淋球菌外膜蛋白的研究进展

淋病奈瑟菌是人类性传播疾病淋病的病原菌,简称淋球菌。主要引起泌尿生殖系统粘膜的急性或慢性化脓性感染。近年研究发现,淋球菌外膜蛋白在致病过程及宿主免疫反应中起着重要作用。淋球菌的感染率相当高,并可导致反复感染,这与其逃避宿主防御系统的机制较完善有关。菌体表面主要抗原成分外膜蛋白抗原等,     

奈瑟氏淋球菌感染小鼠实验模型的研究

奈瑟氏淋球菌容易感染人，却难以感染所有常用实验动物，因此长期以来一直缺少合适的实验动物模型，严重限制奈瑟氏淋球菌的研究进展。雌激素有一定的抗炎作用，利用雌激素处理的小鼠建立奈瑟氏淋球菌实验感染模型，有助于奈瑟氏淋球菌感染机制、疫苗的开发的研究，有助于抗菌药物的筛选与评价。本文将对该实验感染模型研究情况作一综述。     

淋球菌外膜蛋白NspA基因重组子的构建与表达

目的构建淋球菌标准株外膜蛋白NspA基因重组子,在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达外膜蛋白NspA。方法提取淋球菌标准株基因组DNA,PCR扩增其NspA基因,插入表达质粒载体pET-30c（＋）中,构建pET-NspA重组子,转化表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western Blot检测表达蛋白。结果成功构建了淋球菌标准株的pET-NspA大肠杆菌表达重组子,经IPTG诱导表达后,该蛋白在大肠杆菌中高效表达。结论淋球菌外膜蛋白NspA在大肠杆菌中的成功表达,为研究该蛋白的免疫学性能、制备抗体和研制预防淋病的疫苗奠定了基础。     

抗淋球菌外膜蛋白单克隆抗体的研制及应用研究

目的：制备抗淋球菌外膜蛋白单克隆抗体，建立淋病快速诊断方法。方法：采用乙酸锂提取淋球菌ＷⅠ群和ＷⅡ／ＷⅢ群外膜蛋白，以此为抗原免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，融合、筛选抗淋球菌外膜蛋白杂交瘤细胞。结果：筛选出抗ＷⅠ群外膜蛋白杂交瘤２株，分泌的单克隆抗体类别为ＩｇＧ１；抗ＷⅡ／ＷⅢ外膜蛋白杂交瘤２株，分泌的单克隆抗体类别为ＩｇＧ２ａ和ＩｇＧ２ｂ。腹水单克隆抗体效价达１０７以上。４株单克隆抗体与脑膜炎球菌等细菌无交叉反应。对５６例临床标本采用夹心ＥＬＩＳＡ法进行检测，结果发现敏感性达９７％，特异性达１００％。结论：该单克隆抗体可以用于淋病的快速诊断。     

鲍曼不动杆菌外膜蛋白CarO的原核表达、纯化和多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化带多聚组氨酸(6×His)标签的鲍曼不动杆菌杆菌外膜蛋白Caro(-binding protein)融合蛋白并制备抗Caro多克隆抗体,为研究临床鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制奠定基础.方法 构建pET23d-CarO重组表达质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3),以IPTG诱导6×His-CarO融合蛋白表达,经镍离子金属螯合树脂纯化后,用纯化出的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western印迹检测多克隆抗体的特异性.结果 在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的His-CarO融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫新西兰大白兔,获得了高特异性的抗CarO抗血清.结论 成功构建pET23d-CarO原核表达质粒,表达并纯化出目标蛋白,制备出高特异性的多克隆抗体.     

oprC蛋白多克隆抗体制备及其免疫效果研究

目的:本文通过制备鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,A.baumannii)外膜受体oprC蛋白多克隆抗体,并评价其免疫效果。方法:NCBI上查询oprC的全基因序列并以A.baumannii DNA为模板扩增oprC全长。酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法测定抗体效价。结果:显示oprC抗血清效价为1∶12800;检测oprC蛋白多克隆抗体对攻毒小鼠的生存率、血液中荷菌量、多器官组织损伤的改善情况,结果显示oprC多克隆抗体能够提高小鼠存活率、减少荷菌量(P<0.05),使肺组织、脾脏、肾组织损伤情况均有所缓解。结论:本研究证实oprC重组蛋白能够提高小鼠生存率,减轻病理损伤,实现免疫保护。     

恶性疟原虫复制蛋白PfRPA2的原核表达及多抗制备

目的克隆表达恶性疟原虫复制蛋白PfRPA2亚基,制备多抗,为该蛋白的功能研究奠定基础。方法 PCR扩增目的基因片段,克隆到表达载体pGEX-KG中,构建PfRPA2/pGEX-KG原核表达载体,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物,谷胱甘肽柱纯化蛋白,Westernblot检测其抗原性,以纯化的GST-PfRPA2免疫小鼠,制备抗PfRPA2的多抗,间接ELISA法检测鼠血清效价,Westernblot鉴定多抗特异性。结果成功构建了重组PfRPA2/pGEX-KG原核表达质粒,并在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达,纯化表达产物,制备抗PfRPA2的鼠多抗,效价为10-7,Westernblot证实此抗体可识别恶性疟原虫内与PfRPA2蛋白位置对应的特异性条带。结论恶性疟原虫复制蛋白PfRPA2亚基在大肠杆菌中获得可溶性高效表达,纯化表达产物能诱导小鼠生产能识别天然蛋白的特异性抗体。     

远缘链球菌细胞分裂蛋白的表达、纯化和抗体的制备

目的表达与纯化远缘链球菌克隆细胞分裂蛋白(ftsK),制备多克隆抗体并鉴定。方法利用IPTG诱导ftsK在大肠杆菌中表达,随后以再生Ni-NTA柱纯化蛋白。纯化后的蛋白多次注射于新西兰大白兔中,获取多克隆抗血清,ELISA法检测抗体效价,Westernblot法检测抗体特异性。结果获得了纯度较高的远缘链球菌ftsK蛋白及其抗体,多抗效价达到1∶10000,特异性较好。结论成功表达了远缘链球菌ftsK蛋白,获得了效价较高、特异性较强的多克隆抗体,为进一步研究ftsK蛋白功能获取了良好的工具。     

抗人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)外膜蛋白gp120单链抗体基因的构建及测序鉴定

目的　构建抗HIV 1gp120单链抗体基因,为进一步用于HIV 1感染的诊断和治疗奠定基础。方法　利用 RT PCR法,从抗HIV 1gp120单克隆抗体杂交瘤细胞扩增得到抗体轻链和重链的可变区基因,经重叠延伸反应, 在体外随机合成单链抗体基因(ScFv),并克隆到pGEM Easy T载体中,经测序及Blast同源性分析。结果　该 ScFV基因全长为666bp,为VH Linker VL结构,VH基因为396bp,编码132个氨基酸;Linker为(Gly4Ser)3短 肽;VL基因为270bp,编码90个氨基酸。VH基因与小鼠IgG2a重链可变区的同源性达95%,VL基因与小鼠免 疫球蛋白κ轻链可变区的同源性达98%。结论　成功构建了抗HIV 1gp120单链抗体基因。     

乙型肝炎病毒外膜大蛋白与HBV DNA的关系研究

目的:探讨乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒外膜大蛋白(HBV-LP)与HBV DNA的关系.方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR法,检测320例乙型肝炎患者血清中的HBV-LP水平及HBV DNA载量.结果:HBV-LP水平与HBV DNA拷贝数变化相一致,两者呈正相关(r=0.949);不同模式的HBeAg血清中HBV-LP与HBV DNA阳性率,差异均无统计学意义(P>0.05).结论:血清HBV-LP水平能反映乙型肝炎患者体内HBV复制程度,是判断HBV复制的血清学指标.     

Mrell多克隆抗体的制备及初步鉴定

目的原核表达人Mrell蛋白,并制备出Mrell蛋白的多克隆抗体,为研究Mrell蛋白功能奠定基础。方法以人cDNA文库为模板,构建出原核表达质粒PET41a—Mrell,然后转化受体茵E-coliBL21,再经IPTG诱导表达,通过采用GST亲和纯化获得GST-融合蛋白,将该融合蛋白免疫免以制备出Mrell多抗血清,最后采用western—blot及免疫荧光等方法检测其在细胞中的特异性。结果在受体茵E-coliBI。21中成功诱导表达出了GST—Mrell融合蛋白,免疫新西兰大白兔后获得了高效价的Mrell蛋白抗血清,IP、western—blot及免疫荧光等多种方法检测证实该抗血清能够特异性识别293T和U20S细胞株中Mrell蛋白,并能够正确清楚检测293T和U20S细胞株中的Mrell表达情况,具有良好的特异性和高效性。结论成功制备出了兔抗人Mrell蛋白的多克隆抗体,为深入研究Mrell蛋白在DNA损伤中的功能奠定了基础。     

用MAPs制备新肿瘤相关基因1A6/DRIM的多克隆抗体

目的:获得1A6/DRIM的N端特异性抗体并对其在细胞内的定位进行分析.方法:针对1A6/DRIM的N端多肽用多通道同步固相全自动合成系统合成,以无免疫原性的赖氨酸结构为核心偶联,将此多聚抗原肽(mutiple antigenic peptides,MAPs)免疫新西兰大白兔,从免疫兔血清中获得1A6/DRIM的多克隆抗体.结果:用Western Blot技术证明了1A6/DRIM的N端抗体,与C端特异性单克隆抗体识别相同的1A6/DRIM基因表达的310 000蛋白条带,经过Western Blot和免疫荧光的方法初步证实1A6/DRIM在多种胃癌细胞系、乳腺癌细胞系以及肝癌细胞系中表达,免疫荧光显示1 A6/DRIM主要定位在细胞核内.结论:对于用谷胱苷肽巯基转移酶(Glutathion-S-transferase,GST)融合蛋白方法不能诱导表达的蛋白,可利用合成MAPs制备抗原的方法获得抗体.本研究用此方法制备的抗体特异性识别1A6/DRIM蛋白产物并证明该基因主要在多种肿瘤细胞的核内表达.     

HBV 靶向核糖核酸酶基因的原核表达和纯化及多克隆抗体的制备

目的旨在获得HBV靶向核糖核酸酶,并制备其兔的多克隆抗体. 方法 将构建好的HBV靶向核糖核酸酶基因克隆入原核表达载体pET32a(+),转化入大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达并经Ni2+亲和层析纯化.通过SDS-PAGE 和 Western blot鉴定后,用纯化的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,并以复性的蛋白作为抗原,用ELISA测定抗体的效价. 结果 成功地纯化和复性了HBV靶向核糖核酸酶,获得了较高效价的抗血清. 结论 获得纯化并复性的HBV靶向核糖核酸酶和多克隆抗体,为进一步研究奠定了基础.     

人磷酯酰蛋白聚糖3N端融合蛋白多克隆抗体制备及鉴定

目的：制备人磷酯酰蛋白聚糖3（Glypican3,GPC3）N端蛋白的多克隆抗体。方法：在大肠埃希菌Rosetta中诱导表达磷酯酰蛋白聚糖3N端融合蛋白,从SDS-PAGE中切胶纯化,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体。用辛酸-硫酸铵分步沉淀法初步纯化抗血清,并用ELISA、Westen-blot检测抗体的灵敏度和特异性。结果：成功制备了抗磷酯酰蛋白聚糖3N端的多克隆抗体,抗体滴度为1：64000,经Western blot检测特异性良好。结论：成功制备了抗人磷酯酰蛋白聚糖3N端融合蛋白多克隆抗体。     

抗人免疫球蛋白G多克隆荧光抗体的制备及在肾活检中的应用

目的：制备抗人免疫球蛋白G（IgG）多克隆荧光抗体，并用于肾病的病理诊断。方法：以免疫新西兰免制备多克隆抗体，用亲和层析的方法纯化抗体，并用ELISA法双向琼脂扩散，Westen-blot和免疫组化等方法对多克隆抗体进行测定。纯化的抗体标记荧）匕素，用免疫组化的方法鉴定并用于临床肾病的辅助诊断。结果：获得的抗体琼脂双扩滴度为1：32。ELISA法测定效价为1：128000，Westen-blot证实抗体特异性识别人IgG。纯化后抗体效价仍有1：56000，灰度分析证实纯化后的抗体纯度达80％：间接法免疫组化检测抗体滴度为1：800。标记荧光后效价无明显下降，免疫组化鉴定在临床病例中该荧光抗体能特异性识别人IgG。结论：得到纯化后的抗人IgG抗体有良好的特异性和亲和性，抗体的结合力较高，标记荧光后得到的多克隆荧光抗体对具有IgG阳性的肾组织反应特异性强，与商品化的抗人IgG抗体比较，效价及特异性均无显著差异，可用于肾病的临床诊断。     

半胱氨酰白三烯受体2多克隆抗体制备及其鉴定

目的:制备半胱氨酰白三烯受体2(CysLT_2)多克隆抗体,并鉴定其免疫学特性及应用.方法:以KLH偶联的CysLT_2受体多肽免疫家兔制备抗体,用间接ELISA法测定抗体效价,以抗原阻断法测定抗体敏感性及特异性;同时,以新制备的抗体进行Western blot和免疫组化,检测CysLT_2受体的组织表达.结果:ELISA测定显示,获得的家兔抗CysLT_2受体抗体的效价大于1/1 047 296,对CysLT_2受体的特异性强,对CysLT_1受体和GPR17基本无交叉反应.Western blot结果显示,CysLT_2受体在大鼠、小鼠肾、脑和肺中有较高的表达,其分子量在40 kD左右.免疫组化结果表明,CysLT_2受体主要表达在大鼠神经元,也表达在部分星形胶质细胞.结论:制备的CysLT_2受体多克隆抗体具有高效价和高特异性,能满足Western blot和免疫组化检测的要求.     

空肠弯曲菌粘附蛋白PEB1原核表达、纯化及多克隆抗体制备

【目的】克隆、表达空肠弯曲菌表面蛋白PEB1,并制备针对该蛋白的多克隆抗体。【方法】采用PCR方法从空肠弯曲菌Penner19标准株基因组中扩增出PEB1蛋白基因,用限制性内切酶消化后插入到pUC-19克隆载体中,测序正确后,再亚克隆到融合表达载体pPro-EXHTb中,转化大肠杆菌DH5α,目的基因经IPTG诱导,由T7启动子调控表达了氨基端带6个连续组氨酸残基的PEB1蛋白,并经Western-blotting证实。然后,在非变性条件下用Ni-NTA亲和色谱柱纯化目的蛋白。用纯化的PEB1蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,用ELISA法检测抗体效价。【结果】在非变性条件下用Ni2＋-NTA亲和色谱柱纯化PEB1融合蛋白,纯化获得的蛋白纯度大于90%。用该融合蛋白免疫小鼠后,得到抗PEB1抗体,效价达1：2×105。【结论】成功构建了空肠弯曲菌PEB1基因原核表达载体,并获得了高纯度的PEB1蛋白及其高效价多抗,对进一步制备肠粘膜高亲和力的过敏原重组BCG打下了坚实的基础。     

兔抗小鼠多发性骨髓瘤细胞多克隆抗体的制备及抗肿瘤研究

目的:制备小鼠多发性骨髓瘤全细胞兔多克隆抗体,并初步研究其抗肿瘤活性。方法:用小鼠多发性骨髓瘤细胞MPC-11活细胞通过背部皮内多点注射多次免疫新西兰大白兔,收集血清。然后采用亲和层析系统纯化血清中的多克隆抗体。用ELISA检测纯化多克隆抗体的效价,MTT法分析多克隆抗体对MPC-11增殖的影响,通过皮下肿瘤模型研究多克隆抗体对荷瘤小鼠体内肿瘤生长的影响。结果:我们获得了高特异性的多克隆抗体,ELISA检测抗体滴度在1∶20 000以上,MTT研究发现200μg/mL多克隆抗体处理骨髓瘤细胞MPC-11 48 h后,明显抑制骨髓瘤细胞生长;体内研究发现,多克隆抗体明显抑制小鼠皮下肿瘤的生长。结论:实验获得了高效价的特异性兔抗小鼠骨髓瘤细胞多克隆抗体,通过体内体外研究发现,多克隆抗体能够明显抑制肿瘤细胞的生长,为进一步研究多发性骨髓瘤的诊断和治疗提供了新的方法。     

新型半胱氨酰白三烯受体GPR17的多克隆抗体制备及其鉴定

目的:制备新型半胱氨酰白三烯受体GPR17的多克隆抗体(pAb),并鉴定其免疫学特性.方法:以KLH偶联的GPR17多肽免疫家兔制备其pAb,用间接ELISA法测定抗体效价,阻断ELISA测定抗体敏感性及特异性,同时以新制备的抗体做Western blot,检测GPR17的组织表达.结果:通过免疫家兔获得的抗GPR17 pAb,ELISA测定显示其抗体效价最高可达到1/16 364,并对CysLT1受体和CysLT2受体基本无交叉反应,具有较好的特异性.Western blot结果显示,GPR17在大鼠脑和心脏组织中有较高的表达,其分子量在43 kD左右.结论:制备的GPR17 pAb具有较高的效价和较好的特异性,能满足Western blot检测GPR17的要求.