CD44+/CD24+表型的宫颈癌Siha细胞对顺铂的耐药及机制研究

背景与目的：肿瘤干细胞的存在是肿瘤细胞抗拒化疗的原因之一。该研究探讨CD44⁺/CD24⁺宫颈癌Siha细胞对顺铂的耐药性及相关机制。方法：体外培养Siha细胞,流式荧光激活细胞分选仪分选CD44⁺/CD24⁺Siha细胞,噻唑蓝(thiazolyl blue,MTT)法检测不同浓度顺铂对细胞的体外抑制情况,采用流式细胞仪检测10 μg/mL顺铂作用于CD44⁺/CD24⁺ Siha细胞24、48和72 h时的细胞凋亡率,实时定量聚合酶链式反应(quantitutive real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和蛋白［质］印迹法(Western blot)检测CD44⁺/CD24⁺ Siha细胞中Oct-4、ABCG2、Bcl-2的表达,同时设立亲代Siha细胞作为对照。结果：不同浓度顺铂(0.1、1、5、10、15和20 μg/mL)对CD44⁺/CD24⁺ Siha细胞的增殖抑制作用较亲代Siha细胞小［(88.4±1.5)% vs (92.9±1.5)%,(79.9±1.0)% vs (84.7±1.1)%,(69. 8±0.8)% vs (75.1±2.9)%,(59.0±0.7)% vs (65.8±2.7)%,(49.6±0.9)% vs(52.1±0.5)%,(45.1±0.7)% vs (48.8±1.0)%,P<0.05］;与亲代细胞相比,当10 μg/mL顺铂作用于CD44⁺/CD24⁺Siha细胞时,发现在24、48和72 h时的细胞凋亡率均较小［(3.05±0.16)% vs (5.17±0.27)%,(17.94±2.02)%vs (32.60±4.28)%和(40.14±3.01)% vs (56.62±5.32)%,P<0.05］。qRT-PCR和Western blot实验均显示CD44⁺/CD24⁺ Siha细胞高表达Oct-4、ABCG2和Bcl-2,与亲代Siha细胞比较差异有统计学意义(P=0.015)。结论：CD44⁺/CD24⁺ Siha细胞可以抵抗顺铂诱导的细胞凋亡,具有化疗抵抗性,并且高表达肿瘤干细胞表面标志物如Oct-4和ABCG2,该结果在宫颈癌肿瘤干细胞的有效分选以及肿瘤靶向治疗方面有深远意义。     

不同乳腺癌干细胞亚群的自我更新和致瘤能力差异

目的 分析原代培养乳腺癌细胞中不同乳腺癌干细胞亚群的自我更新、致瘤能力差异。方法 采用流式细胞术和免疫荧光实验,从乳腺癌原代培养细胞中分选、鉴定CD44⁺CD24^-/low、ALDH1⁺和ALDH1⁺CD44⁺CD24^-/low细胞亚群,分析各分选细胞占总肿瘤细胞的比例;通过克隆形成实验观察各组细胞的自我更新能力;通过裸鼠致瘤实验观察各组细胞的致瘤能力。结果 CD44+CD24^-/low细胞占总细胞比例的7.2%,ALDH1⁺细胞所占比例为4.6%,ALDH1⁺CD44⁺CD24^-/low细胞所占比例为1.5%。三组细胞自我更新和致瘤能力由强至弱依次为ALDH1⁺CD44⁺CD24^-/low、ALDH1⁺、CD44⁺CD24^-/low细胞,各组细胞间比较差异均存在统计学意义（P<0.05）。 结论 乳腺癌组织中CD44+CD24-/low、ALDH1⁺和ALDH1⁺CD44⁺CD24^-/low三组乳腺癌干细胞亚群之间的自我更新和致瘤能力有明显差异,ALDH1⁺CD44⁺CD24^-/low亚群细胞具有最强的自我更新和致瘤能力,提示ALDH1⁺CD44⁺CD24^-/low可能是更具有特异性的乳腺癌干细胞标志物。     

乳腺癌细胞系中肿瘤干细胞相关亚群的初步研究

目的 通过乳腺癌细胞系及其干细胞的培养,化疗药干预和流式细胞仪筛选鉴定,探讨不同乳腺癌细胞系中CD44⁺CD24^-/low细胞比例,及富集乳腺癌干细胞相关亚群的方法。方法 通过细胞培养乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231,观察生长曲线,比较化疗药物干预下生长情况;利用流式细胞仪检测两种乳腺癌细胞系中CD44⁺CD24^-/low细胞比例;无血清悬浮培养,化疗药(多西紫杉醇、表阿霉素)干预这两种乳腺癌细胞系,观察其是否形成细胞球。结果 (1)MDA-MB-231细胞系倍增时间短,生长速率高于MCF-7细胞系;(2)MCF-7细胞系中可能存在较大比例肿瘤干细胞,其对化疗抵制,能自我更新;(3)化疗敏感性用两独立样本t检验,MCF-7细胞,差异没有统计学意义;MDA-MB-231细胞,差异有统计学意义,提示MDA-MB-231细胞系对该方案化疗较敏感;(4)无血清悬浮培养,MDA-MB-231细胞系未发现明显细胞球;MCF-7细胞系初次无血清培养约6天出现细胞球。加入化疗药筛选后两种细胞,见大部分肿瘤细胞逐渐死亡,未发现明显细胞球;(5)流式细胞仪检测,MCF-7、MDA-MB-231两种细胞系中主要是CD44⁺CD24⁺亚群和CD44^-CD24⁺亚群,CD44⁺CD24^-/low细胞比例分别2.07%和0.20%。结论 (1)MDA-MB-231细胞系增值较快,恶性度相对较高,其对TA联合化疗药物较敏感;MCF-7细胞系中可能存在少量肿瘤干细胞,对化疗抵制,能自我更新;(2)无血清培养液培养MCF-7细胞系能形成悬浮细胞球;流式细胞仪检测两种细胞系中CD44⁺CD24^-/low细胞比例小;(3)CD44⁺CD24^-/low表型可能不是乳腺癌干细胞唯一特异性的表面标志。     

CD44+CD24-/low在基底样乳腺癌中过表达与其恶性预后的相关性研究

目的探讨乳腺癌干细胞样标志物CD44⁺CD24^-/low在基底样乳腺癌(basal-like breast carcinoma, BLBC)中过表达与BLBC恶性预后的相关性。方法 在乳腺癌基因表达分型的基础上, 根据雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人类表皮生长因子受体2(Her-2)免疫表型的表达选取乳腺癌组织四组:管腔A组、管腔B/C组、Her-2高表达组及三阴性组;对三阴性组检测CK5/6、EGFR, 分为正常乳腺样型和BLBC型两组;对上述5组进行免疫组化Envision法染色, 选用抗体为CD44、CD24, 观察CD44⁺CD24^-/low表型表达并比较BLBC组与其它各组的差异。结果 (1)三阴性组共60例, CK5/6和或EGFR阳性者41例(68.3%), 确定为BLBC;CK5/6、EGFR阴性者19例(31.7%), 确定为正常乳腺样组;(2)CD44⁺CD24^-/low表型在BLBC组中占78.0%(32/41), 相对于管腔A组37.9%(11/29)、管腔B组25.9%(7/27)、Her-2高表达组17.2%(5/29)、正常乳腺样组26.3%(5/21), 表达增高并具有显著性(P＜0.05);(3)所有150例乳腺癌中(可评价145例)具有CD44⁺CD24^-/low免疫表型者其Ki-67指数增高相对于非CD44⁺CD24^-/low表型具有统计学差异(P＜0.001)。结论 BLBC型乳腺癌表达乳腺癌干细胞样标志物CD44⁺CD24^-/low显著高于其它各型乳腺癌, CD44⁺CD24^-/low与BLBC独特的恶性生物学行为相关。     

结直肠癌肿瘤微环境中调节性T细胞CD39、CD73亚群及二者双阳性亚群的临床意义

目的 观察结直肠癌肿瘤组织微环境中浸润的调节性T细胞的临床意义,并探究其CD39、CD73及CD39,CD73双阳性亚群与肿瘤微环境中其他淋巴细胞及临床病理参数之间的关系。方法 收集24例结直肠癌患者根治术后组织标本,剪碎并分离培养组织内肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocyte,TIL),以流式细胞术观察调节性T细胞CD39⁺、CD73⁺及CD39⁺CD73⁺亚群与患者临床病理参数之间的关联。结果 结直肠癌肿瘤组织微环境中浸润的调节性T细胞CD73⁺亚群,CD39⁺CD73⁺亚群与淋巴结转移及分化程度不良具有相关性,并且其机制与肿瘤相关性炎症密切相关。结论 相比Treg中的其他亚群,CD39⁺CD73⁺阳性的结直肠肿瘤浸润Treg具有更为独特的生物学活性,本研究为预测结直肠癌预后提供了新思路与理论依据。     

免疫磁珠分选的口腔鳞状细胞癌干细胞诱导分化及成瘤活性研究

目的 探讨口腔鳞状细胞癌干细胞的诱导分化及成瘤活性。方法 采用免疫磁珠分选法从6例原代培养的口腔鳞状细胞癌细胞中分选出CD133⁺、CD44⁺细胞，以流式细胞术检测其纯度及细胞周期，并绘制CD133⁺细胞生长曲线。将分选出的细胞经诱导向成骨肪细胞及成脂肪细胞分化，将原代鳞癌细胞、分选所得的CD44⁺细胞及CD133⁺细胞进行体内成瘤实验。 结果 经免疫磁珠分选法成功获得CD44⁺细胞、CD133⁺细胞，其纯度经检测均在94%以上，且主要处于G0/G1期。CD133⁺细胞在接种后第2天进入对数期，细胞倍增时间为3.22 d。经诱导后CD44⁺、CD133⁺细胞成功分化为成骨细胞及成脂肪细胞。皮下注射后第3天可触及新生肿物，在3种细胞成瘤实验中CD133⁺细胞组瘤体体积最大，HE染色显示符合低分化口腔鳞状细胞癌病理表现。结论 免疫磁珠分选法可高效获得高纯度的口腔鳞状细胞癌干细胞。CD44⁺、CD133⁺细胞均具有较强的多向分化能力，CD133⁺细胞成瘤性较强。     

肺腺癌浸润CD8+T细胞表达CD39的机制

目的：探讨肿瘤浸润CD8⁺T细胞表达CD39的可能机制。方法：通过TCGA数据库的肺腺癌(LUAD)组织及正常肺组织转录组数据分析CD39在LUAD组织和正常肺组织中的表达差异及其对患者预后的影响,分析CD39表达与T细胞浸润、激活的关系。用小鼠LUAD Lewis细胞建立小鼠皮下移植瘤模型,FCM检测淋巴结、脾脏以及移植瘤组织中CD8⁺CD39⁺T细胞。收集Lewis细胞培养上清液作为条件培养基(CCM),免疫磁珠法(MACS)分选CD8⁺T细胞、CD11b⁺细胞;在培养基中分别加入CCM、IL-6和采取非接触或接触培养方式进行培养,探索CD8⁺T细胞表达CD39的可能机制。结果：CD39在LUAD组织中呈低表达(P<0.01),其表达水平与LUAD患者OS、T细胞浸润和激活水平均呈正相关(P<0.05或P<0.001)。FCM检测结果显示,在移植瘤组织中CD8+CD39⁺T细胞的比例明显高于淋巴结及脾脏(P<...     

结直肠癌及腺瘤患者CD4+、CD8+和CD28+T淋巴细胞的亚群变化及临床意义

背景与目的：结直肠癌（colorectal cancer,CRC）严重影响患者生存。探讨肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）T细胞亚群在CRC和腺瘤中的表达及意义。方法：用免疫组织化学法和流式细胞术对51例健康人（对照组）、46例结直肠腺瘤（腺瘤组）、100例CRC（癌症组）和15例CRC术后（癌术后组）患者进行T细胞亚群检测。结果：① 对照组、腺瘤组及癌症组3组中CD4⁺T细胞的阳性率分别是90.00%、43.75%及32.65%,CD8⁺T淋巴细胞的阳性率分别是30.00%、56.25%及75.51%,CD28⁺T淋巴细胞的阳性率分别是42.86%、30.00%及20.00%。② 对照组、腺瘤组及癌症组3组中CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺、CD28⁺、CD8⁺CD28⁺和CD8^－CD28⁺逐渐降低,CD8⁺、CD8⁺CD28^－逐渐增加（P＜0.05）;癌术前术后T细胞亚群差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：① CRC微环境T细胞亚群中CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺、CD28⁺、CD8⁺CD28⁺和CD8^－CD28⁺呈递减趋势,CD8⁺、CD8⁺CD28^－呈递增趋势,且在癌前病变腺瘤中已逐步出现上述趋势变化。② CRC患者行肿瘤切除术后,其T细胞亚群有所恢复,故在一定程度上,CRC中T细胞亚群的变化可以早期预测结直肠疾病的发展。     

CD4+/CD8+ T淋巴细胞在肝细胞癌组织中的浸润及与预后的相关性研究

目的 检测CD4⁺/CD8⁺ T淋巴细胞在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）组织中的浸润程度,并分析其与预后的相关性。方法 收集行肝切除术的HCC患者215例,采用免疫组化技术检测CD4⁺/CD8⁺ T淋巴细胞在HCC癌组织中的浸润程度,根据浸润情况比较患者肝切除术后无瘤生存率和总生存率。结果 CD4⁺ T淋巴细胞高浸润和低浸润比例分别为60.9%和39.1%。CD4⁺ T淋巴细胞高浸润组患者总生存率和无瘤生存率均显著高于低浸润组（P=0.015,P=0.038）。CD8⁺ T淋巴细胞高浸润和低浸润比例分别为34.9%和65.1%。CD8⁺ T淋巴细胞高浸润组患者的总生存率和无瘤生存率亦显著高于低浸润组患者（P=0.033,P=0.047）。结论 CD4⁺或CD8⁺ T淋巴细胞低浸润可能与HCC患者术后不良预后相关。     

基于CD19/IgM亚群分析套细胞淋巴瘤骨髓中T细胞的构比异常

目的:研究T细胞在初诊IV期套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma, MCL)骨髓单个核细胞中的差异表达。方法:首先流式检测健康供者及MCL组中CD19^-/IgM^-,CD19^-/IgM⁺,CD19⁺/IgM^-,CD19⁺/IgM⁺亚群的比例;其次检测CD45⁺CD3⁺T细胞在两组中的总比例;最后检测T细胞在两组四个亚群中的占比。结果:四个亚群在组内有极其显著的差异(P<0.000 1),两组间无统计学差异。T细胞在MCL组占(0.46±0.13)%较健康供者组(1.10±0.06)%显著减少(P=0.025 1)。四个亚群中T细胞占比在健康供者组内有极其显著的差异(P<0.000 1),而MCL组内差异消失(P=0.329 4)。T细胞在MCL组CD19^-/IgM^-亚组中占(0.02±0.01)%较...     

Homing-Associated Cell Adhesion Molecule (H-CAM/CD44) on Human CD34+ Hematopoietic Progenitor Cells

Human CD34⁺ hematopoietic progenitor cells (HPCs) express CD44 and can directly adhere to hyaluronate (HA) via CD44. Furthermore, CD44 may also be involved in the regulation of CD34⁺ HPC proliferation and development. The expression of CD44 molecules on CD34⁺ hematopoietic progenitor cells is significantly lower on bone marrow (BM) CD34⁺ cells compared with circulating CD34⁺ cells in cord blood and peripheral blood. Myeloid and erythroid progenitor cells are found predominantly in CD34⁺CD44^- cell fractions. More interestingly, CD34⁺CD44⁺ cells expressing B-lymphocyte-associated CD10 and CD19 would represent unique B-lymphocyte committed precursors in the BM, which might undergo apoptotic cell death in the early steps of B-cell differentiation.     

CD34+ CD90+ cells and late hematopoietic reconstitution after autologous peripheral blood stem cell transplantation

Autologous peripheral blood stem cell transplantation (PBSCT) has been demonstrated to result in rapid, stable long-term engraftment. However, there has been considerable debate concerning the cells responsible for early and late hematopoietic reconstitution after PBSCT. Recently, CD34⁺ hematopoietic stem and progenitor cells have been clearly divided into two subpopulations by flow cytometry; namely undifferentiated pluripotent stem cells and differentiated committed progenitor cells. However, only a few studies have defined which subset contained in graft products might be the most predictive for late hematopoietic reconstitution after PBSCT. In this review, we present updated information regarding the relationships between the number of infused CD34⁺ cells or their immature subsets such as CD34⁺CD90⁺ cells and the late hematopoietic reconstitution after PBSCT, and discuss the threshold dose of CD34⁺CD90⁺ cells required for sustained long-term engraftment.     

Proportion of CD4+CD25+ regulatory T cell is increased in the patients with ovarian carcinoma

Objective: To study the frequency of the CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells (Tregs) in the patients with ovarian carcinoma and its possible mechanism. Methods: The percentages of CD4⁺CD25⁺ Tregs in the peripheral blood lymphocytes (PBLs), tumor infiltrating lymphocytes (TILs) and tumor associated lymphocytes (TALs) from 13 patients with ovarian carcinoma and in the PBLs from 14 healthy women were determined by flow cytometry. The expression of CD69 on CD4⁺PBLs from the patients was detected. PBLs from healthy women were cultured in complete RPMI 1640 containing the supernatant from SKOV3 cell line with or without PHA (phytohemagglutinin) stimulation for 72 hours, then the percentage of CD4⁺CD25⁺ T cells was detected. Results: CD4⁺CD25⁺ Tregs in the PBLs from patients with ovarian carcinoma were significantly increased compared with those from the control. The percentage of CD4⁺CD25⁺ Tregs in TILs was higher than that in PBLs and TALs from the patients, but not significantly. The expression of CD69 on CD4⁺PBLs from the patients was negative. The percentages of CD4⁺CD25⁺ T cells in PBLs cultured with SKOV3 supernatant elevated significantly compared with those without supernatant whether PHA was added or not (P = 0.001 and 0.001, respectively). Conclusion: There is an increasing of the proportion of CD4⁺CD25⁺ Tregs in PBLs, TILs and TALs of the patients with ovarian carcinoma, which probably results from up-regulation of soluble factor secreted by ovarian carcinoma cells.     

采用肝癌球体细胞筛选鉴定识别肝癌干细胞的单抗

目的 采用肝癌球体细胞筛选鉴定识别肝癌干细胞的单抗,为靶向肿瘤干细胞治疗肝癌提供候选治疗单抗。方法 采用无血清悬浮培养的方法富集培养肝癌干细胞。通过细胞免疫荧光、顺铂耐药实验、Real-time PCR、裸鼠皮下成瘤实验等方法筛选、鉴定抗肝癌干细胞单抗。采用免疫组织化学的方法鉴定单抗识别的抗原在肝癌组织中的表达情况。质谱鉴定抗原。结果 MHCC97L细胞能在无血清悬浮培养条件下形成细胞球,并能被PKH26染料标记。流式细胞检测发现MHCC97L球体细胞中CD90表达比例较亲本细胞提高了3.4倍。无血清成球抑制实验获得6株显著抑制MHCC97L细胞在无血清成球的单抗,抑制率分别为54.67%,50.33%,45.73%,42.26%,39.11%,37.63%。细胞免疫荧光结果显示单抗28C10和CD90在MHCC97L细胞中能共定位。Real-Time PCR检测结果显示MHCC97L 28C10⁺细胞Sox-2和Oct-4表达显著高于MHCC97L 28C10^-细胞。流式细胞检测,在MHCC97L及其sphere细胞中28C10⁺细胞比例分别为7.98%和10.7%,28C10⁺细胞比例提高了1.34倍。流式细胞术分选获得的28C10⁺细胞的体外成球能力、侵袭能力显著高于28C10^-细胞。CCK-8法检测结果显示28C10⁺细胞较28C10^-细胞显示出对化疗药物顺铂的耐药,IC₅₀分别为1.96 μg/mL和1.16 μg/mL。裸鼠致瘤实验结果显示,28C10⁺细胞裸鼠皮下接种2×10⁴ cells/只,2个月可形成肿瘤,成瘤率为40%。另外1只未形成肿瘤的裸鼠形成了肺部转移灶(1/5)。免疫组化检测显示单抗28C10的靶抗原阳性率为72.0%(77/107),而在癌旁组织中低表达,差异有统计学意义。质谱结果显示28C10识别的抗原为HSP90α。结论 采用MHCC97L球体细胞模型成功鉴定一株特异识别肝癌干细胞的单抗,为靶向肝癌干细胞的抗体治疗奠定基础。     

高转移肺癌细胞株的建立及其肿瘤干细胞生物学特性

 目的 研究高转移肺腺癌细胞株的肿瘤干细胞生物学特征。方法 肺腺癌细胞系A549接种裸鼠皮下成瘤后,取肺的转移灶,通过机械分离法获取肺转移细胞,体外扩大培养后,再次接种裸鼠。如此反复接种裸鼠,获得稳定肺转移的细胞株A549-V13。采用无血清悬浮培养及PKH26染色确定A549-V13存在肿瘤干细胞。流式细胞术（FACS）检测和分选A549和A549-V13中肿瘤干细胞标志物CD133的表达并进行体内外生物学特征实验。结果 建立稳定高转移A549-V13细胞株。无血清悬浮培养A549-V13,7天后形成的球形细胞团中存在单个PKH26阳性细胞。FACS检测显示,与A549中CD133⁺细胞相比,高转移A549-V13细胞株中CD133⁺细胞的表达比例显著提高4.85倍。A549-V13中CD133⁺细胞具有更强的自我更新能力,侵袭能力提高1.42倍,耐药能力也显著增强,其IC₅₀提高1.26倍,A549-V13的CD133⁺细胞在裸鼠皮下接种2×102个细胞3月致瘤4/6,而接种2×10²个A549的CD133⁺细胞3月才致瘤2/6。结论 建立高转移肺癌细胞株A549-V13,伴随CD133⁺细胞表达比例的增加,其体内外生物学功能显著增强。     

In vitro proliferative and differentiating characteristics of CD133(+) and CD34(+) cord blood cells in the presence of thrombopoietin (TPO) or erythropoietin (EPO). Potential implications for hematopoietic cell transplantation

We investigated the characteristics of cord blood (CD) CD133⁺ and CD34⁺ cells, by flow cytometry, clonogenic assays and assessment of the replating ability (area under the curve (AUC)) following 7-day liquid culture in the presence of early acting growth factors and either thrombopoietin (TPO) or erythropoietin (EPO). The CD34⁺ population showed a more effective proliferation in all parameters tested and TPO proved to be more effective than EPO. On the contrary, the CD133⁺ cell fraction retained and expanded more immature elements in a modest but consistent manner with either TPO or EPO. We conclude that CD133⁺ and CD34⁺ expanded cord blood cells could potentially be used in combination to overcome the shortcomings of cord blood transplantation in older children and adults.