腺相关病毒载体介导p27Kip1基因转染骨肉瘤MG-63细胞的研究

目的 观察p27Kip1基因转染后对骨肉瘤MG-63细胞增殖和生存能力的影响.方法 重组质粒在内的三质粒共转染包装、收集腺相关病毒颗粒,检测病毒滴度并感染MG-63细胞,细胞免疫组织化学检测p27Kip1基因的表达,并行细胞增殖实验、细胞周期分析,探讨p27Kip1基因对骨肉瘤MG-63细胞的体外作用.结果 三质粒成功共转染293细胞,X-gal染色观察转染率为60%;采用CPE法(微量全细胞病变法)检测病毒滴度1.6×108 PFU/ml;细胞免疫细胞化学鉴定p27Kip1基因高表达;细胞生长曲线显示转染组细胞增殖明显减慢;流式细胞仪观察转染AAV-p27Kip1组细胞周期见S、G2期细胞比例明显降低,G0/G1期细胞比例增高.结论 p27Kip1基因重组腺相关病毒感染骨肉瘤MG-63细胞后能高表达目的 基因,并阻滞细胞于G1/S期,从而显著抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖.     

供肝局部转染人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白的重组腺相关病毒诱导大鼠同种肝移植免疫耐受

目的 利用人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白的重组腺相关病毒（rAAV-hCTLA41g）局部基因转染供肝诱导大鼠同种肝移植免疫耐受。方法 供体为DA大鼠，受体为LEW大鼠，分为以下4组：（A）同基因对照组（LEW-LEW）；（B）生理盐水对照组；（C）rAAV-EGFP（增强型绿色荧光蛋白）对照组；（D）rAAV-hCTLA41g灌注组。大鼠原位肝移植前6周，经门静脉灌注采用血管夹闭法对供肝进行基因转染。结果 D组大鼠平均生存期显著高于C组（10．8±1．0）d及B组（11．6±1．1）d，B组与D组间，C组与D组间，生存期差异有统计学意义（P〈0．01）。D组血浆及移植肝中可以持续检测到hCTLA41g的表达。术后1周移植肝病理检查显示B组、C组均有严重免疫排斥反应，免疫组织化学显示大量CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞浸润；而D组仅有轻、中度炎症反应，少量CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞浸润。结论 移植术前6周对供肝体内经门静脉灌注采用血管夹闭技术基因转染rAAV-hCTLA41g可以诱导大鼠同种肝移植免疫耐受。     

腺相关病毒介导的大鼠移植肝基因转移

目的　研究腺相关病毒载体介导的移植肝基因转移的可行性和转导率。方法　以绿色荧光蛋白 (GFP)作为报告基因 ,在大鼠供肝冷保存前经门静脉注入不同剂量 (1× 10 10 pfu/ml、5× 10 10pfu/ml和 1× 10 11pfu/ml)的带有绿色荧光蛋白的腺相关病毒载体 (AAV GFP) ,保存后行异体肝移植 ,术后 2、4及 8周取供肝组织活检 ,运用免疫荧光显微镜和流式细胞仪检测GFP的表达 ,计算转导率 ,观察不同剂量的AAV GFP及不同保存时间 (1h、4h和 10h)对转导率的影响。结果　 3个剂量组肝移植术后第 4周移植肝细胞内均可观察到GFP的表达 ,随着AAV GFP剂量的增加 ,转导率也增加 (6 %、15 %和 34 % ) ;随着冷保存时间的延长 ,转导率逐步提高 (15 %、32 %和 5 4% ) ;除移植肝细胞外 ,脑、心、肺、肾、脾脏内均未见GFP的表达 ;与对照组比较 ,移植肝功能的差异无显著性。结论　在模拟临床肝移植条件下 ,利用腺相关病毒可将目的基因转移入移植肝细胞内 ,且能高效表达 ;转导率随病毒剂量的增加、冷保存时间的延长而提高 ;经冷保存途径腺相关病毒的转染具有嗜肝性 ;移植肝功能不受基因转导的影响     

腺相关病毒载体转染供肝方法学的实验研究

目的 探讨腺相关病毒载体基因转染的有效途径和方法.方法 我们设计肝动脉、门静脉、双重灌注3种途径和传统、循环、夹闭3种转染方法.通过观察肝脏灌注后颜色、检测肝脏功能和肝细胞转染率,确定灌注途径和转染方法,并探讨其安全性.结果 肝脏灌注后颜色无明显差别,无肿胀或花斑出现,血流开放以后肝脏颜色迅速恢复正常,3种灌注途径ALT比较差异无统计学意义(F=0.343,1.265,0.055,P＞0.05);1周后肝脏组织均有免疫荧光染色,并且携带增强型绿色荧光蛋白基因的腺相关病毒载体,转染率比较差异无统计学意义(F=0.080,0.091,0.045,P＞0.05).传统法的转染率略低于循环法,而夹闭法的转染率在各时间段均高于前两种方法,差异有统计学意义(F=3.880,2.976,5.129,P＜0.05).3种方法转染率随时间逐渐升高,6周左右达到高峰,以后缓慢下降.结论 经肝动脉灌注是基因转染的有效途径,夹闭法可以提高目的基因的转染率,两者均无肝脏功能损害,腺相关病毒载体的转染呈缓慢、持续的过程.     

人降钙素基因相关肽重组腺相关病毒在原代培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞中的表达及其作用

目的:观察腺相关病毒载体介导的人降钙素基因相关肽(hCGRP)基因在原代培养的大鼠阴茎海绵体平滑肌(CCSM)细胞的表达及其作用,探讨其应用于勃起功能障碍(ED)基因治疗的可行性。方法:原代培养的SD大鼠CCSM细胞随机分为4组:实验组、空病毒组、示踪剂组和对照组,分别以可分泌表达hCGRP重组腺相关病毒VssH-GCMV-hCGRP、空病毒VssHGCMV和表达绿色荧光蛋白(GFP)重组腺相关病毒VssCMV-GFP进行体外转染或不予任何处理。采用斑点印迹试验检测培养液中的hCGRP和放射免疫法检测转染细胞中的环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)水平,观察hCGRP和示踪剂GFP的表达及其对CCSM细胞的影响。结果:重组腺相关病毒载体能有效地将外源基因hCGRP导入大鼠CCSM细胞并稳定表达,与空病毒组和对照组相比,该病毒明显刺激大鼠CCSM细胞中cAMP水平升高[(48.7±1.1)nmol/L对(12.3±1.2)nmol/L和(7.8±1.4)nmol/L,P均<0.01],培养液中可检测到免疫反应性hCGRP。结论:可分泌表达生物活性肽重组腺相关病毒基因转移系统可有效进行多肽类在CCSM细胞过表达,并影响该细胞的cAMP水平,可被应用于ED的基因治疗。     

可分泌表达人降钙素基因相关肽重组腺相关病毒体外转染培养的血管内皮细胞及其表达

目的观察可分泌表达人降钙素基因相关肽(humancalcitoningene-relatedpeptide,hCGRP)重组腺相关病毒(rAAV)体外转染培养的血管内皮细胞(endothelialcellsofvessel,ECV)及其作用,探讨其应用于血管性勃起功能障碍基因治疗的可行性。方法分别以可分泌表达hCGRP的重组腺相关病毒VssHGCMV-hCGRP、表达报告基因GFP中的重组腺相关病毒VssCMV-GFP和空病毒pssHGCMV体外转染培养的ECV细胞,采用斑点印迹试验检测培养基中的hCGRP,以放射免疫法检测转染细胞中的cAMP和cGMP水平,观察GFP和hCGRP的表达及其对ECV细胞的影响。结果腺相关病毒载体能有效地将外源基因hCGRP导入血管内皮细胞并稳定表达,VssHGCMV-hCGRP病毒组细胞中cAMP水平(45.74±3.45)nmol/L较pssHGCMV空病毒组(14.84±0.65)nmol/L和对照组(12.74±0.65)nmol/L明显高(P<0.01),并可在实验组24h细胞培养液中检测到免疫反应性hCGRP。结论可分泌表达生物活性肽重组腺相关病毒基因转移系统可有效进行多肽类在血管内皮细胞过表达,并可选择性刺激该细胞中cAMP水平升高,提示hCGRP可作为血管性勃起功能障碍基因治疗的有效候选基因。     

人p27kip1基因腺相关病毒载体的构建

目的 克隆人肿瘤转移抑制基因p27kip1,利用基因重组技术,构建其腺相关病毒载体,为进一步研究骨肉瘤的基因治疗建立一个平台.方法 从人正常胎盘组织中提取总RNA,RT-PCR获取p27kip1基因(ORF)cDNA序列,并将其克隆至腺相关病毒载体pAAV-MCS,构建人p27kip1基因腺相关病毒载体.结果 人胎盘组织抽提总RNA,并通过RT-PCR获得目的 基因ORF,经TA克隆后,将目的 基因连人pAAV-MCS中,送测序结果 无误.结论 成功构建的重组质粒pAAV-MCS-p27kip1,将为进一步研究p27kip1蛋白的生物学效应提供基础,为p27kip1基因应用于骨肉瘤的治疗提供实验依据.     

人p27^kip1基因腺相关病毒载体的构建

目的克隆人肿瘤转移抑制基因p27^kip1利用基因重组技术,构建其腺相关病毒载体,为进一步研究骨肉瘤的基因治疗建立一个平台。方法从人正常胎盘组织中提取总RNA,RT—PCR获取p27^kip1基因（ORF）cDNA序列,并将其克隆至腺相关病毒载体pAAV—MCS,构建人p27^kip1基因腺相关病毒载体。结果人胎盘组织抽提总RNA,并通过RT—PCR获得目的基因ORF,经TA克隆后,将目的基因连人pAAV—MCS中,送测序结果无误。结论成功构建的重组质粒pAAV—MCS—p27^kip1将为进一步研究p27^kip1蛋白的生物学效应提供基础,为p27^kip1基因应用于骨肉瘤的治疗提供实验依据。     

前列腺素E1对大鼠肝移植肾功能的保护作用

目的探讨术中应用前列腺素E1（prostaglandin E1，PGE1）对大鼠肝移植肾功能的保护作用。方法大鼠原位肝移植术中经颈内静脉灌注PGE1为治疗组，生理盐水和空白为对照组，观察术后1周存活率、1h的尿量，测定血浆肌酐、尿素氮和肾组织中丙二醛（malondjaldehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量，肾组织病理检查。结果PGE1治疗组术后1h尿量较对照组明显增加，肌酐和尿素氮水平均较对照组降低，PGE1治疗组肾组织中GSH含量显著高于两对照组，MDA含量低于两对照组。病理检查PGE1治疗组肾脏组织形态学损伤明显减轻。结论术中应用PGE1能显著改善大鼠肝移植后的肾功能，其机制可能与对抗氧自由基损伤作用有关。     

Gene transfer of programmed death ligand-1.Ig prolongs cardiac allograft survival

BACKGROUND: The CD28 homologue programmed death-1 (PD-1) and its ligands, PD-L1 and PD-L2 (which are homologous to B7), constitute an inhibitory pathway of T cell costimulation. The PD-1 pathway is of interest for immune-mediated diseases given that PD-1-deficient mice develop autoimmune diseases. We have evaluated the effect of local overexpression of a PD-L1.Ig fusion protein on cardiac allograft survival. METHODS: Adenovirus-mediated PD-L1.Ig gene transfer was performed in F344 rat donor hearts placed in the abdominal position in Lewis recipients. Inflammatory cell infiltrates in the grafts were assessed by immunohistochemistry. RESULTS: Allografts transduced with the PD-L1.Ig gene survived for longer periods of time compared with those receiving noncoding adenovirus or virus dilution buffer alone: median survival time (MST), 17 (range: 16-20) days vs. 11 (8-14) and 9 (8-13) days, respectively (P < 0.001). PD-L1.Ig gene transfer combined with a subtherapeutic regimen of cyclosporin A (CsA) was superior to CsA alone: MST, 25 (15-42) vs. 15 (13-19) days (P < 0.05). PD-L1.Ig gene transfer was associated with decreased numbers of CD4 cells and monocytes/macrophages infiltrating the graft (P < 0.05). CONCLUSIONS: Localized PD-L1.Ig expression in donor hearts attenuates acute allograft rejection in a rat model. The effect is additive to that of a subtherapeutic regimen of CsA. These results suggest that targeting of PD-1 by gene therapy may inhibit acute cardiac allograft rejection in vivo.     

阻断PD-1／PD—L1信号通路对负载HBsAg的树突细胞抗HBV免疫功能的影响

目的探讨阻断PD—1／PD—L1信号通路后,负载HBsAg的树突细胞（dendritic cells,DC）诱导HBV转基因小鼠免疫应答的作用特点。方法体外诱导扩增BALB／c小鼠骨髓来源的DC,尾静脉免疫HBV转基因小鼠（其中在DC免疫前1d腹腔注射PD—L1抗体,共3次）。实验分5组进行：DC／HBsAg＋PD—L1抗体组、DC／HBsAg组、DC组、mIgG组和磷酸盐缓冲液（PBS）组,分别以流式细胞术、乳酸脱氢酶（LDH）释放法、酶联免疫吸附试验（ELISA）和荧光定量聚合酶链反应（PCR）等检测HBV转基因小鼠脾脏淋巴细胞增殖及细胞内干扰素γ（IFNγ）、特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性及血清HBsAg、HBV DNA和丙氨酸转氨酶（ALT）水平。采用SPSS13．0统计软件进行分析,组间比较采用ANOVA方差分析和q检验。结果免疫后第3天和第6天,DC／HBsAg＋PD—L1抗体组与其他各组比较在诱导CD3^＋CD8^＋T淋巴细胞增殖及IFNγ分泌方面差异有统计学意义（细胞增殖：F值分别为25．22和39．01,P值均〈0．01;IFNγ分泌：F值分别为32．35和36．98,P值均〈0．01）;而DC／HBsAg组与DC组淋巴细胞增殖能力比较仅在第3天有统计学意义（t=6．79,P=0．012）。特异性CTL的活性在DC／HBsAg＋PD—L1抗体组明显升高。各组血清HBsAg在第6天差异有统计学意义（F=6．12,P〈0．05）。DC／HBsAg＋PD—L1抗体组血清ALT水平与DC／HBsAg组比较在第3天无差异,与其他各组比较在第3和第6天差异有统计学意义（F值分别为19．22和14．30,P值均〈0．05）。各组对HBV DNA的清除能力没有差别,但DC／HBsAg＋PD—L1抗体组有1只小鼠病毒载量下降1个数量级。结论封闭PD-1／PD—L1信号通路能通过提高特异性CD^3＋CD8^＋T淋巴细胞增殖及其分泌IFNγ能力,进而促进负载HBsAg的DC诱导转基因小鼠抗HBV免疫能力。     

输注外源性白细胞介素13延长同种肝移植大鼠的存活时间

目的 探讨外源性重组白细胞介素13(rIL-13)抑制同种肝移植大鼠的排斥反应和延长大鼠存活时间的作用及其机制.方法 以Lewis大鼠为供鼠,BN大鼠为受鼠,采用重建肝动脉的大鼠肝移植方法建立同种大鼠原位肝移植模型.采用随机数字表法将受鼠分为两组,实验组于术后第1、2、3、4和5天经尾静脉注射rIL-13 10μg/d,同期对照组注射等体积生理盐水.术后第7天,检测两组移植肝功能,测定移植肝组织病理改变、细胞因子表达及CD8+T淋巴细胞浸润等情况,并根据Banff标准计算排斥活动指数(RAI),观察术后2周的存活率.结果 与对照组相比,实验组肝功能明显改善,肝组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)与E选择素的表达明显降低(P＜0.05),CD8+T淋巴细胞浸润明显减少(P＜0.05),术后2周存活率明显提高(P＜0.05).实验组的RAI为4.8±1.2,明显低于对照组的7.5±1.2(P＜0.05).结论 外源性重组rIL-13可减少促炎症因子TNF-α的释放和抑制E选择素的表达,减少移植物CD8+T淋巴细胞的浸润,从而减轻肝移植后急性排斥反应,延长大鼠的存活时间.     

程序性死亡配体1在肝癌小鼠的表达及鳖甲煎丸的抑制作用

目的:研究程序性死亡配体1(PD-L1)在肝癌小鼠的表达,探讨鳖甲煎丸抑制肝癌发生的作用机制。方法:健康雄性SPF级C57BL/6小鼠24只,随机分为对照组、模型组和鳖甲煎丸组,每组8只。采用高脂高糖饮食联合腹腔注射四氯化碳(CCl4)制备小鼠肝癌模型;自第6周开始,鳖甲煎丸组给予鳖甲煎丸(1.365 g/kg)灌胃,1次/d;至第24周处死小鼠,计算各组小鼠肝脏的相对质量,记录肝脏表面结节数,测定最大结节直径,取肝组织行HE染色,并分别用荧光定量PCR和Western blot检测PD-L1 mRNA和蛋白表达。结果:模型组小鼠肝脏的相对质量、表面结节数量和结节最大直径,较对照组比较均增加(P＜0.05);与模型组比较,鳖甲煎丸组小鼠肝脏的相对质量、表面结节数量和结节最大直径均减少(P＜0.05);模型组小鼠肝组织镜下可见肝小叶结构紊乱,有增生性结节及癌结节,肝细胞脂肪变性明显,可见核深染、核分裂,伴炎症细胞浸润及点、片状坏死灶,鳖甲煎丸组的组织病理学改变,较模型组减轻;模型组小鼠肝组织PD-L1 mRNA和蛋白表达,较对照组升高(P＜0.05),与模型组比较,鳖甲煎丸组PD-L1 mRNA和蛋白表达均降低(P＜0.05)。结论:PD-L1在肝癌小鼠高表达,鳖甲煎丸抑制肝癌发生的作用机制包括抑制PD-L1表达、降低肝癌细胞免疫逃逸,并改善肿瘤免疫微环境。     

同种肝移植大鼠转染融合基因人CTLA4-Ig抑制急性排斥反应

目的观察同种肝移植大鼠转染融合基因人CTLA4-Ig(huCTLA4-Ig)对急性排斥反应的抑制作用。方法供者为BN大鼠,受者为Lew大鼠。将受者分为三组,A组(5只):为空白对照组,供肝冷保存时不感染腺病毒;B组(4只):为阴性对照组,供肝冷保存时感染携带报告基因GFP 的重组腺病毒;C组(5只):为基因治疗组,供肝冷保存时,先体外后体内感染携带融合基因huCT- LA4-Ig的重组腺病毒;观察该治疗基因在受者体内的表达及其对急性排斥反应的抑制作用。结果(1)A组与B组受者均在3周内死亡,A、B组平均生存时间分别为(16.6±2.5)d和(15.5±3.1)d,C 组受者均能获得长期生存(>150 d);C组与A、B组生存期比较,差异有统计学意义(P<0.01)。(2) 移植肝病理学检查发现:术后8 d,A组与B组移植肝均发生严重的细胞性排斥。C组术后8 d,可见移植肝轻、中度的汇管区炎症,但组织损伤程度显著减轻;术后150d,可发现单核细胞浸润,但胆管保存完好,无血管损伤证据。(3)术前大鼠血清白细胞介素2(IL-2)浓度为(362.09±45.84)ng/L;肝移植术后,A、B组血清IL-2的浓度即升到较高水平(约为术前的1.5-2.5倍),而C组却始终维持在一个较低水平(接近或低于术前水平);术后3、7 d,C组血清IL-2的浓度与A、B组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论建立了简便有效的针对血管     

Trends of rapamycin in survival benefits of liver transplantation for hepatocellular carcinoma

The proportion of liver transplantation (LT) for hepatocellular carcinoma (HCC) has kept on increasing over the past years and account for 20%-40% of all LT. Post-transplant HCC recurrence is considered the most important factor affecting the long-term survival of patients. The use of different types of immunosuppressive agents after LT is closely associated with an increased risk for HCC recurrence. The most commonly used conventional immunosuppressive drugs include the calcineurin inhibitors tacrolimus (FK506) and mammalian target of rapamycin inhibitor rapamycin (RAPA). Compared with tacrolimus, RAPA may carry an advantage in survival benefit because of its anti-tumor effects. However, no sufficient evidence to date has proven that RAPA could increase long-term recurrence-free survival and its anti-tumor mechanism of combined therapy remains incompletely clear. In this review, we will focus on recent advances in clinical application experience and basic research results of RAPA in patients undergoing LT for HCC to further guide the clinical practice.     

程序性死亡受体(PD)-1单克隆抗体治疗肝癌肝移植术后复发诱发急性免疫性肝炎:附1例报告

目的  探讨程序性死亡受体(PD)-1单克隆抗体治疗肝细胞癌(肝癌)肝移植术后复发的安全性。方法  回顾性分析1例因使用PD-1单克隆抗体(pembrolizumab)治疗肝癌肝移植后复发而诱发急性免疫性肝炎患者的临床资料。结果  患者因原发性肝癌行肝移植术,术后4个月发现肝癌肺转移,术后12个月予pembrolizumab治疗(150 mg静脉滴注1次),治疗后第5日发现肝功能异常,行肝穿刺活组织检查病理提示轻至中度急性排斥反应。结合患者临床表现、实验室检查以及pembrolizumab的药物说明书,诊断为急性免疫性肝炎。给予肾上腺皮质激素及加强免疫抑制治疗,随访8个月患者带瘤生存,但肝功能仍持续异常。结论  肝移植术后免疫抑制状态下不宜应用PD-1单克隆抗体等免疫检查点抑制剂,有诱发免疫性肝炎的风险。