人GRP94基因慢病毒载体构建及稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌HeLa细胞株筛选及鉴定

目的:构建人葡萄糖调节蛋白 94(GRP94)基因慢病毒载体,筛选稳定表达GRP94蛋白的人宫颈癌细胞株,筛选GRP94结合蛋白,为探讨GRP94对宫颈癌的调控作用提供细胞模型。方法:采用RT-PCR法从HeLa细胞中扩增GRP94基因片段,连接到慢病毒载体pLVX-IRES-Hyg中,获得重组载体。瞬时转染293T细胞,采用Western blotting 法检测GRP94蛋白表达量。pLVX-FLAG-GRP94重组质粒通过与包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。以慢病毒感染HeLa细胞,筛选并鉴定稳定表达GRP94蛋白的细胞株。用稳定表达FLAG-GRP94的HeLa细胞株,银染后利用质谱筛选结合蛋白,并经免疫共沉淀验证。结果:重组慢病毒载体经双酶切和基因测序比对鉴定正确。HeLa细胞经慢病毒感染,药物筛选后获得的稳定表达株中GRP94蛋白表达量高于野生型HeLa细胞(P<0.01)。成功钓取出一种与肿瘤发生发展密切相关的SND1蛋白。结论:成功构建了GRP94基因慢病毒载体pLVX-FLAG-GRP94,并筛选出稳定表达GRP94蛋白的HeLa细胞株,为进一步明确肿瘤的发生、发展机制奠定了基础。     

婴儿利什曼原虫磷酸烯醇丙酮酸羧基酶优势表位基因的分子克隆与表达

目的 基于前期分析并选取的婴儿利什曼原虫PEPCK的优势表位基因,构建相应重组原核表达载体以获得重组蛋白,构建相应重组真核表达载体并验证真核载体在NIH3T3细胞中的表达,为后续动物的免疫和感染实验备下基础。方法 根据PEPCK优势表位基因序列,经PCR反应及酶切连接构建重组原核与真核表达质粒pET32a-PEPCK和pVAX1-EPEPCK并分别转染至E. coli和NIH3T3细胞中进行表达。采用SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定原核重组质粒在大肠杆菌中的表达和原核表达蛋白被镍柱纯化后的情况,采用免疫荧光实验验证真核重组质粒在细胞中的表达。结果 重组原核与真核载体的正确测序结果表明重组载体构建成功。SDS-PAGE电泳和Western Blot的结果显示,大肠杆菌中表达的原核重组蛋白以及纯化后的蛋白在48.08 kD处存在条带,转染了真核重组载体的NIH3T3细胞的免疫荧光结果呈阳性。结论 成功构建了PEPCK优势表位基因的重组原核和真核表达载体:pET32a-PEPCK和pVAX1-EPEPCK,成功表达相应的重组蛋白并纯化并验证了pVAX1-EPEPCK在NIH3T3细胞中的表达,为后续DNA疫苗初次免疫和蛋白疫苗加强免疫的动物实验备下基础。     

一种新型重组免疫毒素DT390-Rantes真核表达质粒的构建及功能

目的 构建一种新型重组免疫毒素DT390-Rantes的真核表达质粒,并对这种免疫毒素的功能进行初步研究。方法 通过RT-PCR的方法,从小鼠肝脏中获得Rantes基因;将Rantes基因插入到含有DT390片段的真核质粒SRα中,构建成重组质粒;重组质粒转入大肠杆菌JM109,筛选出含有正确插入片段的克隆;限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒,并进行DNA序列分析;用脂质体介导法转染NIH3T3细胞,免疫荧光检测重组质粒的表达情况;MTT法测定DT390-Rantes的表达活性。结果 经过酶切分析及DNA测序证实,Rantes基因正确插入到真核表达质粒SRα中,并在NIH3T3细胞中表达;MTT法证实,重组免疫毒素DT390-Rantes能在体外杀伤活化的T细胞。结论 成功地构建了一种新型重组免疫毒素真核表达质粒DT390-Rantes-SRα,该质粒可在真核细胞中瞬时表达,其转染上清对活化的T细胞具有杀伤作用。     

小鼠CTLA4-Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建小鼠细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4Fc融合基因（CTLA4-Fc）的真核表达质粒,并检测其在293T细胞中的表达,为后续在小鼠体内研究CTLA4-Fc抗肿瘤作用机制奠定基础。方法 Gene Runner 软件设计并合成互为搭桥、互为模板的CTLA4融合基因引物,利用重叠PCR方法扩增获得CTLA4基因片段,与pcDNA3.1(+)/Fc (Mouse IgG2a)质粒同时进行双酶切,连接合成CTLA4-Fc融合基因表达质粒;菌落PCR扩增、双酶切以及测序鉴定后,在293T细胞中瞬时转染表达融合基因的质粒,ELISA法检测其在293T细胞内的蛋白表达含量。结果 成功构建CTLA4-Fc融合基因。经菌落PCR和双酶切,琼脂糖电泳检测到CTLA4-Fc片段长度为1 200 bp,CTLA4片段长度为568 bp DNA。将阳性重组克隆菌落挑于液体LB培养基中扩大培养并将菌液送公司测序,测序结果证实DNA序列与GenBank同源性为100%。通过ELISA方法能够检测到CTLA4-Fc质粒在293T细胞中的表达。结论 CTLA4-Fc融合基因正确克隆入pcDNA3.1(+)/Fc (Mouse IgG2a)质粒中,该质粒能够在293T细胞中表达。本研究利用重叠PCR技术扩增获得CTLA4基因序列,能够快速获得目的 基因扩增产物,提高了实验的成功率。     

p38调节活化蛋白激酶绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的 构建在哺乳动物细胞中表达的PRAK绿色荧光蛋白融合表达载体。方法 将克隆在pET-14b上的PRAK亚克隆到绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上,随后转染Hela细胞,并在荧光显微镜下观察。结果 重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,并在Hela细胞中得到高量表达。融合蛋白发出的绿色荧光表明EGFP-PRAK主要分布在细胞核中。结论 成功构建了PRAK绿色荧光蛋白融合载体,该载体能在哺乳动物细胞中进行表达,为研究PRAK的细胞内定位和移位提供了一个重要的工具。     

二氢嘧啶脱氢酶基因T85C位点突变与乳腺癌细胞5-氟尿嘧啶敏感性的关系

目的:探讨二氢嘧啶脱氢酶基因（DPYD）T85C位点突变对乳腺癌细胞5-氟尿嘧啶（5-FU）敏感性的影响。方法:从肝脏组织中提取mRNA,扩增得到野生型DPYD编码序列。利用定点突变技术,获得T85C定点突变的DPYD编码序列。将GFP、野生型和突变型DPYD序列,连入PCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体。转染上述三种质粒到MDA-MB-231细胞中,获得稳定表达的细胞株。MTT法检测不同浓度5-FU（0、1、5、10、50μg/mL）处理24h后,细胞存活情况。结果:酶切验证三种重组质粒,观察到目的序列。测序验证定点突变质粒,突变位点发生T到C的改变。相比对照组,突变型细胞的存活率显著增高（P <0.01）,且突变型细胞存活率高于野生型（P <0.05）。结论:DPYD基因突变影响乳腺癌细胞对5-FU敏感性,T85C突变型DPYD细胞对5-FU的敏感性显著降低。

?     

微管相关蛋白tau转基因细胞和动物模型的建立及tau蛋白病变表征

目的 构建并表征tau及突变tau蛋白细胞和动物模型,检测模型tau蛋白及磷酸化tau蛋白表达情况及微管的形态,为tau蛋白及相关疾病的研究提供疾病模型。方法 将不同的质粒分别转染到HEK293细胞中,构建过表达野生型tau以及P301L/P301S突变tau的细胞模型。引进并繁育rTg4510小鼠（P301L突变tau转基因小鼠）以及PS19小鼠（P301S突变tau转基因小鼠）。通过Western blotting法检测总tau及磷酸化tau蛋白的表达,应用免疫组织化学的方法检测转基因小鼠脑内磷酸化tau蛋白的表达情况,应用免疫荧光的方法检测HEK293细胞微管形态的变化。结果 本研究成功构建过表达tau蛋白的细胞模型,繁育了两种tau转基因小鼠,在这些模型中tau蛋白表达及tau蛋白的磷酸化水平显著高于对照组。在不同突变类型的细胞和动物模型中,tau蛋白不同位点的磷酸化水平变化以及微管形态变化略有差异。结论 本研究成功构建了P301L/P301S突变tau蛋白的细胞和动物模型,这些模型均表现了显著的tau蛋白过度磷酸化的病变,并引起了细胞微管形态或tau蛋白病理的变化,进而为包括AD在内的tau蛋白病变提供了实验模型。     

人GFP-AWP1融合基因载体的构建及其在293细胞中的表达

目的 克隆、构建绿色荧光蛋白(GFP)-AWP1(associated with protein kinase C related kinase 1,AWP1)表达载体,观察AWP1在293细胞中表达和定位。方法 采用逆转录PCR(RT-PCR)法从人ECV304内皮细胞中扩增AWP1cDNA编码区,并将其重组于GFP表达载体pEGFP-C2中。经酶切、序列鉴定分析后,将该重组质粒通过DOTAP脂质体介导,转染293细胞。荧光显微镜观察AWP1在细胞内的表达和分布。结果 GFP-AWP1融合基因表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在293细胞中获得了高效表达。荧光显微镜下,在不携带外源基因的空载体pEGFP-C2转染的对照组293细胞,绿色荧光均匀分布于整个细胞中;在重组质粒pEGFP-C2/AWP1转染的293细胞,绿色荧光弥散分布于细胞质内。结论 成功构建GFP-AWP1融合基因表达载体并表达于293细胞胞质中。     

不可分型流感嗜血杆菌外膜蛋白P6基因真核质粒的构建及表达

目的:构建不可分型流感嗜血杆菌(nontypeableHaemophilus influenzae,NTHi)外膜蛋白P6(outermembrane protein P6,P6)真核表达的重组质粒,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的开发奠定基础。方法:以NTHi基因组为模板,扩增编码P6蛋白的基因片段,酶切、纯化P6基因与真核载体pcDNA3.1/HisA后进行连接,之后转化并筛选含有目的基因的重组质粒pcDNA3.1/HisA-P6;将重组子转染至HeLa细胞,荧光蛋白法检测其表达产物。结果:经质粒PCR、酶切、测序证实插入的基因片段为NTHi-P6蛋白编码基因;荧光显微镜下显示,该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论:成功地构建了真核重组质粒pcD-NA3.1/HisA-P6,并在HeLa细胞中表达。     

重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体转染293细胞和CD34+细胞

目的 研究重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染293细胞(人胚肾细胞)和人CD34⁺细胞后绿色荧光蛋白的表达情况。方法 用CS-3000血细胞分离机分离骨髓单个核细胞,免疫磁性分离仪纯化CD34⁺细胞,重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染两种细胞,并通过荧光显微镜、流式细胞仪对绿色荧光蛋白的表达进行分析。结果 荧光显微镜下两种细胞均可见绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪于一定时间内检测293细胞的基因转导效率最高为32.8%,CD34⁺细胞的基因转导效率最高为25%,在所观察的时间内,转染率呈先升高后降低趋势。结论 重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体能转染293和CD34⁺细胞,绿色荧光蛋白基因可作为良好的报告基因,为将来的干细胞基因治疗打下良好基础。     

不同亚型的囊性肾癌诊疗与预后分析

?目的:探讨不同亚型的囊性肾癌的诊疗及预后情况。方法:回顾性分析75例囊性肾癌患者的临床资料。患者术前影像学检查:56例考虑恶性病变,13例考虑单纯性肾囊肿,6例考虑为多房性肾囊肿。47例行根治性肾切除术,其中开放手术20例,腹腔镜手术27例;保留肾单位手术14例,其中开放手术9例,腹腔镜手术5例;后腹腔镜下肾囊肿去顶减压术13例 ,其中2例术中冰冻病理检查提示恶性,同期行根治性肾切除术,9例术后2～3周二期行根治性肾切除术,2例密切随访;1例行保留肾单位手术,术中冰冻病理检查提示恶性病变,同期行根治性肾切除术。结果:75例术后病理报告均为囊性肾癌,其中肾细胞癌囊性变38例,多房囊性肾癌16例,单房囊性肾癌（囊腺癌）8例,肾囊肿恶变13例。随访25～147个月,平均63个月,未见肿瘤复发和转移。结论:囊性肾癌的诊疗及预后需根据不同的亚型分析,保留肾单位手术可作为囊性肾癌的一种可选择的治疗方式。     

会厌囊肿等离子手术与传统方法围手术期术后不良反应的对照研究

目的: 探讨会厌囊肿等离子手术与传统手术围手术期术后不良反应发生率的差异及影响术后不良反应的相关因素。方法: 对施行会厌囊肿摘除术病人,采用逐一配对法进行配对,纳入等离子手术组（治疗组）90例,传统手术组（对照组）90例。对比两组术中与术后1周内不良反应的发生情况,并对全组术后不良反应的相关因素进行多因素回归分析。结果: 等离子手术组与传统手术组无术中不良反应,术后不良反应发生率分别为27.8%（25/90）和60.0%（54/90）,二者差异具有统计学意义（P＜0.05）。其中,治疗组和对照组术后24小时内出血、吞咽疼痛的发生率分别为5.6%和16.7%,14.4%和37.8%,差异均具有统计学意义（P＜0.05）,而两组术后呼吸困难和进食呛咳的发生率比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）。多因素回归分析发现,手术时间和是否等离子手术是影响会厌囊肿摘除术后不良反应发生的独立危险因素（P＜0.05）。结论: 会厌囊肿等离子手术术后不良反应发生率低于传统手术。是否等离子手术和手术时间是影响会厌囊肿摘除术后不良反应发生的独立危险因素。     

不同全麻药物对体外循环患者氧化应激反应影响的比较

目的:观察不同麻醉方式对体外循环冠状动脉搭桥术（CABG）患者围术期氧化应激反应的影响。方法:择期拟行体外循环下CABG术患者45例,随机分为3组(每组15例):丙泊酚组（P组）、依托咪酯组（E组）和七氟烷组（S组）。分别于麻醉前、手术切皮时、体外循环开始前、手术结束时、术后6 、24 、48 、72　h（T_0～7）记录患者心率（HR）和平均动脉压（MAP）,并于T₀、T_4～7时取血测定过氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）含量。结果:3组患者在T₅和T₆时点SOD、CAT和GSH-Px活性均低于术前（P<0.05）。S组在T₇ 时点SOD和GSH-Px活性依然低于术前（P<0.05）。E组和S组的SOD、CAT和GSH-Px活性在术后均不同程度低于P组（P<0.05）。与E组相比,S组SOD、 CAT和GSH-Px活性在术后有不同程度升高（P<0.05）。结论:与七氟烷和依托咪酯相比较,丙泊酚能更好地对抗体外循CABG术围术期的氧化应激反应。     

高水碘摄入对成人空腹血糖影响的探讨

Objective:To investigate the blood glucose level in different iodine status, then explore the impact of excess-iodine-intake on fasting blood-glucose. Methods:Adults were chosen from Haixing County in Cangzhou, Hebei. Llimosis morning-urinary and venous blood were collected to measure the levels of urinary iodine. Chemilu-minescent immunoassay was used to perform free triiodothyronine (FT₃), free thyroxine (FT₄), and sensitive thyroid-stimulating hormone (sTSH) in serum. Fasting blood-glucose was also measured by glucometer. Results:The median of water iodine in the excess-iodine-intake area (841.4 μg/L) was higher than that in the control area (12.79 μg/L, P<0.05). For adults’ urine iodine, the excess-iodine-intake area was higher(P<0.05), with the value of 1 137.3（646.8～1 450.8）μg/L vs 216.6（146.5～366.9）μg/L. The level of FT₃ in the excess-iodine-intake area was lower (P<0.05), with the value of （4.72±0.48） pmol/L vs （4.96±0.36）pmol/L. No significant difference was found in the FT₄ level in the areas. The median of sTSH in the excess-iodine-intake area was higher than that in the control area, with the value of（3.07±2.17）μIU/ mL vs （2.30±1.07） μIU/mL . And the prevalence of thyroid disease in the excess-iodine-intake area was higher, with 43(22.75%) vs 8(10.13%). No significant difference in the level of the fasting blood-glucose was found in the areas (P>0.05). Age and FT₄ were found positively correlated with fasting blood-glucose by correlation analysis（r=0.258,P<0.001; r=0.154,P=0.013）, while the others were not related. Conclusion:Difference in fasting blood-glucose in water-iodine-excess area and the control area does not exist. Yet further study should be taken in a larger population-based epidemiological investigation to confirm the effects of excess-iodine-intake on glucose.      

重症监护病房内耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染现状分析

目的　:研究重症监护病房(ICU)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的发生率和危险因素,为采取措施预防与控制MRSA感染提供科学依据。方法:2012-2013年天津市某三级甲等医院综合ICU内MRSA感染患者作为病例组,非MRSA感染患者作为对照组,采用流行病学研究方法,根据综述、专家咨询以及实际工作经验,最终确定变量进行危险因素分析;应用非条件Logistic回归分析对资料进行单因素分析与多因素分析,寻找MRSA感染的独立危险因素。结果　:MRSA感染发生率为62.79％,其中,2012年发生率为68.18％,2013年发生率为57.14％,MRSA 感染部位以下呼吸道为主;Logistic回归统计分析显示:年龄（OR= 1.047,95%CI:1.009^～1.086）、ICU住院时间（OR= 1.050,95%CI:1.012^～1.089）、使用激素/免疫抑制剂（OR= 2.853,95%CI:1.177^～6.911）、机械通气（OR= 4.918,95%CI:1.175^～20.583）、抗菌药物使用超过7 d（OR= 3.257,95%CI:1.055^～10.058）是MRSA感染的独立危险因素。结论　:高龄、长期入住ICU、进行机械通气、使用激素/免疫抑制剂、长期使用抗菌药物是ICU内MRSA感染的危险因素。     

人巨细胞病毒IE1真核表达载体的构建与表达

目的构建人巨细胞病毒（HCMV）IEl真核表达载体，观察其在真核细胞内的表达，为HC—MVIEl核酸疫苗的相关研究奠定基础。方法将质粒pNEBl93-IEl用Sal I、BamH I双酶切与载体pEGFP—C1连接构建重组载体pEGFP—C1-IEl；双酶切鉴定后，取重组载体pEGFP—C1-IEl用EcoR I 、Hind Ⅲ／双酶切与载体pcDNA3．1（-）连接构建重组质粒pcDNA3．I（-）-IEl，双酶切和测序鉴定；将重组质粒pcDNA3．1（-）-IEl转染HeLa细胞，RT—PCR检测IElmRNA的表达。结果重组载体pEGFP—C1-IEl和pcDNA3．1（-）-IEl双酶切后均可切出约1476bp目的片段；重组载体pcDNA3．1（-）-IEI测序结果登录C,enBank，作BLAST分析，含有1476bp目的基因片段，无碱基错配和移码突变，与读码框完全-致；转染重组载体pcDNA3．1（-）-IEl的细胞中可扩增出约1476bp的目的条带。结论成功地构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-IEl，且其能在真核细胞内袁达。     

呋喃鬼臼毒素衍生物及其抗肿瘤活性研究

目的:获得抗肿瘤活性更强的鬼臼毒素衍生物。方法:以鬼臼毒素为起始原料,通过把取代呋喃和鬼臼毒素拼接,设计并合成5个4β-N-取代呋喃鬼臼毒素衍生物,目标产物的结构通过¹H-NMR, ¹³C-NMR和HRMS的确证,同时采用 MTT 法评价了新化合物对HeLa, K562和K562/A02的细胞毒活性。结果: 合成的5个化合物中具有确切的细胞毒活性,其中化合物7c和11b对于耐药肿瘤细胞K562/A02的活性明细优于阳性对照依托伯苷。结论:把取代呋喃连接到鬼臼毒素可以增加抗肿瘤活性。     

PRL-3基因C104S位点突变体和CAAX缺失体的构建及表达

目的:分别构建肝再生磷酸酶-3(phosphatase of regenerating liver 3,PRL-3)基因C104S位点突变和C端CAAX缺失的myc标签和GFP荧光标签重组质粒pcDNA3-myc-PRL-3(C104S)、pEGFP-PRL-3(C104S)、peDNA3-myc-PRL-3(△CAAX)和pEGFP-PRL-3(△CAAX),并进行真核表达,为PRL-3的后续功能研究提供有效的工具.方法:设计PRL-3基因C104S点突变、c端CAAX缺失的特异性引物,以peDNA3-myc-PRL-3质粒为模板,通过基因克隆、一步法点突变的方法构建各重组质粒,通过酶切和测序鉴定后转染真核细胞,检测其在细胞中的表达并观察定位情况.结果:成功构建了4种重组质粒,并能在结肠癌细胞LoVo中表达.用激光共聚焦扫描显微镜对细胞中绿色荧光融合蛋白的定位观察发现,当PRL-3的CAAX位点缺失后,PRL-3由内膜系统大量入核,与理论预期相符.结论:获得了PRL-3基因C104S位点突变体和CAAX缺失体重组真核表达质粒并能在细胞中表达,为进一步研究PRL-3的功能提供了条件.