肝/肾/骨型碱性磷酸酶基因ALPL抑制卵巢癌细胞系SKOV3增殖的研究

目的 研究肝/肾/骨型碱性磷酸酶基因(alkaline phosphatase,liver/bone/kidney,ALPL)在卵巢癌细胞株中的表达及其对卵巢癌细胞SKOV3增殖的影响.方法 通过qRT-PCR检测ALPL在不同卵巢癌细胞株(HEY、SKOV3、8910、ES-2、OVCAR3、3AO、A2780)mRNA中的表达,并与正常卵巢组织进行比较.在低表达ALPL的卵巢癌细胞株SKOV3中外源性过表达ALPL,通过MTT法、平板克隆实验检测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞周期.通过建立裸鼠皮下种植瘤模型,观察过表达ALPL的SKOV3细胞在体内的成瘤能力.结果 ALPL在卵巢癌细胞中的mRNA表达低于正常卵巢组织(P＜0.01),外源性过表达ALPL可抑制SKOV3细胞的增殖和克隆形成率(P＜0.01),阻滞细胞G1期向S的转化,并抑制肿瘤细胞的成瘤能力(P＜0.05).结论 ALPL表达的恢复可以明显抑制卵巢癌细胞SKOV3的增殖及成瘤能力.     

自噬基因Beclin1对上皮性卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用

目的 观察自噬基因Beclin 1在人卵巢癌细胞株SKOV3中过表达对肿瘤细胞在体内、体外生长活性的影响.方法 脂质体法将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染人卵巢癌细胞株SKOV3,MTT法分析外源性Beclin1过表达对SKOV3增殖的影响,流式细胞仪检测转染后肿瘤细胞的凋亡及自噬情况.将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后,接种到裸鼠皮下,观察体内致瘤活性及生长情况;免疫组化检测瘤组织Beclin1蛋白的表达.结果 Beclin 1在SKOV3中的过表达后抑制肿瘤细胞在体外的生长,抑制率为58.68%;pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3的凋亡率为(21.26±3.89)%,高于空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组,差异有显著性(P<0.05);流式细胞仪检测pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞MDC平均荧光强度高于pcDNA3.1转染组和未转染组.重组质粒pcDNA3.1/Beclin1使SKOV3细胞在裸鼠体内成瘤时间延长,瘤体体积及质量明显小于空质粒组和空白对照组,抑瘤率为50.27%.结论 自噬基因Beclin1在人卵巢癌细胞SKOV3中过表达可抑制SKOV3在体内、体外的增殖,针对自噬基因Beclin1的卵巢癌基因治疗可能具有可行性.     

酪氨酸激酶3对赫赛汀耐药的卵巢癌细胞株SKOV3/H增殖和成瘤能力的影响

探索erb-b2受体酪氨酸激酶3（HER-3）对卵巢癌耐药细胞株SKOV3/H的体外增殖和体内成瘤能力的影响。方法采用赫赛汀浓度递增法构建SKOV3 耐药细胞株（赫赛汀起始浓度为5 mg/L,经5～8 次浓度递增,每次提高50%）。实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测HER-3在15 对非耐药卵巢癌组织和耐药卵巢癌组织中的表达（SKOV3 和SKOV3/H 细胞中的表达）。MTT 实验验证分别转染sh-HER-3 及其对照质粒vector对SKOV3/H细胞增殖能力的影响。将包含sh-HER-3的重组慢病毒质粒及其阴性对照慢病毒空载体质粒vector（均带egfp荧光标签）分别以病毒/细胞数量=15 的比例感染SKOV3/H 细胞,加入2.0μg/ml 的嘌呤霉素筛选,构建稳定转染sh-HER-3 或vector 的SKOV3/H 细胞,将2 株细胞分别注射到裸鼠皮下,复制卵巢癌裸鼠移植瘤模型,观察体内成瘤情况。结果成功构建卵巢癌SKOV3耐赫赛汀细胞株SKOV3/H,且SKOV3/H的群体倍增时间为SKOV3 细胞的1.4～1.9倍。HER-3在耐药卵巢癌组织中的表达水平高于非耐药癌组织（p <0.05）,且HER-3 在耐药细胞株SKOV3/H中的表达水平也高于非耐药卵巢癌细胞株SKOV3（p <0.05）。转染sh-HER-3后,SKOV3/H细胞的增殖能力低于阴性对照组（p <0.05）。转染sh-HER-3后,耐药细胞株SKOV3/H的裸鼠体内成瘤能力降低（p <0.05）。结论HER-3参与卵巢癌的赫赛汀耐药,并正向影响耐药细胞株SKOV3/H的增殖和体内成瘤能力。     

CD146过表达对SKOV3细胞在裸鼠体内成瘤能力的影响

目的：研究 CD146基因在卵巢癌细胞 SKOV3中过表达对其接种裸鼠皮下生成肿瘤能力的影响。方法:以脂质体介 导的CD146基因转染卵巢癌细胞SKOV3,G418筛选阳性克隆细胞,并经Western blot鉴定其过表达CD146蛋白。分别应用MTT 与软琼脂克隆形成试验评价过表达 CD146克隆细胞对细胞增殖与体外集落形成能力的影响,并将这些细胞接种裸鼠皮下组 织,每周观察、记录肿瘤的生长状况至裸鼠处死,称量肿瘤重量并对肿瘤组织进行免疫组织化学染色观察。结果:SKOV3细胞经 脂质体转染与 G418筛选后,可获得过表达 CD146的阳性克隆细胞。CD146过表达明显抑制了 SKOV3细胞的体外增殖能力与 集落形成能力,亦明显抑制了裸鼠皮下的肿瘤生成能力,其肿瘤重量与体积明显比对照组小（P < 0.05）。免疫组织化学染色结 果表明过表达CD146的SKOV3细胞接种裸鼠生成的肿瘤组织仍可高表达CD146蛋白分子。结论:CD146过表达明显抑制卵巢 癌细胞SKOV3的体外增殖能力与裸鼠体内的致瘤性,可能是卵巢癌预后的一个潜在分子标记。     

非甾体类抗炎药对卵巢癌细胞生长的抑制作用

目的 比较2种非甾体类抗炎药Celecoxib和Aspirin对人卵巢癌SKOV3细胞生长和凋亡的影响,以及Celecoxib对人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤成瘤性的影响.方法 不同浓度Celecoxib和Aspirin作用于卵巢癌细胞不同时间后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)快速比色法检测卵巢癌细胞的增殖;倒置相差显微镜观察细胞形态学变化;流式细胞技术(FCM)测定卵巢癌细胞凋亡;裸鼠皮下移植瘤实验检测卵巢癌细胞体内成瘤性.结果 Celecoxib和Aspirin均对卵巢癌细胞的增殖有抑制作用,呈剂量依赖关系,且24 h就已表现出较强的抑制SKOV3细胞增殖效应,以Celecoxib作用最显著,24 h肿瘤细胞半数抑制剂量(IC50)所需Celecoxib浓度为5×10-5 mol/L,而所需Aspirin浓度约为7×10-3 mol/L; Celecoxib和Aspirin作用后,部分细胞出现形态不规则、细胞浆空泡化,尤以Celecoxib更明显;5×10-5 mol/L Celecoxib和7×10-3 mol/L Aspirin组癌细胞凋亡率分别为47.1%、15.7%,均高于对照组(4.8%,P均＜0.05);3种不同剂量的Celecoxib对裸鼠皮下移植瘤的抑瘤率分别为25.20%、33.00%、38.60%,尤以Celecoxib 50 mg/(kg·d)组更为明显,且对裸鼠肝肾胃肠等重要脏器无明显影响.结论 Celecoxib和Aspirin均能抑制人卵巢癌SKOV3细胞的增殖和诱导其凋亡,且Celecoxib作用强于Aspirin.     

hTERT基因反义cDNA转染对卵巢癌细胞系SKOV3生物学行为的影响

目的: 研究反义hTERT基因对卵巢癌细胞系SKOV3生物学行为的影响.方法: 构建反义hTERT基因的真核表达载体,采用LIPOFCTAMINETM Reagent转染卵巢癌细胞系SKOV3,通过RT-PCR、Trap-ELASA、生长曲线、裸鼠体内致瘤能力等方法比较转染前后细胞hTERT基因表达、端粒酶活性、细胞生长、致瘤性等方面的变化.结果:转化细胞系细胞hTERT基因的表达受到抑制,端粒酶活性下调,肿瘤细胞的增殖与生长速度明显降低,细胞的克隆形成能力及裸鼠体内的成瘤能力下降,肿瘤的恶性表型部分逆转.结论:应用反义技术下调hTERT基因表达可有效降低端粒酶活性并部分逆转卵巢癌细胞的恶性表型,hTERT基因可望成为卵巢癌基因治疗的新靶点.     

转染IL-12基因的人脐带间充质干细胞对卵巢癌细胞的体外增殖和对裸鼠体内移植瘤的抑制作用

摘要：目的探讨人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）负载白细胞介素12（IL-12）重组腺病毒载体抗卵巢癌SKOV3作用的研
究。方法腺病毒介导IL-12 基因转染体外培养的UC-MSCs（AdIL-12-MSCs）,Western blotting 和RT-PCR 检测
AdIL-12-MSCs中IL-12基因蛋白及mRNA表达,ELISA法检测AdIL-12-MSCs上清液中IL-12的表达。光镜下观察外源
性IL-12对SKOV3细胞形态的影响,MTT法检测AdIL-12-MSCs分泌的IL-12对SKOV3细胞增殖活性的影响,流式细胞
仪检测AdIL-12-MSCs 上清液对SKOV3 细胞凋亡的影响。建立裸鼠卵巢癌SKOV3 皮下移植瘤模型,观察移植
AdIL-12-MSCs 后对移植瘤的影响。结果腺病毒介导IL-12 基因成功转染UC-MSCs形成AdIL-12-MSCs,转染后细胞
IL-12基因在蛋白及mRNA水平均有明显表达。AdIL-12-MSCs分泌的外源性IL-12显著抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖
并诱导其凋亡,并抑制卵巢癌SKOV3移植瘤在裸鼠体内的生长（P<0.05）。结论转染IL-12基因的UC-MSCs能够在蛋白
及mRNA水平表达IL-12基因,显著抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖并诱导其凋亡,抑制卵巢癌SKOV3移植瘤在裸鼠体
内的生长。     

RNAi沉默STAT3基因对人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的：研究pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒对人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用,阐明RNA干涉技术在卵巢癌生物治疗领域中的作用。方法：应用人卵巢癌细胞系SKOV3对15例裸鼠建立人卵巢癌皮下移植瘤模型,随机分为3组：对照组（生理盐水）、空质粒对照组及重组质粒组（pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3）。应用电子穿孔仪将质粒转入裸鼠移植瘤内,观察重组质粒注射后第7、14、21和28天各组裸鼠皮下移植瘤体积变化。利用Western blotting检测重组质粒对STAT3蛋白表达的影响,采用HE及TUNEL染色方法观察肿瘤组织形态变化及细胞凋亡情况。结果：重组质粒瘤内注射对SKOV3裸鼠皮下移植瘤的生长有明显的抑制作用,与2个对照组比较,重组质粒组裸鼠移植瘤生长速度明显减慢（P<0.01）。重组质粒组瘤体内STAT3及CyclinD1、VEGF、survivin、c-myc蛋白表达明显低于2个对照组（P<0.01）。HE染色显示,重组质粒组肿瘤细胞出现大片细胞坏死,2个对照组肿瘤细胞以正常形态居多。TUNEL染色显示,重组质粒组癌组织有大量细胞凋亡,2个对照组几乎均为TUNEL阴性反应细胞。结论：pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒能明显抑制人卵巢癌细胞SKOV3裸鼠皮下移植瘤的生长。     

miR-203靶向Survivin抑制卵巢癌细胞增殖、迁移与侵袭

目的 探讨miR-203靶向抑制Survivin对卵巢癌SKOV3及OVCAR3细胞增殖、迁移及侵袭的影响。 方法 构建过表达miR-203、Survivin及空白对照组的慢病毒载体,转染卵巢癌SKOV3和OVCAR3细胞,嘌呤霉素筛选后构建空白对照组、过表达miR-203组、过表达Survivin组及过表达miR-203联合Survivin组卵巢癌细胞系。Western blotting方法测定各组卵巢癌细胞中Survivin及上皮-间质转化(EMT)相关蛋白的表达;MTT和平板克隆实验检测卵巢癌细胞增殖能力的改变;Transwell实验检测对细胞迁移和侵袭能力的影响。 结果 (1) 过表达miR-203抑制Survivin的表达及EMT(P<0.05);(2) MTT、平板克隆实验及transwell实验显示,与空白对照组相比,过表达miR-203组能够抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭(P<0.05);而过表达Survivin逆转了miR-203对卵巢癌的抑制作用(P<0.05)。 结论 miR-203通过靶向Survivin抑制EMT从而抑制卵巢癌的增殖、迁移及侵袭,miR-203/Survivin/EMT轴有望成为卵巢癌治疗的新靶点。     

汉族人肾透明细胞癌细胞系的建立

目的:取汉族人临床标本,建立肾透明细胞癌(ccRCC)细胞系,初步研究该细胞系的生物学特性.方法:2005～2007年间共采集43例ccRCC新鲜手术标本(包括肾原位肿瘤、骨转移、淋巴结转移肿瘤及癌栓),于手术后30～60 min内用植块法进行体外培养,记录传代超过50代的细胞株的生长曲线,测定集落形成率,对细胞进行染色体分析,病理学检查,流式细胞术检测及NOD-SCID鼠荷瘤实验.结果:绝大部分原代细胞传代次数在5代内,其中5例可连续传代5代以上,4例传代超过10代.仅1例来源于骨转移组织的原代细胞(命名为RCC05-TXJ)及1例来源于原位ccRCC的原代细胞(命名为RCC05-ZYJ)可稳定连续传代.RCC05-TXJ经历21个月传110代,群体倍增时间19.2 h,染色体众数为75,集落形成率为41%;RCC05-ZYJ经历18个月传160代,群体倍增时间为16.5 h,染色体众数为55,集落形成率为37%.免疫组化显示CA9及CD133阳性,流式细胞术分析发现随细胞传代增多CA9及CD133表达明显增高(P＜0.05).两株细胞在NOD-SCID鼠体内均有良好的致瘤及转移性,但是转移倾向明显不同.结论:应用汉族人肾透明细胞癌组织成功建立了2个转移潜能不同的细胞系,随着传代次数增加,肿瘤干细胞比例增加.     

细胞黏附对干扰素、5-氟尿嘧啶诱导细胞凋亡的影响

目的探讨细胞黏附作用对干扰素、5-氟尿嘧啶(5-Fu)诱导细胞凋亡的影响。方法采用HepG2、HEK293细胞株,常规96孔板培养细胞,分为空白不加药(A组)、多聚赖氨酸包被预处理+贴壁后加药(B组)、贴壁后加药(C组)、未贴壁就加药(D组)、未贴壁就加药和Fn抗体(E组)。选用干扰素、5-Fu分别作用各组细胞,MTT法测定各组增殖抑制率和DNA Fragmentation ELISA测定凋亡率,Western blot检测干扰素诱导各组PKR蛋白水平的表达。结果经多聚赖氨酸包被预处理后,细胞对药物的敏感性减弱,MTT法显示抑制率:干扰素作用G2细胞,B、C组抑制率分别为(27.24±31.77)%、(39.04±14.88)%(P<0.05);5-Fu作用G2细胞,B、C组抑制率分别为(30.61±11.26)%、(32.94±20.93)%(P<0.05);干扰素作用293细胞,B、C组抑制率分别为(32.02±23.48)%、(46.22±25.20)%(P<0.05);5-Fu作用293细胞,B、C组抑制率分别为(14.07±21.91)%、(31.61±31.49)%(P<0.05)。DNAFrag...     

间充质干细胞与调节性T细胞的研究进展

间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）无免疫原性,且具有免疫调节的功能。调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）是一类具有负性免疫调节作用的T细胞亚群,MSCs和Treg通过复杂的作用机制维持免疫耐受,限制效应细胞的应答程度,从而纠正和防止过度免疫反应。同时大量研究表明MSCs在体外和体内都能上调Treg水平,并以此来发挥免疫抑制作用,治疗移植物抗宿主病（GVHD）、系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿关节炎（RA）、1型糖尿病（T1DM）等自身免疫性疾病。     

胰岛细胞肿瘤增殖细胞核抗原的表达

目的：探讨胰岛细胞肿瘤增殖细胞核抗原表达与形态学特征的关系。方法：回顾性复习１２例胰岛细胞瘤的病理资料,并以Ｓ－Ｐ法作了ＰＣＮＡ免疫组化标记。结果：条索状,小梁状排列的大细胞型胰岛细胞瘤ＰＣＮＡ呈强阳性,而胰岛状,玫瑰花样排列的小细胞者ＰＣＮＡ表达弱,两者差异有显著性。     

细胞培养技术的研究进展

随着现代科学的发展,体外细胞培养技术已成为多个领域必不可少的研究工具,并且其新技术和方法也在不断涌现。本文就细胞培养技术的发展、支架材料以及细胞培养的影响因素作一综述。     

干细胞与肿瘤干细胞

目的了解干细胞、肿瘤干细胞和恶性肿瘤关系的研究进展。方法复习国内外相关文献,综述肿瘤干细胞与干细胞的关系、肿瘤干细胞与恶性肿瘤发生发展的关系、研究现状、前景及存在的问题。结果正常干细胞和肿瘤干细胞之间存在很强的相似性,其中淋巴造血系统恶性肿瘤和少数实体瘤干细胞分离鉴定的成功有力支持了肿瘤干细胞理论。结论肿瘤干细胞理论可解释很多恶性肿瘤的生物学行为,但目前仍迫切需要相关分离、纯化、鉴定实体瘤干细胞的思路和方法。     

NSCLC患者血浆游离DNA检测的临床意义

目的 评估血浆游离DNA含量在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)诊疗中的应用价值。方法 收集61例非小细胞肺癌患者和18例健康人的血浆,提取血浆游离DNA,荧光定量PCR方法检测DNA浓度。结果 健康人血浆游离DNA水平中位数为73.70(53.49~85.03)ng/ml,非小细胞肺癌患者血浆游离DNA水平为179.43(160.94~401.34)ng/ml,两者间差异有统计学意义(P＜0.01)。血浆游离DNA含量与非小细胞肺癌患者的性别、年龄、吸烟状况及病理类型均无明显相关性,与有无转移存在相关性(P＜0.01)。结论 非小细胞肺癌患者的血浆游离DNA是一种潜在有价值的生物学标志物,可作为临床上诊断肺癌、预测疾病进展、快速评估治疗疗效的工具。     

肾透明细胞癌相关特异性miRNAs差异表达谱

目的研究证实肿瘤组织miRNAs表达水平较正常组织可特异性下调或上调,这一现象揭示miRNA在肿瘤发生、发展等过程中扮演重要角色。文中就肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)肿瘤相关特异性微小RNA(mi-croRNAs,miRNAs)表达谱及意义进行探讨。方法取手术切除新鲜肾透明细胞癌及其癌旁正常肾组织,提取总RNA,进行RNA质量检测后采用微阵列基因芯片对其相关特异性miRNAs进行分析,应用荧光定量RT-PCR方法验证。结果Ⅰ级ccRCC与癌旁正常肾组织共有24个差异表达miRNAs,其中12个上调,12个下调;Ⅱ级共有35个差异表达miRNAs,其中18个上调,17个下调;Ⅲ级共有34个差异表达miRNAs,其中18个上调,16个下调;Ⅰ级+Ⅱ级+Ⅲ级ccRCC与癌旁正常肾组织共有81个差异表达miRNAs,其中33个上调,48个下调;以表达差异在2倍及以上为标准进行比较,ccRCC与癌旁正常肾组织共有11个差异表达的miRNAs,其中,hsa-miR-487a、hsa-miR-491-3p、hsa-miR-452表达上调,hsa-miR-142-3p、hsa-miR-22、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-29a、hsa-miR-429、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-125b表达下调。结论与癌旁正常肾组织中存在肿瘤相关特异性miRNAs表达谱,这种miRNAs差异可能导致ccRCC的发生及发展。     

神经酰胺通过JNK-c-Jun信号通路诱导胶质瘤细胞自噬性死亡

目的探讨神经酰胺对大鼠脑胶质瘤细胞C6自噬性死亡的影响及其作用机制。方法不同浓度神经酰胺作用于C6细胞后,用MTT法检测细胞的存活率,流式法检测细胞凋亡的改变;Western blotting及电镜的方法观察细胞自噬水平的改变,以及JNK及其下游靶分子c-Jun的磷酸化水平变化;最后进一步借助JNK特异性抑制剂SP600125抑制JNK的活性,观察其对神经酰胺诱导的细胞自噬情况的影响。结果与对照组相比,神经酰胺作用24 h后,C6细胞存活率明显降低,且具有剂量依赖性,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,神经酰胺作用24 h后,C6细胞死亡明显升高且具有剂量依赖性,差异有统计学意义(P<0.05),但其中凋亡性死亡比例较低;神经酰胺作用后细胞内自噬小体数目,LC3B/LC3A的比值,Beclin-1的表达水平,以及JNK和c-Jun磷酸化水平都显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);提前给予JNK特异性抑制剂SP600125抑制JNK的活性后,显著阻断神经酰胺诱导的细胞自噬。结论神经酰胺可诱导胶质瘤细胞C6发生自噬性死亡,其诱导胶质瘤细胞发生自噬的机制可能与激活JNK信号通路有关。