RFP标记及bFGF/BMP-2信号诱导的牙组织工程的体内实验研究

目的 RFP标记的牙胚细胞和b FGF/BMP-2转染的骨髓间充质干细胞混合培养,复合3D打印聚乙烯醇(PVA)/双相陶瓷骨支架(DCCP)材料构建牙组织工程的体内孵育,探究其分化能力。方法取健康SD大鼠128只,随机分为4组:细胞团块组;PVA/DCCP支架材料组;细胞团块+PVA/DCCP支架材料组;空白对照组,不做任何干预,均在全麻下植入大鼠肾被膜下。术后按4个时间点(5、10、14、28 d各8只)分期取材,进行免疫组化染色和激光共聚焦切片观察。结果免疫组化:析因分析显示细胞团块+PVA/DCCP支架材料组在5、10 d DMP-1、BMP-4表达量最高且均高于其余各组,随着时间推移表达量逐渐有减小趋势,差异有统计学意义P<0.05;DSP在各组各时间点均为阴性表达,差异无统计学意义P>0.05。激光共聚焦显微镜显示:细胞团块+PVA/DCCP支架材料组各时间点切片组织中都可观测到荧光标记的牙胚细胞。结论 RFP标记的牙胚细胞和b FGF/BMP-2转染骨髓间充质干细胞混合培养,复合PVA/DCCP支架材料,构建牙组织工程成活并分化,其分化机制有待进一步研究。     

BMP-2、bFGF基因转染的大鼠骨髓干细胞与牙胚细胞在体外混合培养对成牙基因的影响

目的:观察骨形态发生蛋白-2和(或)碱性成纤维细胞生长因子转染的大鼠骨髓干细胞(BMSCs)和牙胚细胞在体外混合培养对牙本质基质蛋白1、成釉蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、同源异型盒基因1的影响。方法:采用实时定量PCR和Western blot的方法,检测 BMP-2和(或)bFGF对成牙基因的影响。结果:对照组、bFGF组、BMP-2组、bFGF/BMP-2组四组间,AMBN、COLLAGEN-Ⅰ、DLX1、DMP1基因在mRNA和蛋白水平表达量上存在明显差异(P<0.05)。结论:BMP2和bFGF有一定的协同交互作用,BMP2/bFGF/BMSCs/牙胚细胞可以作为构建组织工程牙的种子细胞。     

骨形成蛋白-2、4在胎鼠牙胚蕾状期的表达

目的:观察生长因子骨形成蛋白-2、4(BMP-2、4)在牙胚蕾状期的表达,探讨二者的作用及其关系,为牙组织工程研究打下基础。方法:选取14 d SD胎鼠下颌第一磨牙牙胚做石蜡切片,HE染色光镜观察证实牙胚处于鼠胚胎第14天蕾状期后,则取其前后2~3张切片用免疫组化LsAB法检测BMP-2、4在鼠牙胚蕾状期的分布与表达。结果:BMP-4在蕾状期牙上皮和牙间质均有表达;BMP-2在牙上皮有表达而在牙间质表达不明显。结论:BMP-2、4在牙胚蕾状期表达模式相似,但BMP-2的表达比BMP-4晚,反映二者作用各有侧重又相互联系。     

混合信号诱导的大鼠骨髓间充质干细胞与支架材料复合成牙的体内研究

目的:研究经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与骨形态发生蛋白2 (BMP-2)混合信号诱导的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在体内环境中与不同支架材料复合后的成牙潜能。方法:将取自SD大鼠的BMSCs与牙胚细胞在bFGF和BMP-2混合信号诱导的微环境中共培养后分别接种于明胶海绵和3D打印的PVA/DCCP复合支架材料上,然后回植入同种异体大鼠肾被膜下。在回植后的第1、3、7、14、28天采集回植体样本,用实时定量PCR (RT-PCR) 检测各组样本成牙相关基因成釉蛋白 (AMBN)、牙本质基质蛋白1 (DMP1)、Ⅰ型胶原蛋白 (Collagen-Ⅰ)、以及同源异型盒基因1 (DLX1) mRNA水平。结果:各基因在不同时间点的表达量与完整牙胚(E组)均存在统计学差异(P＜0.05);上述4个成牙相关基因的表达水平在不同支架材料组之间具有显著性差异(P＜0.001);不同成牙诱导信号对各个基因的表达水平也有一定影响。结论:在体内模拟环境下,经bFGF与BMP-2混合信号诱导的大鼠BMSCs与3D打印支架材料复合后能提高成牙基因的表达水平,促进牙体组织的形成。优选支架材料并构建合适的组织工程牙模型对实现非牙胚源性细胞向牙源性细胞的转化同样具有重要意义     

复合BMP-2/bFGF的多孔磷酸钙修复种植体周围骨缺损的实验研究

目的:研究多孔磷酸钙人工骨(porous calcium phosphate cement,CPC)与重组人骨形成蛋-2(recombinant humanbone morphogenetic protein 2,rhBMP-2)/碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)复合构建的组织工程骨修复种植体周围骨缺损的成骨效果.方法:拔除4只beagle犬的双侧下颌第2、3、4前磨牙和第1磨牙后3个月,培养犬的骨髓基质细胞(bone marrow stromai cells,BMSCs),以6×105/ml浓度接种于多孔CPC上;于犬双侧下颌骨拔牙处建立量化的6个骨缺损区(直径7.0mm、深4.0mm),同期植入3.75mm×10mm的Br?nemark种植体,种植体周围骨缺损区分别植入①CPC+BMSCs;②cPc+BMSCs+BMP-2;③CPC+BMSCs+bFGF;④CPC+BMSCs+BMP-2+bFGF;⑤CPC;以空缺作为对照组,在处死前作四环素和钙绿素双次标记,于术后12周取材,进行大体观察和硬组织切片观察.结果:BMSCs/CPC/BMP-2/bFGF复合物组成骨最活跃,缺损区种植体已与骨形成良好的骨结合,骨矿化沉积率高于其它组.结论:BMP-2/bFGF修复骨缺损的成骨作用明显优于单一因子;多孔CPC具有良好的骨引导作用,是一种较理想的临床骨修复材料.     

牙胚细胞与骨形态发生蛋白4转染的骨髓间充质干细胞相互诱导的体外实验研究

目的:探讨牙胚细胞和骨形态发生蛋白4(BMP4)转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)相互间的成牙诱导作用。方法:构建骨形态发生蛋白4慢病毒载体,转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,并将骨髓间充质干细胞和BMP4转染的骨髓间充质干细胞分别与SD大鼠牙胚细胞按1∶1比例混合培养,同时将细胞分为5组,BMSCs组、BMP4/ BMSCs组、牙胚细胞组、BMSCs/牙胚细胞组(混合组1)、BMP4/ BMSCs/牙胚细胞组(混合组2),分别采用实时荧光定量PCR和western-blotting检测五组细胞Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1成牙相关基因mRNA水平和蛋白水平相对表达量的变化。结果:与混合组1相比,混合组2Ⅰ型胶原蛋白、成釉蛋白、牙本质基质蛋白1、同源异型盒基因1 mRNA水平和蛋白水平表达量增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:牙胚细胞与BMP4转染的骨髓间充质干细胞共培养,促进了成牙相关基因的表达,可作为组织工程牙的备选种子细胞。     

出生后牙胚细胞肾被膜移植的成牙能力研究

目的：将出生后牙胚细胞接种于肾被膜下探讨其成牙能力。方法：通过酶消化法获得出生后4d SD仔鼠第一磨牙牙胚细胞，离心后与明胶海绵支架复合植入大鼠肾被膜下，2周后组织学观察移植物中的组织新生情况。结果：细胞与支架复合体形成了包含釉质样组织和牙本质牙髓复合体的牙齿样结构，形成的硬组织与正常牙齿的形态结构与排列方式相似。Masson’s三色法显示绿色矿化基质形成。结论：出生后牙胚细胞仍保留了牙齿发育的遗传信号，体内移植后牙源性上皮细胞与间充质细胞相互作用，能重新排列构建出与正常牙体组织类似的规则排列结构，在适当条件下具有形成组织工程牙齿的潜能。     

明胶海绵支架体内构建组织工程化颌下腺的研究

目的：研究采用组织工程技术通过颌下腺细胞与明胶海绵复合物的体内移植,探讨在同种异体动物体内构建具有生命活力的组织工程化颌下腺的可行性。方法：选用Wistar大鼠18只,分三组。A组：明胶海绵材料与鼠颌下腺细胞复合培养物;B组：单纯明胶海绵材料;C组：空白切开缝合对照。材料植入大鼠背部,术后3、7和15 d分期观察植入物的大体形态、组织学和超微结构,BrdU标记表达,及免疫排斥反应变化。结果：A组植入体内后颌下腺细胞在材料生长,形成的组织表面白色且有光泽、致密,组织学可见材料排列较为规则,15 d细胞仍成活并大量增殖,BrdU表达为阳性;B组植入体内7 d后材料逐渐变细,15 d后材料被逐渐降解吸收出现中断;A组分别于3、7、15 d进行扫描电镜观察可见颌下腺细胞数目逐渐增多,黏附在材料表面上生长,伸出突起,并可见明显的细胞分裂增殖,细胞形成功能性团块;A、B两组与C组相比3、5、7 d时白细胞数量增多明显,但逐步降低,第15天三组白细胞数量趋于一致。三组淋巴细胞数量变化不大,无显著性差异。结论：同种异体颌下腺细胞与明胶海绵材料复合构建的组织工程颌下腺,植入免疫功能正常的动物体内,细胞具有生命力,能够在材料上黏附生长、增殖,免疫反应随时间增加逐渐趋于正常。     

应用GFP基因转染示踪BMSCs在组织工程下颌骨内的分化

目的：应用绿色荧光蛋白（GFP）标记技术,观察组织工程化下颌骨形成过程中种子细胞的变化与转归。方法：用GFP反转录病毒载体与疱疹性口炎病毒糖蛋白G基因（VSV-G）蛋白重组形成假病毒,高效转染犬骨髓间质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）,将其接种于珊瑚,形成细胞、材料复合物,植入修复犬下颌骨标准缺损。术后32周取材,进行大体观察,组织学观察组织结构,免疫组化检测GFP蛋白表达情况。结果：32周后,大体可见组织工程化下颌骨形成,Van Gieson染色示新生骨大部分为成熟骨质,免疫组化显示新骨表面有GFP阳性成骨细胞,连接处无GFP阳性细胞,,珊瑚大部分降解。结论：组织工程下颌骨结构与正常皮质骨类似,新生组织表达GFP,证实组织工程下颌骨组织的形成来源于植入细胞。     

组织工程骨修复颅骨极限缺损种子细胞归宿的探讨

目的：检测纳米羟基磷灰石复合胶原／聚乳酸材料（nHAC／PLA，nano-hydroxyapatite／collagen／Polyacticacid）与骨髓基质细胞（BMSCs，bone marrow stroma cells）在体外复合构建的组织工程骨修复兔颅骨极限缺损的能力，并探讨种子细胞的归宿。方法：将圆盘状nHAC／PLA与BrdU标记的自体BMSCs复合后，植入新西兰大白兔颅骨直径1．5cm全层缺损中。设自体髂骨组、空白对照组及nHAC／PLA组，术后8w、16w通过X线片、HE染色、Masson’s三色法染色、荧光组织学和免疫组织化学染色，观察比较颅骨缺损的修复情况及种子细胞的归宿。结果：nHAC／PLA＋自体BMSCs组修复颅骨缺损的能力强，与自体髂骨组类似，nHAC／PLA组材料修复骨缺损的能力较弱，但强于空白对照组，组织工程骨的成骨细胞由植入的种子细胞演化而来。结论：nHAC／PLA复合自体BMSCs具有良好的修复骨缺损能力。     

大鼠骨髓间充质干细胞复合藻酸盐体内异位成软骨的初步研究

目的　探讨以藻酸盐为支架材料,经体外软骨向诱导的大鼠骨髓间充质干细胞为种子细胞,在体内异位形成组织工程化软骨的可能性。方法　32只雄性SD大鼠随机平均分为实验组和对照组两组。实验组分离培养自体骨髓间充质干细胞,传至第3代经转化生长因子β等诱导因子诱导10 d后与藻酸钠复合,并滴加氯化钙使其成凝胶状后注入大鼠背部皮下。对照组只注入藻酸盐。术后4周、8周取材进行苏木精-伊红、奥新蓝染色及透射电镜观察。结果　实验组术后8周肉眼可见软骨形成,苏木精-伊红、奥新蓝染色发现有大量软骨形成,软骨内可见细胞团,软骨细胞周围基质丰富,藻酸盐降解明显,未降解的藻酸盐松散的分布于软骨间。对照组未见软骨样组织形成。结论　经软骨向诱导的自体骨髓间充质干细胞结合藻酸盐凝胶可在体内异位形成较理想的组织工程化软骨。     

牙本质支架体外诱导兔骨髓干细胞分化

目的：探讨将人牙本质作为组织工程支架的可行性,采用不同的方式处理牙本质片,观察牙本质片处理后诱导兔骨髓基质干细胞贴壁附着生长的规律及成骨分化潜能。方法：将兔的骨髓基质干细胞分别接种于经机械去除前期牙本质加EDTA-柠檬酸脱矿处理（A组）,标准根管预备-EDTA处理（B组）的牙本质片上,体外培养1周,扫描电镜观察细胞与牙本质片的附着情况,碱性磷酸酶、茜素红及Vonkossa染色观察兔骨髓基质干细胞成骨分化。结果：兔骨髓基质细胞附着在2种方式处理的牙本质片上生长良好,贴附紧密。B组牙本质片上细胞碱性磷酸酶表达阳性率高达80％,茜素红、Vonkossa染色观察到钙结节数量多于A组。结论：经标准根管预备一EDTA处理的人牙本质能有效促进骨髓基质干细胞增殖及成骨分化,可能成为一种理想的成骨生物支架,并为牙体牙髓疾病的治疗提供了新的思路。广西科学研究与技术开发计划项目（桂科攻1012400lA一42）     

负载纳米羟磷灰石的结冷胶修复大鼠下颌骨缺损的效果评价

目的: 观察负载纳米羟磷灰石的结冷胶（GG/nHA）修复大鼠下颌骨缺损的效果。方法: 于16只SD大鼠下颌骨制备直径为5 mm的临界骨缺损,随机分为2组,实验组骨缺损区注入GG/nHA,对照组骨缺损区填充可吸收性明胶海绵。术后4周、8周处死大鼠,以Micro-CT定量分析骨组织愈合情况。苏木精-伊红（H-E）染色和马松（Masson）染色定性评估骨组织修复情况。采用GraphPad Prism 8.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 制备的GG/nHA具有良好的可注射性,可经注射器推出至骨缺损区。术后4周和8周,实验组缺损区的骨生成量及骨体积分数（BV/TV）均显著高于对照组（P<0.05）。H-E染色和Masson染色均见实验组较对照组有更多新骨形成。结论: GG/nHA可以注射形式注入下颌骨缺损区,促进其愈合,有望成为微创修复口腔颌面部骨缺损的新型材料。     

神经生长因子对兔下颌骨缺损愈合影响的实验研究

目的:局部应用神经生长因子(NGF)对兔下颌骨洞穿性骨缺损后新骨形成影响的研究。方法:12只成年日本大耳白兔,随机分成实验组和对照组,均在下颌骨体部制作15mm×8mm的单侧洞穿性骨缺损模型,实验组于缺损区植入明胶海绵为载体的神经生长因子,对照组植入明胶海绵为载体的生理盐水。每周抽取耳缘静脉血行血清钙、磷浓度测定,术后3,6周每组各处死3只分别行大体解剖观察、X线摄片、microCT检查、HE染色及mas-son三色染色分析,观察研究骨缺损区不同实验周期(3、6周)的缺损组织修复情况。结果:实验组与对照组在血清学,影像学及病理学均存在统计学差异。比较micro CT各项指标,显示实验组BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N高于对照组,BS/BV、Tb.Sp则对照组较高,有统计学差异(P<0.05)。HE及masson染色提示实验组胶原及纤维高表达,大体观察及X线检查进一步证明以上结果。结论:以明胶海绵为载体的NGF明显促进骨缺损修复,具有良好的生物相容性和可操作性。     

3D打印HAP-GEL支架复合BMSCs和HUVECs修复兔颅骨缺损的效果评价

目的:定性分析3D打印羟基磷灰石-胶原(hydroxyapatite-gelatin,HAP-GEL)支架材料复合骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC...     

骨髓基质干细胞片层的制备及其在组织工程骨中应用的初步研究

目的：探讨骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）片层（cell sheet）的制备方法,并观察其在实验犬体内构建组织工程骨时的成骨作用。方法：密度梯度离心法获取实验犬骨髓基质干细胞,经成骨诱导培养后,利用温度感应性培养皿（temperature-responsive culture dish）制备细胞片层后在体外包裹犬同种异体脱钙骨基质（demineralized bone matrix,DBM）,相差显微镜和扫描电镜观察细胞及片层形态;将复合体植入实验犬背阔肌筋膜下,组织学方法观察术后组织工程骨的骨形成情况。结果：细胞片层成功制备,并与支架材料复合良好,术后16周组织学显示形成类似板层骨的致密骨组织。结论：利用温度反应性培养皿可成功制备BMSC细胞片层,细胞片层包裹支架材料后在实验动物体内可形成具有类似板层骨结构的组织工程骨。     

冻存骨髓基质细胞和胶原膜在裸鼠体内的成骨研究

目的：研究经超低温冻存后的骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）和支架材料胶原膜BME-10X复合体植入裸鼠体内的成骨情况.方法：体外分离培养Beagle犬 BMSCs,冻存二代生长状况良好的BMSCs.12个月后,复苏冻存的BMSCs,并在体外构建BMSCs和0.5 cm×0.5 cm大小的BME-10X复合体.将胶原膜＋BMSCs＋矿化诱导培养液、胶原膜＋BMSCs＋基础培养液、单纯胶原膜＋矿化诱导培养液培养5 d后,植入裸鼠体内,并于术后第4、8、12周取出标本,进行大体观察和组织病理学分析.结果：单纯胶原膜＋诱导培养液组在植入胶原膜后,胶原膜边界清晰,膜边缘及内部基本没有细胞生长;在胶原膜＋BMSCs＋基础培养液组,术后第4周可见,胶原膜内有细胞长入,并有细小的条索状新生胶原形成,随着时间的延长,支架胶原逐渐分解,新形成的条索状胶原纤维变粗大;在胶原膜＋BMSCs＋矿化诱导培养液组,植入后也可见支架胶原的分解和更多的细胞生长,大量新生的胶原形成类骨质样组织.结论：冻存BMSCs复苏后进行体外培养扩增与诱导分化,并在在体内环境下复合胶原支架材料,仍然具有较强成骨能力.