Leptin受体在人牙髓干细胞中表达的实验研究

目的:研究体外培养人牙髓干细胞表型特征及生物学性状,检测Leptin受体在牙髓干细胞表面的表达.方法:采用组织块法和酶消化法分离培养人牙髓十细胞;免疫组化法、免疫荧光法检测细胞表面分子的表达;体外诱导分化实验检测细胞多向分化能力.免疫组化法检测Leptin受体在人牙髓干细胞表面的表达.结果:分离获得的牙髓干细胞波形丝蛋白和CD146表达阳性,具有向脂肪细胞和成骨细胞分化的潜能;Leptin受体在牙髓干细胞表面阳性表达.结论:分离培养的牙髓干细胞具有干细胞的表型特征及生物学性状,Leptin受体可表达于牙髓干细胞.     

犬乳牙牙髓干细胞体外培养及生物学性能研究

目的：体外分离培养比格犬乳牙牙髓干细胞（DTPSCs）,研究其生物学特性。方法：用酶解组织块法培养6周龄比格犬 DTPSCs,克隆法纯化,检测细胞克隆形成能力及增殖曲线;免疫组化鉴定细胞来源,流式细胞术鉴定细胞表面标记物;进行细胞多向诱导分化能力检测。结果：获得了成集落状生长的犬乳牙牙髓细胞,其克隆形成率为32％;免疫组化确定细胞为间充质而非造血来源;流式细胞术鉴定 STRO-1、CD146阳性表达,而 CD14、CD45及 CD86阴性表达;细胞成骨、成脂诱导后分别对茜素红、油红 O 染色阳性,成牙本质诱导后细胞碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白染色阳性,且细胞内碱性磷酸酶活性显著增高。结论：比格犬乳牙牙髓中存在具有间充质干细胞表型、自我更新及多向分化能力的干细胞。     

组蛋白去甲基化酶FBXL11抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化

目的 研究组蛋白去甲基化酶FBXL11对牙髓干细胞定向分化能力的影响.方法 成骨分化诱导培养基诱导牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化.逆转录病毒转染构建过表达FBXL11的牙髓干细胞稳定转染细胞,进行FBXL11获得性功能研究.碱性磷酸酶活性实验及碱性磷酸酶染色检测成骨/成牙本质分化早期分化指标-碱性磷酸酶活性.茜素红染色及钙离子定量分析检测牙髓干细胞体外成骨/成牙本质分化能力.实时定量RT-PCR检测FBXL11及成骨/成牙本质分化相关基因-骨涎蛋白、骨桥蛋白和骨钙素的表达.结果 成骨诱导牙髓干细胞抑制FBXL11的表达.过表达FBXL11明显抑制牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性、牙髓干细胞体外矿化能力以及骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达.结论 组蛋白去甲基化酶FBXL11具有抑制牙髓干细胞成骨和成牙本质分化的潜能.     

转录因子Klf4在人牙髓组织和牙髓成纤维细胞中的表达研究

目的研究转录因子Klf4在人牙髓组织和体外培养的牙髓成纤维细胞中的表达特点。方法采用免疫荧光技术检测Klf4和增殖标记物ki67在人牙髓组织及体外培养的牙髓成纤维细胞中的表达情况;利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Klf4在人牙髓细胞和矿化诱导14 d的表达情况。结果人牙髓中,Klf4主要表达在成牙本质样细胞和血管内皮细胞中;在体外培养的牙髓成纤维细胞中,与诱导前相比,Klf4在矿化诱导14 d时的表达明显增强。结论 Klf4在成牙本质细胞中呈特异性表达,可能与成牙本质细胞分化相关。     

成体人牙髓干细胞的分离与鉴定

目的从成体人牙髓组织中分离培养牙髓干细胞，初步探讨其分化潜能。方法选取年轻患者因正畸或阻生拔除的健康第三磨牙，取出牙髓，采用酶消化及过滤法得到单细胞悬液，有限稀释法原代培养。扩大培养细胞克隆，检测STRO-1的表达。体外诱导分化后对各克隆从碱性磷酸酶(ALP)活性、矿化结节形成、牙本质涎蛋白(DSP)表达、Oil Red—O染色、PPARr2基因表达等方面进行检测。结果克隆来源细胞STRO-1表达阳性。在矿化液诱导下，克隆细胞呈现明显高的ALP活性；能够形成矿化结节；可以分泌表达DSP，已向成牙本质细胞方向发生了分化。成脂肪诱导后，Oil Red—O染色阳性，可检测到PPARr2基因表达。结论从成体人牙髓组织中可以分离培养出干细胞，在体外能有效增殖并保持低分化状态。     

组蛋白去甲基化酶Jmjd3对牙髓干细胞成牙本质向分化的影响研究

目的研究组蛋白去甲基化酶Jmjd3对牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)成牙本质向分化的影响。方法原代分离培养DPSCs,用流式细胞术和茜素红染色鉴定DPSCs。体外诱导DPSCs成牙本质向分化不同时间(0、3、5、7、14 d),qRT-PCR检测Jmjd3及成牙本质细胞标志物牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein1,DMP1)的表达情况。用不同浓度(0、1、10μmol/L)的Jmjd3抑制剂GSK-J4处理DPSCs 14 d,q RT-PCR检测DSPP、DMP1的表达情况。结果原代培养的DPSCs表达间充质干细胞表面标记物CD44、CD29、CD146,体外诱导培养具有成骨分化潜能。DPSCs成牙本质向分化过程中,Jmjd3、DSPP、DMP1表达水平均上调(P<0.05),且可能具有时间依赖性。10μmol/L GSK-J4处理DPSCs可明显抑制DSPP、DMP1的表达(P<0.05)。结论Jmjd3在DPSCs成牙本质向分化过程中发挥正调节作用,且与其去甲基化酶活性相关。     

小型猪乳牙牙髓干细胞体外分离培养及鉴定

目的体外分离培养小型猪乳牙牙髓干细胞,并对其进行生物学鉴定。方法采用滤纸片法挑取单克隆小型猪乳牙牙髓细胞,免疫组织化学染色检测,体外比较单克隆牙髓干细胞及混合牙髓干细胞向矿化组织、脂肪细胞、及神经细胞诱导分化能力。结果分离培养的小型猪乳牙牙髓干细胞呈集落状生长,克隆形成率2．74％。波形丝蛋白、间充质于细胞表面标志STRO-1染色阳性,神经干细胞特异性标志nestin染色阳性。矿化诱导结果显示单克隆牙髓干细胞及混合牙髓干细胞,均为Von-kossa染色阳性,ATJP表达明显,两者无明著差异。单克隆牙髓干细胞及混合牙髓干细胞经IBMX、胰岛素、消炎痛和氢化可的松诱导3周后,可分化为脂肪细胞,两者成脂率均较低。单克隆乳牙牙髓干细胞向神经细胞诱导分化后免疫荧光鉴定β-tubulin III表达阳性,STRO-1表达阴性。混合牙髓干细胞无明显神经元样细胞分化。结论单克隆分离培养的小型猪乳牙牙髓干细胞具有很强的克隆形成能力及多向分化潜能,其矿化能力与混合的乳牙牙髓干细胞无明显差异。     

胞内信号转导分子LIM矿化蛋白1在人牙髓细胞体外矿化过程中表达的实验研究

目的:研究胞内信号转导分子LIM矿化蛋白1在人牙髓细胞体外矿化过程中的表达。方法:利用组织块法体外培养人牙髓细胞,实验组培养液中加入矿化诱导剂,对照组不加矿化诱导剂。培养14d后,免疫细胞化学检测牙本质涎蛋白的表达;von kossa染色检测矿化结节的形成。培养期间,采用半定量RT-PCR技术监测LIM矿化蛋白1及碱性磷酸酶的表达,SPSS11.0软件分析结果。结果:培养14d,实验组牙本质涎蛋白免疫细胞化学呈阳性表达,von kossa染色阳性,矿化结节形成;对照组牙本质涎蛋白表达阴性,von kossa染色阴性。RT-PCR结果显示碱性磷酸酶及LIM矿化蛋白1在实验组和对照组各时段均表达。培养期间,实验组LIM矿化蛋白1的表达显著性高于对照组,其中培养第2天及9天时表达分别达到两个高峰,约为对照组的1.8倍及3.0倍。培养期间,碱性磷酸酶的表达显著性增高,其中培养14d时约为对照组的2.0倍。结论:首次发现LIM矿化蛋白1与人牙髓细胞的体外矿化过程相关,提示LIM矿化蛋白1可能在牙髓细胞的分化及矿化中发挥一定作用。     

牙髓干细胞向成牙本质样细胞分化过程中基因表达研究

目的：分离培养来源于人成体牙髓组织的干细胞(dental pulp stem cells，DPSC)，分析研究其在未分化状态及在矿化诱导液中基因表型的变化：方法：采用胶原酶消化法获得人牙髓组织的单细胞悬液，14 d后挑取细胞克隆，分别在普通培养基和矿化诱导培养基中进行培养，利用RT-PCR，图像分析检测细胞基因表型变化。结果。未诱导的DPSC不表达牙本质特异性蛋白(dentin phosphprotein,DSPP)及骨涎蛋白(Bone sialoprotein，BSP)，表达部分成骨(osteocalcin,OCN alkaline phsphatase,ALP)相关表型，低表达转录因子核心结合因子(Cbfa-1)；与末诱导的DPSCs相比较，在成骨诱导中DPSCs表达DSPP和BSP，骨相关基因表达也相应上调。结论：DPsCs在矿化诱导液的作用下向成牙本质样细胞分化，其过程有可能是通过谱系特异表犁的表达或表达上调实现的。     

犬牙髓干细胞的分离培养与鉴定

目的：分离培养犬牙髓干细胞（cDPSCs）。方法：取犬磨牙获取牙髓,采用酶消法和组织块法取原代牙髓细胞,观察计数;免疫荧光和流式法鉴定细胞蛋白表达;进行成牙本质、成脂诱导。结果：酶消法和组织块法均可获得贴壁、集落生长的梭形细胞并稳定增殖。细胞克隆形成率为（15．17％±2．79％）。流式细胞术观察：CD90（24．43％±7．10％）、STRO-1（20．67％±1．42％）、CD24（2．03％±0．06％）、CD34阴性。免疫荧光法观察：Nestin,Vimentin 表达阳性、ALP 表达弱阳性、DSP 表达阴性或微弱阳性。成牙本质诱导见矿化结节,ALP 与 DSP 阳性。成脂诱导后细胞质见大量脂滴。结论：犬健康年轻磨牙牙髓组织中可稳定分离培养出具有一定克隆能力的 cDPSCs。     

Age of the donor affects the nature of in vitro cultured human dental pulp stem cells

ObjectivesThe dental pulp stem cells (DPSCs) of six donors (three young donors aged < 19 years and three adult donors aged > 25 and < 30 years) were characterized for their stem cell marker expression and differentiation potential to study the effect of donor age on DPSCs in vitro.MethodsDPSCs were cultured in αMEM supplemented with 20% fetal calf serum (conventional conditions) or on fibronectin-coated flasks with neurobasal medium supplemented with B27, bFGF and EGF (alternative conditions). DPSCs were characterized by immunofluorescence staining to detect the neural crest/mesenchymal stem cells markers P75 and CD146, respectively. The differentiation potential was tested by the induction of DPSCs into osteogenic, adipogenic and glial lineages and then by detecting the corresponding markers osteocalcin, lipidtox and S100ß, respectively.ResultsThe DPSCs of the young donors expressed CD146 only under the conventional conditions and expressed P75 regardless of the culture conditions. However, the DPSCs of adult donors expressed CD146 only under the alternative conditions and expressed P75 only under conventional conditions. Only the DPSCs of the young donors differentiated into the glial linage. The DPSCs of the adult donors differentiated more efficiently into the adipogenic linage. Osteogenic differentiation was comparable.ConclusionDonor age affects the expression of stem cell markers and differentiation potential of DPSCs. Moreover, the effect of culture conditions on DPSCs is age dependent.     

牙髓干细胞分化过程中L型钙离子通道羧基末端的表达

目的:探讨牙髓干细胞(DPSCs)分化过程中L型钙离子通道羧基末端的表达。方法:利用酶消化法体外分离、培养大鼠牙髓干细胞;吉姆萨染色法检测大鼠牙髓干细胞的克隆形成能力;神经诱导体系下诱导牙髓干细胞向神经样细胞分化,免疫荧光染色检测细胞分化后胶质纤维酸蛋白(glial fibrillary acidic pro-tein,GFAP)的表达和细胞分化前后L型钙离子通道Cav 1.2及羧基末端的表达。结果:牙髓干细胞的克隆形成能力为每1 000个细胞形成2～17个克隆;免疫荧光染色检测诱导后细胞GFAP表达阳性;免疫荧光染色检测显示:牙髓干细胞分化前L型钙离子通道Cav 1.2羧基末端表达于细胞膜上,细胞分化后羧基末端同时表达于细胞膜上和细胞核中。结论:L型钙离子通道Cav 1.2羧基末端在牙髓干细胞分化过程中发生核转位,羧基末端可能在牙髓干细胞的分化过程中发挥着一定的作用。     

Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells

Objective: This study aimed to compare the behavior of dental pulp stem cells (DPSCs) after isolation using solutions containing either collagenase/dispase or collagenase alone.Design: DPSCs were isolated by two digestion methods (collagenase/dispase or collagenase alone) from human third molars. Immunophenotypic features were confirmed by flow cytometry for cell markers STRO-1, cluster of differentiation (CD) 146, CD45, and collagen type-I. The proliferation potential of cells was evaluated by 5-bromo-2′-deoxyuridine (brdU) incorporation assay, and finally they were assessed for multi-lineage differentiation potential. Data were analyzed using one-way analysis of variance and independent t-tests.Results: DPSCs isolated by either method showed similar levels of STRO-1, CD45, and collagen type-I and similar incorporation of brdU (P > 0.05). However, DPSCs obtained by collagenase I/dispase treatment had significantly higher numbers of CD146⁺ cells and osteogenic and chondrogenic capacities compared to those obtained by treatment with collagenase I alone (P < 0.05). On the other hand, more STRO-1+/CD164-DPSCs were found in the collagenase alone group with higher adipogenic potential.Conclusions: Different enzyme solutions gave rise to different populations of DPSCs. Dispase enhanced isolation of CD146⁺ DPSCs probably by disrupting the basement membranes of blood vessels and releasing DPCSs embedded in the perivascular niche. Furthermore, the differentiation potential of DPSCs was influenced by the change in enzyme solution.     

Notch配体Delta1对人牙髓干细胞分化的影响

目的:探讨Notch配体Delta1对体外人牙髓干细胞(dentalpulpstemcells,DPSCs)向成牙本质细胞分化能力的影响。方法:利用逆转录病毒载体建立高表达人Delta1基因的人牙髓干细胞系;实验分三组,正常牙髓干细胞组、转导细胞组及混合组(正常与转导细胞比例为100∶1),分别进行体外分化诱导。倒置显微镜观测各组细胞各生长期出现的时间;VonKossa染色计数各组形成钙化结节数;Westernblot法检测各组细胞牙本质涎磷蛋白表达。结果:与正常牙髓干细胞相比,转导细胞各生长期出现时间明显提前,形成的钙化细胞结节数目显著增加,牙本质涎磷蛋白表达显著升高。结论:Delta1基因转导牙髓干细胞仍保持了体外向成牙本质细胞分化的能力;Notch-Delta1信号与分化诱导因子协同作用可促进人牙髓干细胞向成牙本质细胞分化。     

人牙髓干细胞体外分选分化的初步实验研究

目的体外培养人牙髓细胞,分选牙髓干细胞并诱导其分化。方法选择因正畸目的而拔除的健康完整双尖牙,酶消化法进行牙髓细胞培养,并进行来源鉴定。单抗Stro-1标记牙髓干细胞、免疫磁珠分选系统进行分选。矿化液定向诱导分选后的牙髓干细胞,比较诱导前后stro-1染色及改良Gomori钙钴法染色检测碱性磷酸酶（ALP）的改变。结果体外培养人牙髓细胞呈成纤维细胞样,抗波形丝蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性。牙髓干细胞Stro-1检测阳性,牙髓细胞中干细胞阳性率约为10％。矿化诱导后细胞stro-1阴性、ALP阳性表达。结论采用免疫磁珠分选系统分离出人牙髓干细胞,初步验证干细胞分化潜能,为其后续生物学特性研究提供实验基础。     

人牙髓干细胞体外分选分化的初步实验研究

目的 体外培养人牙髓细胞,分选牙髓干细胞并诱导其分化.方法 选择因正畸目的 而拔除的健康完整双尖牙,酶消化法进行牙髓细胞培养,并进行来源鉴定.单抗Stro-1标记牙髓干细胞、免疫磁珠分选系统进行分选.矿化液定向诱导分选后的牙髓十细胞,比较诱导前后Stro-1染色及改良Gomori钙钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)的改变.结果 体外培养人牙髓细胞呈成纤维细胞样,抗波形丝蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性.牙髓干细胞Stro-1检测阳性,牙髓细胞中干细胞附性率约为10%.矿化诱导后细胞Stro-1阴性、ALP阳性表达.结论 采用免疫磁珠分选系统分离出人牙髓干细胞,初步验证干细胞分化潜能,为其后续生物学特性研究提供实验基础.     

重组hFOXA2和hPDX1慢病毒载体诱导乳牙牙髓干细胞重编程为胰岛素生成样细胞

目的：构建重组转录因子hFOXA2 和hPDX1慢病毒载体,转染乳牙牙髓干细胞,诱导其向胰岛素生成样细胞(insulin-producing cells,IPCs)分化。方法：酶消化法分离培养人牙髓干细胞(DPSCs),有限稀释法纯化培养,流式细胞术分析细胞表面标志,并进行体外多向分化诱导验证;构建重组Lenti-hFOXA2、Lenti-hPDX1慢病毒载体,Lipofectamine2000转染293T细胞进行病毒包装,通过荧光细胞计数测定病毒感染效率和滴度;以最佳感染复数(MOI)感染牙髓干细胞,诱导其体外重编程为胰岛素生成样细胞,免疫荧光染色测定PDX1、FOXA2及胰岛素原表达,ELISA法检测胰岛素分泌情况。采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果：体外成功分离培养人DPSCs;细胞表面表达STRO-1(98.01%)、CDl46(98.51%)、CD34(99.54%)和CD45(24.08%)。体外成骨、成软骨、成脂肪诱导分化特异性染色阳性;成功构建重组Lenti-hFOXA2、Lenti-hPDX1慢病毒载体,双酶切和测序鉴定与GenBank的序列完全符合;病毒包装效率分别为(96.15±0.17)%和(95.49±0.21)%,感染滴度约为1.80×108 GTU/mL,最佳MOI为20;诱导后的细胞表达胰岛素原、FOXA2和PDX1,胰岛素分泌量为1.92 μmol/L,较未诱导组和对照组均显著增高(P<0.01)。结论：DPSCs经重组转录因子慢病毒载体Lenti-hFOXA2、Lenti-hPDX1转染诱导,可启动细胞重编程机制,形成胰岛素生成样细胞,可作为糖尿病基因治疗的种子细胞。     

Notch信号通路相关分子在牙周膜干细胞中的表达及意义

目的：检测Notch信号通路相关分子在炎性和正常牙周膜干细胞中的表达差异,探讨其在牙周炎牙槽骨缺损中的作用机制。方法：组织块酶消化法培养正常组织及慢性牙周炎组织来源的的牙周膜干细胞（H－PDLSCs,P－PDLSCs）,并经有限稀释法纯化两种细胞,采用免疫荧光法检测干细胞表面标记物CD146及PDLSCs表面蛋白STRO－1的表达,通过免疫荧光染色和实时荧光定量PCR检测Notch信号通路中Notch1受体蛋白、配体Jagged1（JAG1）信号分子的表达变化。结果：两种来源的细胞经纯化后均阳性表达间充质干细胞表面标志物STRO－1、CD146;P－PDLSCs比H－PDLSCs具有更强的增殖能力;免疫荧光染色检测显示,H－PDLSCs和P－PDLSCs均阳性表达Notch1、Jagged1;但P－PDLSCs中Notch1、Jagged1的阳性表达明显较弱;RT－PCR检测发现P－PDLSCs中Notch1、Jagged1mRNA表达量分别为（1．22±0．29）、（1．52±0．38）,较H－PDLSCs明显降低,差异有统计学意义（均P<0．05）。结论：炎症牙周膜干细胞中的炎症微环境可能抑制了Notch信号分子的表达,低水平的Notch信号的激活可能有利于牙周炎缺损牙槽骨的成骨分化。