶性虫卵抗原对哮喘的抑制作用及机制研究

目的研究血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)对哮喘发生的抑制作用及免疫调节机制。方法BALB/C小鼠腹腔及足垫注射SEA 50μg/只,每周1次,共4次。对照组注射生理盐水。然后用卵清白蛋白(OVA)诱导小鼠产生过敏性哮喘,剖杀小鼠,取肺组织进行病理学检查;收集支气管肺泡灌洗液(BALF),涂片、染色后进行细胞分类计数;分离脾细胞,用流式细胞仪检测CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)占CD4+T细胞的比例。结果 SEA免疫并OVA致哮喘组小鼠肺组织炎症明显轻于OVA单纯哮喘对照组,只有少量炎性细胞浸润。BALF涂片染色后发现SEA免疫组BALF中的细胞密度低于对照组,其中嗜酸性粒细胞占总细胞数的比例(2.2±1.5)%明显低于对照组(19.9±4.1)%,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪检测结果发现SEA免疫组小鼠脾细胞中CD4+CD25+Treg占CD4+T细胞总数的(32.2±2.2)%,明显高于对照组(27.4±2.9)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 SEA对哮喘的发生有一定的抑制作用,其机制可能是通过CD4+CD25+调节性T细胞影响机体的免疫调节机制。     

晚期非小细胞肺癌患者外周血淋巴细胞表面程序性死亡蛋白1表达及与临床特征的相关性

目的 探讨晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血CD8+T淋巴细胞表面程序性死亡蛋白1(PD-1)表达情况,分析其与临床病理因素的相关性。方法 选取攀枝花市中心医院80例晚期NSCLC患者作为观察组,同期40例肺部良性疾病患者作为对照组。比较观察组和对照组及观察组不同临床特征患者CD8+T淋巴细胞表面PD-1表达率,分析CD8+T淋巴细胞表面PD-1表达率与临床特征的相关性,并将观察组根据治疗方案不同分为A组（化疗）、B组（化疗联合免疫治疗）,各40例,对比2组疗效、不同疗效组治疗前后患者CD8+T淋巴细胞表面PD-1表达率、肿瘤相关物质[肿瘤相关物质群（TSGF）、糖类抗原125(CA125)、胸苷激酶（TK1）]水平,分析CD8+T淋巴细胞表面PD-1表达率与肿瘤相关物质相关性,随访1年,统计中位生存期（MST）,对比不同生存期患者CD8+T淋巴细胞表面PD-1表达率及其对生存期的预测价值。结果 观察组CD8+T细胞表面PD-1表达率高于对照组（P<0.05）;CD8+T淋巴细胞表面PD-1表达率与淋巴结转移、远处转移正相关（P<0.05）;B组治疗总有效率（90%）...     

不同剂量雷帕霉素对小鼠体内CD4+CD25+Treg细胞的影响

目的研究不同剂量雷帕霉素对小鼠体内Treg细胞的影响。方法将SPF级昆明系小鼠60只随机分为对照组(A)和实验组(B、C、D),B、C、D三组分别灌胃雷帕霉素1、2、3 mg.kg-1,A组每天予以无菌水灌胃,共3周。3周后,无菌条件下心脏采血,EDTA抗凝,分离脾脏,制备单细胞悬液,采用流式细胞仪检测小鼠外周血和脾脏中CD4+CD25+调节性T细胞水平(CD4+CD25+Treg细胞占CD4+T细胞的百分比)。结果实验组(B、C、D)小鼠外周血和脾细胞中CD4+CD25+Treg细胞水平分别为(9.62±1.43)%(、13.76±1.97)%(、15.41±2.45)%和(12.23±4.56)%(、23.03±6.18)%(、25.17±6.42)%,对照组(A)小鼠外周血和脾细胞中CD4+CD25+Treg细胞水平分别为(3.52±0.65)%和(6.53±3.01)%,无论是在外周血还是脾细胞中,B、C、D组CD4+CD25+Treg细胞水平明显高于A组(P0.05),C、D组与B组之间CD4+CD25+Treg细胞水平也有明显差异性(P0.05),C组和D组之间CD4+CD25+Treg细胞水平无明显差异性(P0.05)。结论雷帕霉素能够诱导昆明系小鼠体内CD4+CD25+Treg细胞增殖,其使用剂量可以影响CD4+CD25+Treg细胞的增殖程度。     

雷帕霉素对TGF-β1诱导的Treg细胞的体外影响

目的体外观察雷帕霉素（Rapa）对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的CD4^＋CD25^＋Treg细胞（i Treg）扩增的有效性及其相关性。方法以抗原提呈细胞（APC）、植物血凝素（PHA,10μg·L^-1）、TGF-β1（7.5 ng·L^-1）联合刺激诱导CD4^＋CD25^-T细胞转化为CD4^＋CD25^＋Treg细胞,培养第5日添加不同浓度Rapa刺激培养3d作为实验组,设阴性对照组（不加Rapa）和空白对照组（RPMI 1640培养基）,FCM检测各组中CD4^＋CD25^＋T细胞比例变化情况;MTT法测定各组诱导细胞的抑制功能。结果①阴性对照组CD4＋CD25＋T细胞比例较空白对照组增高（P〈0.01）,而实验组CD4^＋CD25^＋T细胞比例显著升高,Rapa（100 ng·mL^-1）增殖效应显著（P〈0.01）,CD4^＋CD25^＋T细胞增殖比例达到42.6%;②实验组i Treg细胞能够明显抑制同型CD4^＋CD25^-T细胞的增殖（P〈0.01）且不同浓度Rapa之间存在差异,100 ng.mL^-1Rapa抑制效应最明显（P〈0.01）。结论在体外条件下,Rapa可以促进TGF-β1诱导分化的Treg细胞增殖,且具有免疫抑制功能,这为体外回输Treg细胞治疗疾病开辟了新途径。     

雷帕霉素诱导Balb/c小鼠CD4~+ CD25~+ foxp3~+调节性T细胞增殖

目的探讨雷帕霉素对Balb/c小鼠CD4+ CD25+ foxp3+调节性T细胞的作用。方法取8wk龄的SPF级Balb/c小鼠30只,随机分为两组,实验组每只灌胃雷帕霉素0.4mg.d-1,对照组灌胃每天予等体积无菌水,共3wk。无菌条件下肝素抗凝心脏采血,分离脾脏,制备单细胞悬液。采用流式细胞仪检测小鼠外周血和脾细胞CD4+CD25+T细胞,实时定量PCR检测小鼠脾细胞foxp3 mRNA的表达。结果实验组小鼠外周血和脾细胞中CD4+CD25+T细胞的比例分别为(9.95±4.65)%和(24.13±10.06)%,对照组小鼠外周血和脾细胞中CD4+CD25+T细胞的比例分别为(5.01±1.49)%和(8.48±3.19)%,差异均有显著性(P<0.01)。实验组小鼠脾细胞foxp3 mRNA的表达水平明显高于对照组,是对照组的6.029倍,差异有显著性(P<0.01)。结论雷帕霉素能够明显诱导Balb/c小鼠体内CD4+CD25+T细胞的增殖,并能提高foxp3+ mRNA的表达。     

乙型肝炎患者CD4+CD25+节性T细胞的分子表达研究

目的 研究慢性乙型肝炎(chronic hepatitisB,CHB)患者和乙型肝炎病毒携带者(asymptomatic HBV carriers,ASC)外周血CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+regulatory T cells,Tregs)4个重要分子[细胞间黏附分子-1(ICAM-1),神经纤毛蛋白-1 (Neuropilin-1),Toll样受体TLRS、TLR8]的表达情况,并分析其可能的作用.方法 收集50例CHB患者(CHB组)、28例ASC(ASC组)和24例健康献血者(NC组)的外周静脉血,密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,应用MACS免疫磁殊和AutoMACS分离系统分选CD4+CD25+ Tregs,提取CD4+CD25+ Tregs总RNA,逆转录成cDNA后,采用SYBR Green Ⅰ荧光标记技术进行定量PCR检测待测分子的表达水平.结果 荧光定量PCR结果显示,4个待测分子中,ICAM-1、Neuropilin-1、TLR5的表达水平在各研究组间差异均无统计学意义(P＞0.05);TLR8在ASC组外周血CD4+CD25+Tregs中的表达水平明显低于NC组和CHB组,差异有统计学意义(P＞0.05),TLR8的表达水平在CHB组和NC组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 荧光定量PCR显示TLR8的表达水平在各组之间存在明显差异,提示TLR8在HBV感染过程中可能对外周血CD4+CD25+Tregs的功能起着重要的调控作用.     

免疫性血小板减少性紫癜患者的T细胞免疫状态

目的:探讨免疫性血小板减少性紫癜(ITP)患者T细胞免疫状态与发病机制的关系.方法:以25例ITP患者(患者组)和16例健康体检者(对照组)作为研究对象,采用流式细胞术检测T细胞亚群、辅助性T细胞(Th)亚群、活化状态T细胞及调节性T细胞(Treg)的比例.结果:患者组较对照组CD3+CD4+/CD3+和CD4+/CD8+(Th/Tc)比例下降,CD3+CD8+/CD3+的比例升高,差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).2组CD8+HLA-DR+/CD3+、CD8+CD25+/CD3+、CD8+HLA-DR+/CD8+及CD8+CD25+/CD8+差异均无统计学意义(P＞0.05).患者组Th1/Th2的比值高于对照组,CD4+CD25+CD127dim/CD4+调节性T细胞(Treg)低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:ITP患者外周血Th、Tc、Th/Tc亚群紊乱,Th1/Th2向Th1细胞极化,Treg细胞减少参与了该病的免疫发病.     

调节性T细胞对肿瘤特异性CTL杀伤效能的影响

目的探讨CD+4CD+25Treg细胞对肿瘤特异性CTL杀伤效果的影响及机制。方法将C57BL/6小鼠80只随机分为4组,每组20只。实验组1:DC与T细胞共同培养前删除CD+4CD+25Treg;实验组2:DC与T细胞共同培养后删除CD+4CD+25Treg;实验组3:DC与T细胞共同培养时不删除CD+4CD+25Treg;对照组:无DC诱导的T细胞。应用脾脏来源DC细胞诱导T细胞制备CTL,在CTL形成的不同时期采用MACS法删除CD+4CD+25Treg。应用MTT法检测不同组别CTL对B16黑色素瘤细胞的杀伤效果。同时应用ELISA法检测细胞培养液中IL-2、IL-10含量变化。结果 3实验组CTL杀伤率明显高于对照组(P<0.05)。实验组1及实验组2删除CD+4CD+25Treg的CTL杀伤率明显高于未删除的实验组3(P<0.05)。但CTL形成的不同时期删除CD+4CD+25Treg对CTL杀伤率无显著差别(P>0.05)。结论删除CD+4CD+25Treg细胞可明显提高CTL的杀伤效果,是打破肿瘤免疫耐受机制的新途径。     

CD4~+CD25~+调节性T细胞在不同肝脏肿瘤中的表达及意义

目的:研究CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)在不同肝脏肿瘤中的分布特点,评价其在肿瘤发生和发展中的作用.方法:根据病理诊断结果将80例肝脏肿瘤分为肝局灶性结节状增生(FNH)组10例、不典型腺瘤样增生(AAH)组10例以及原发性肝癌(HCC)组60例.另选取10例正常肝组织(肝血管瘤边缘肝组织)石蜡包埋标本为对照组.采用双重酶标免疫组化染色的方法测定不同肝脏肿瘤切片中Treg细胞的表达状况.对比分析Treg细胞在FNH、AAH和HCC各组中的表达特点,并进一步分析在HCC组中Treg细胞表达的影响因素.结果:对照组及FNH组中均未发现Treg细胞的表达.AAH组、HCC组中有Treg细胞的表达,且HCC组较AAH组增多(P＜0.01).在癌旁组织中已有Treg 细胞浸润,但较肝癌组织中Treg细胞数量少(P＜0.01).肝癌组织中不同患者性别、年龄、术前AFP水平的Treg细胞数量差异无统计学意义,而在不同肿瘤大小、肿瘤包膜是否完整及术前HBV-DNA水平是否升高中Treg细胞数量差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).结论:Treg细胞的表达与肿瘤的发生和发展有关,在肿瘤免疫中起负调节作用.     

Gemcitabine and checkpoint blockade exhibit synergistic anti-tumor effects in a model of murine lung carcinoma

Lung cancer is leading cause of cancer death in the world. Chemotherapy is currently one of the standard treatments for lung cancer. Gemcitabine is a pyrimidine nucleoside drug which has been approved by FDA to treat lung cancer. However, acquired resistance inevitable develops after Gemcitabine treatment, limiting clinical efficacy. Lewis lung carcinoma (LLC) cells were treated with Gemcitabine and cell apoptosis and programmed cell death-ligand 1 (PD-L1) expression were analyzed by flow cytometry. LLC mouse model was established to analysis the proportion and programmed cell death-1 (PD-1) expression of CD8 + T cells. Anti-tumor effect by treating with Gemcitabine and anti-PD-1 antibody was measured through in vivo LLC mouse model. Gemcitabine treatment induces tumor cell apoptosis and PD-L1 expression. Further study showed that Gemcitabine treatment also increases CD8⁺ and CD4⁺ T cells proportion, PD-1 and PD-L1 expression in LLC mouse model. Combination therapy with Gemcitabine and αPD-1 not only has strong anti-tumor effect, but also could inhibit postsurgical recurrence of LLC. Our findings demonstrated that the combination therapy of Gemcitabine and αPD-1 is an effective therapeutic strategy for lung cancer.     

薏苡仁酯对高龄恶性肿瘤患者Treg细胞的影响

目的探讨薏苡仁酯(coixenolide)对高龄恶性肿瘤患者外周血调节性T细胞(Treg)的作用。方法检测30例80岁以上老年恶性肿瘤患者(肿瘤组)薏苡仁酯治疗前后外周血Treg占总CD4+T细胞比例和血IL-2mRNA变化。结果与30例健康老年人(对照组)进行比较。结果肿瘤组外周Treg占总CD4+T细胞比例、血IL-2mRNA水平均明显高于对照组(P<0.01)。肿瘤组外周血Treg比例与血IL-2mRNA水平呈正相关(r=0.921,P<0.01)。肿瘤组在薏苡仁酯治疗2个周期后,外周血Treg、IL-2mRNA水平较治疗前明显下降(P<0.01)。结论薏苡仁酯可能通过下调IL-2分泌和Treg数目解除免疫抑制而发挥抗肿瘤作用。     

不同认知功能水平对阿尔茨海默病患者外周血辅助性T细胞表达影响

目的观察不同认知功能水平对阿尔茨海默病(AD)患者外周血辅助性T细胞表达影响。方法连续选择近期就诊或住院治疗的AD患者39例,对照组选择同期在我院参加体检健康成人25名,2组入选对象均检测外周血辅助性T细胞(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+),AD组同时接受了AD评定量表认知部分(ADAS-Cog)评估。结果 AD组的外周血CD3+和CD4+表达水平及CD4+/CD8+比值显著高于对照组,而CD8+则显著低于后者(P均<0.05);中、重度认知损害重组(ADAS-Cog总分≥20分,17例)的外周血CD3+和CD4+表达水平及CD4+/CD8+比值也显著高于轻度认知损害组(ADAS-Cog总分<20分,22例),而前者CD8+则则明显低于后者(P均<0.05)。结论 AD患者存在明确的辅助性T细胞高水平表达,且伴随着认知损伤加深显著而进一步严重。     

中晚期非小细胞肺癌化疗联合DC-CIK细胞免疫治疗的临床效果评价

目的 观察中晚期非小细胞肺癌患者采用化疗联合树突细胞-细胞因子诱导杀伤细胞(DC-CIK)免疫治疗的临床效果.方法 选择2013年4月—2016年1月收治的中晚期非小细胞肺癌患者78例,按治疗方法分为观察组39例(紫杉醇+顺铂化疗联合DC-CIK细胞免疫治疗)和对照组39例(单纯紫杉醇+顺铂化疗).采用酶联免疫吸附法检测血清肿瘤标志物细胞角蛋白19血清片段211(CYFRA211)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125(CA125)的表达.采用流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群、CIK细胞及Treg细胞的数量和比例,采用实体瘤疗效评价标准评估临床疗效,采用卡氏功能状态评分评估生存质量改善情况.结果 治疗后两组血清CYFRA211、CEA和CA125水平明显低于治疗前(P<0.05),且观察组明显低于对照组(P<0.05).治疗后对照组CD3+、CD4+、CD8+、CIK细胞的阳性细胞率明显低于治疗前(P<0.05),Treg细胞的阳性细胞率明显高于治疗前(P<0.05).治疗后观察组CD3+、CD4+、CD8+、CIK细胞的阳性细胞率明显高于治疗前和对照组(P<0.05),Treg细胞的阳性细胞率明显低于治疗前和对照组(P<0.05).观察组生活质量提高率、有效率和疾病控制率明显高于对照组(P<0.05).结论 化疗联合DC-CIK细胞免疫能提高中晚期非小细胞肺癌患者的临床治疗效果,并且能显著改善患者的免疫功能和生活质量.     

WT1特异性 CD8+ T 细胞治疗乳腺癌的实验研究

摘要： 目的 通过检测 Wilms’肿瘤基因 1 （WT1） 特异性 CD8+ T 细胞对乳腺癌细胞的杀伤活性, 探讨正常外周血中提取的 WT1 特异性 CD8+ T 细胞用于治疗乳腺癌的可行性。方法 运用流式细胞仪检测 20 例人白细胞抗原（HLA） -A2 血清阳性健康志愿者外周血中 WT1 特异性 CD8+ T 细胞的浓度, 通过 WT1/主要组织相容性复合体（MHC） 连锁状多聚体磁珠分选 WT1 特异性 CD8+ T 细胞并进行培养, 细胞毒性实验检测 WT1 特异性 CD8+ T 细胞的功能。结果 20 例 HLA-A2 血清阳性健康志愿者外周血中均可检测到 WT1 特异性 CD8+ T 细胞, 12 例健康外周血中 WT1 特异性 CD8+ T 细胞的浓度＞0.5%, 其中 4 例＞1%。WT1/MHC 连锁状多聚体磁珠分选后, 其浓度明显增加至 80%左右。WT1 特异性 CD8+ T 细胞可特异性杀伤 WT1 多肽负载的乳腺癌细胞株。结论 健康志愿者外周血中可检测到 WT1 特异性 CD8+ T 细胞, 该细胞可能对乳腺癌细胞具有特异性杀伤作用, 提示 WT1 特异性 CD8+ T 细胞用于乳腺癌过继性免疫治疗的可能性。     

虫草多糖调节小鼠T淋巴细胞及其亚群数量的机制研究

目的 研究冬虫夏草菌丝体多糖（虫草多糖）对正常小鼠T淋巴细胞及其亚群数量的影响及可能的机制。方法 ICR小鼠,随机分成空白对照组、阳性组（香菇多糖1 mg·kg^-1）和虫草多糖高、中、低剂量（200,100,50 mg·kg^-1）组,连续腹腔注射10 d后,流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞（CD³⁺细胞）及其亚群细胞CD4⁺CD8^-和CD4-CD8+数量、CD³⁺细胞凋亡率;MTT法测定小鼠脾淋巴细胞转化功能;实时荧光定量PCR检测脾脏组织Bcl-2 mRNA、Bax mRNA的转录水平,并测定胸腺和脾脏指数。结果 与空白对照组比较,虫草多糖能提高小鼠脾脏质量、促进未经ConA诱导的脾淋巴细胞增殖转化能力,并呈现剂量依赖性;虫草多糖高剂量组能明显增加外周血CD³⁺细胞和CD4⁺CD8^-细胞亚群的数量,降低CD4^-CD8⁺细胞亚群数量,显著提高CD4⁺CD8^-/CD4-CD8⁺的比值;高剂量虫草多糖能明显降低小鼠外周血CD³⁺细胞凋亡率,显著升高脾组织Bcl-2 mRNA转录水平和Bcl-2/Bax比值,而对Bax mRNA转录水平没有明显影响。结论 虫草多糖可刺激小鼠主要免疫器官（胸腺和脾脏）增生,提高T淋巴细胞及CD4^-CD8⁺亚群的数量,其作用机制可能与上调抑制凋亡基因Bcl-2 mRNA的转录,提高Bcl-2/Bax比值,从而抑制淋巴细胞凋亡有关。