arresten在CHO细胞的表达及其生物学效应

目的 初步探讨血管生成抑制因子arresten在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中的表达及其生物学效应。方法 用脂质体转染法将真核表达载体pSecTag-arresten导入CHO,抗生素Zeocin筛选获得阳性克隆。RT—PCR检测arresten在mRNA水平的表达,Western blot检测arresten在蛋白水平的表达。将人脐静脉内皮细胞（huvec）分为加DMEM培养组、加SFX无血清培养基培养组及加含arreten的上清培养液组,TransweH小室检测arresten对huvec细胞迁移的影响,Mamgel胶体外管腔生成试验检测arresten对huvec细胞血管形成能力的影响。结果 RT—PCR和Western blot检测显示,arresten在mRNA水平与蛋白水平均有表达。迁移抑制曲线显示,含arresten组的迁移抑制率明显高于对照组（P〈0．05）。加DMEM培养组、加SFX无血清培养基培养组和加含arresten的上清培养液组细胞形成的血管腔分别为16±2、13±1和7±2个,加含arresten的上清培养液组显著低于其他两组（P〈0．05）。提示arresten对huvec细胞的迁移和血管形成具有抑制作用。结论成功构建arresten的真核表达体系,并发现arresten因子可抑制huvec细胞迁移和管腔形成,这可能是其抑制血管生成的途径之一。     

人MAGE-3真核表达载体的构建与表达

目的 克隆人黑色素瘤特异性抗原MAGE-3基因，构建真核表达载体，建立MAGE-3阳性细胞株，制备肿瘤核酸疫苗。方法 用RT—PCR方法扩增MAGE-3cDNA，以pcDNA3．1 为载体，构建重组表达质粒pcDNA3．1／MAGE-3。重组质粒用脂质体转染鼠B16细胞，经RT—PCR、细胞免疫染色及免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE-3的表达。结果 正确构建了pcDNA3．1／MAGE-3重组质粒，并且在转化细胞中检测到了MAGE-3的表达。结论 成功构建了pcDNA3．1／MAGE-3真核表达质粒，建立了稳定表达人MAGE-3的鼠B16细胞株。     

PEA-15真核表达载体的构建及表达

目的构建PEA-15真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15,并在人类食管癌细胞（EC-109）中表达。探讨PEA-15对EC．109细胞的影响。方法采用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测EC-109细胞中的PEA-15基因表达。构建重组真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15。酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至EC-109细胞中。采用RT—PCR、Westernblot法检测基因及蛋白表达。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞生长抑制率。结果RT—PCR显示PEA-15在EC-109细胞中表达。PCR扩增片段与预期片段大小相符,测序结果表明真核表达载体pcDNA3．1-PEA-15构建成功。转染后的细胞中PEA-15表达均增加（t值分别为4．078、5．269,均P〈0．05）。转染质粒72h后,细胞的生长抑制率较转染空质粒组降低[（7．12±0．86）％、（12．55±1．78）％,t=6．163,P〈0．05]。结论成功构建重组真核表达载体pcDNA3．I-PEA-15,并在EC-109细胞中进行了表达;转染后对食管癌细胞生长有促进作用,其表达可能促进食管癌的发生。     

肿瘤抑制基因DOC-2真核表达载体的构建及在卵巢癌细胞HO-8910中的表达鉴定

目的构建肿瘤抑制基因DOC-2的真核表达载体pCDNA3.1-p93,将其转入人卵巢癌细胞系HO-8910中,对其基因表达进行相关检测,为进一步研究DOC-2的功能奠定基础。方法利用XhoI酶切含有p93cDNA的质粒得到p93cDNA基因片段,将其连接入真核表达载体pCDNA3.1,并通过酶切鉴定。用脂质体介导法将真核表达载体pCDNA3.1-p93转染HO-8910,通过G418筛选稳定表达克隆;用免疫组化法观察人DOC-2蛋白在HO-8910中的表达。结果构建了DOC-2的真核表达载体pCDNA3.1-p93,并通过酶切鉴定。免疫细胞化学结果显示pIRES2-EGFP-p93成功转入HO-8910中。结论成功构建了真核表达载体pCDNA3.1-p93并在HO-8910中得到稳定表达,为研究DOC-2蛋白的功能奠定了基础。     

人RASSF2基因的真核表达载体的构建及其表达

 目的　构建人RASSF2基因的真核表达载体 ,为研究RASSF2在肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞等方面的作用奠定基础。方法　采用RT PCR自正常人外周血单个核细胞RNA中扩增出人RASSF2基因的全长cDNA ,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体 pcDNA3.1/HisC中获得重组质粒。用脂质体将重组质粒转染人胰腺癌细胞株PANC 1,RT PCR检测其表达。结果　酶切图谱分析及基因测序证明人RASSF2表达片段已被完整、正确的插入到 pcDNA3.1/HisC中 ,RT PCR结果显示转染细胞RASSF2表达水平上调。结论　成功构建了RASSF2基因的真核表达载体 pcDNA3.1RASSF2     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的：克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法：采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP-N1）上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果：测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的:克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法:采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-N1)上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果:测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

CUL5基因的RNA干扰真核表达载体的构建

目的:构建CUL5基因的RNA干扰真核表达载体,探索CUL5在鼻咽癌放射治疗中加速再增殖的作用.方法: 根据 GenBank数据库提供的 CUL5基因mRNA序列,按照Tuschl 设计原则,设计选择双链小干扰RNA( small interfering RNA,siRNA ) ,再设计合成为能表达其小发卡结构RNA(small hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,并与pGPU6/GFP/Neo质粒定向连接,构建真核表达载体,并进行限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定.结果: 经限制性内切酶酶切和DNA测序证实质粒中插入的为所需序列,通过RT-PCR证实其能够干扰CNE2细胞的CUL5基因表达.结论: CUL5基因RNA干扰真核细胞表达载体的构建成功.     

突变减毒志贺样毒素Ⅰ真核表达载体的抗肿瘤血管活性

目的：考察突变减毒志贺样毒素Ⅰ（Shiga-like toxin 1,Stx1）真核表达载体抗肿瘤血管的活性。方法：使用流式细胞仪检测突变减毒Stx1真核表达载体转染对CHO细胞的影响;分别建立稳定表达1/10毒性、1/100毒性的突变减毒Stx1的CHO细胞株,使用这2个细胞株和对照细胞株的培养上清分别处理人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）,观察其对HUVEC的增殖、迁移能力和形成管样结构能力的影响;使用人卵巢癌SKOV3荷瘤裸鼠模型,不同毒性突变减毒Stx1真核表达载体经脂质体包裹后肿瘤局部注射给药,观察突变减毒Stx1对肿瘤新生血管的作用。结果：突变减毒Stx1真核表达载体转染的CHO细胞未出现明显的凋亡或坏死改变;获得稳定表达1/10毒性、1/100毒性的突变减毒Stx1的基因工程细胞株,这些细胞株的培养上清与正常CHO细胞培养上清相比,能够在体外实验中抑制HUVEC的生长（P〈0.05）,且该作用可以被Stx1B亚基抗体阻断;突变减毒Stx1能够抑制HUVEC的迁移能力和管样结构形成能力;体内实验显示1/10毒性、1/100毒性的突变减毒Stx1真核表达载体治疗组与空载体对照组或生理盐水对照组相比,肿瘤微血管密度明显下降（P〈0.01）。结论：成功建立了分泌性表达突变减毒Stx1的CHO细胞株。证实突变减毒Stx1能够有效地抑制HUVEC的生长及正常功能的发挥。体内实验显示突变减毒Stx1真核表达载体可以抑制裸鼠体内SKOV3移植瘤的血管生成。     

真核翻译起始因子eIF4E与恶性肿瘤的研究进展

真核翻译起始因子eIF4E对mRNAs的翻译起重要作用，其过度表达可影响细胞的生长和分化，与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。     

人血管内皮生长因子C基因真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆血管内皮生长因子C（Vascular Endothelial Growth Factor C）功能片段的cDNA，构建人VEGF-C基因的真核表达载体，以便进一步研究VEGF—C在宫颈癌中表达的意义及在淋巴管生长及转移中的作用。方法：根据人VEGF—CcDNA序列，设计合成二对特异性引物，第一对5’端含有EcoR Ⅰ及第二对3’端含有XhoI酶切位点。运用RT—PCR法克隆人MDA—MB231中的VEGF—C cDNA部分编码序列（CDS）：经双酶切后将其克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋），重组质粒在处于感受态的大肠杆菌DH5d中扩增，纯化。通过PCR和双酶切鉴定阳性重组子及进行基因序列的测定。结果：用RT—PCR克隆到VEGF—CcDNA部分CDS；PCR和双酶切鉴定阳性重组子，显示有人VEGF—C cDNA编码序列，基因序列测定显示重组质粒上插入的人VEGF—C序列正确。结论：从富含VEGF—C的人MDA—MB231细胞系中克隆得到的VEGF—C基因功能片段cDNA．成功构建了人真核表达栽体pcDNA3．1（＋）／VEGF-C。     

人canstatin基因的克隆及其真核载体的构建

[目的]克隆人canstatin基因,构建并鉴定其真核表达载体pSecTag2/canstatin.[方法]采用RT-PCR方法从中国人胎盘脐带组织中扩增canstatin cDNA,T-A克隆到pUCm-T载体中,酶切后将人canstatin cDNA亚克隆入pSecTag2,构建真核表达载体pSecTag2/canstatin,重组质粒经限制性内切酶鉴定并进行测序分析.[结果]人canstatin基因片断正确插入载体,与Genebank中报道的序列一致.[结论]pSecTag2/canstatin真核载体的构建为进一步进行canstatin蛋白表达、活性鉴定和作用机制研究以及canstatin用于基因治疗奠定了基础.     

arresten基因转染对裸鼠实验性结肠癌肝转移的抑制作用

背景与目的:肝转移是晚期结肠癌患者最常见的致死原因,也是最常见的内脏转移,高达50%以上的结肠癌患者都会出现肝转移.本研究探讨arresten基因转染对人结肠癌LoVo细胞形成的裸鼠实验性结肠癌肝转移的影响.方法:通过脂质体转染法将arresten基因导入LoVo细胞,RT-PCR、Western blot分别检测arresten在mRNA、蛋白水平的表达,四甲基噻唑蓝(MTT)比色法检测arresten对LoVo细胞增殖的影响;通过建立裸鼠实验性结肠癌肝转移模型了解arresten对肿瘤转移的抑制作用;FⅧRag多克隆抗体染色的免疫组化方法检测肿瘤组织的微血管密度(microvessel density,MVD).结果:RT-PCR、Western blot结果显示arresten基因成功导入LoVo细胞并有arresten蛋白的表达.MTT比色法显示不同浓度的arresten对LoVo细胞增殖的影响差异无统计学意义(P＞0.05).导入arresten基因的LoVo细胞转移率为(25.1±2.1)%,低于未导入arresten基因的LoVo细胞的(87.1±1.2)%和对照组的(87.1±1.5)%,其差异均有统计学意义(P值均＜0.05).pSecTag2-arresten组裸鼠形成的肿瘤结节数为4.5 0.5,低于另外两组的19.6±2.5和20.4±2.5,其差异均有统计学意义(P值均＜0.05).pSeeTag2-arresten组形成的肿瘤MVD为15.3±3.5,低于另外两组(分别为42.2±2.6、45.6 5.1),其差异均有统计学意义(P值均＜0.05).结论:arresten能抑制结肠癌肝转移,其作用机制可能与arresten抑制肿瘤血管生成有关.     

癌胚抗原真核表达质粒构建与鉴定

癌胚抗原（CEA）是一种重要的肿瘤相关抗原，同时也是针对某些肿瘤治疗的有效靶抗原。为了探讨运用表达CEA的重组质粒进行抗肿瘤治疗的可行性，本研究构建了两套表达CEA的真核重组质粒。方法：运用基因工程技术将编码人CEA的全长2．4kbcDNA分别插入到真核表达载体pcDNA3及VR1012中，并用多种限制性内切酶对重组质位进行酶切鉴定。结果：构建的重组质粒均含有24kbEA片段，且插入pcD－NA3及VR1012中的2．4kb片段的方向均为正向，将这两套重组质粒分别命名为pCEA－1及pCEA－2。结论：本研究结果为进一步研究表达CEA的重组质位的免疫效应打下了基础。     

Arresten对人脐静脉内皮细胞增殖的影响及其作用机制

背景与目的：Arresten是近年发现的血管生成抑制因子，它能抑制裸鼠移植瘤的生长和转移。本文探讨arresten对人脐静脉内皮细胞huvec增殖的影响及其相关机制。方法：应用MTT法测试细胞的生长曲线，检测不同浓度的arresten对huvec细胞增殖的影响，流式细胞仪检测arresten对huvec细胞凋亡的影响，半定量RT—PCR及Western—blot分别检测人脐静脉内皮细胞的VEGF在mRNA水平及蛋白水平的表达。结果：Mr丌比色法显示，arresten对huvec细胞增殖具有抑制作用并呈浓度依赖性，但当其浓度增加到800ng／L后其增殖抑制率不再提高，而此浓度时huvec细胞的凋亡率达到峰值的59％；经过arresten处理，huvec细胞的VEGF在mRNA及蛋白水平的表达量均显著下降。结论：arresten通过降低huvec细胞的VEGF表达抑制huvec细胞增殖并促进huvec细胞凋亡。     

人白细胞介素-2真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建高效表达人IL－2的真核表达质粒,为IL－2的肿瘤基因治疗提供重要的工具。方法运用PCR扩增出人IL－2基因,经BamHI及EcoRI双酶切后,回收片段与BamHI及EcoRI处理的表达载体pcDNA3在T4DNA连接酶的作用下连接,并用多种限制性内切酶对重组质位进行酶切鉴定。结果PCR扩增片段的长度约为480bp,重组质粒经酶切显示,构建的质粒中含480bp的IL－2插人片段,将此重组质粒命名为pcDNA3－IL－2。结论本研究结果为进一步研究表达IL－2质粒的肿瘤基因治疗及免疫调节作用打下了基础。     

人癌胚抗原cDNA的克隆与真核表达质粒的构建

[目的] 将人癌胚抗原(CEA)cDNA克隆到真核表达载体pIRES中，构建真核表达质粒pIRES-CEA，以期在哺乳动物细胞中高效、稳定表达，并为下一步连接上热休克蛋白基因(HSP70)从而构建CEA-HSP融合核酸疫苗作准备。[方法] 从CEA阳性的大肠癌组织中提取总RNA，经RTPCR方法获取人癌胚抗原cDNA，用内切酶XhaⅠ和NotⅠ分别酶切质粒pIRES和CEA cDNA，通过T4连接酶将带有黏性末端的CEA-cDNA插入到DIRES质粒的XbaⅠ和NotⅠ酶切位点上。[结果] 通过PCR扩增获得了CEA基因，并将CEA-cDNA正向克隆到载体pIRES中。[结论] 已经成功构建了真核表达质粒pIRES-CEA，并为下一步连接上热休克蛋白基因（HSP70）从而构建CEA-HSP融合核酸疫苗作准备。     

人抑癌基因FHIT真核表达质粒的构建与鉴定

[目的]构建人抑癌基因FHIT真核细胞表达载体。[方法]采用PCR方法，从人胎脑组织的总cDNA中扩增出444bp的人FHIT cDNA片段，然后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）B中，用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒；用该表达质粒转染COS-7细胞，Western blot法检测FHIT蛋白的表达情况。[结果]人FHIT基因cDNA以正确方向插入到真核细胞表达载体DcDNA3．1／myc-His（-）B中；转染COS-7细胞后，可见转染细胞有Fhit蛋白的表达。[结论]本实验成功地构建了人抑癌基因FHIT的真核表达质粒pcDNA3．1／myc-His（-）B-FHIT，为研究FHIT基因在肿瘤的发生中的作用提供了有效的工具。     

重组凋亡素诱导人卵巢癌细胞顺铂耐药株凋亡

[目的]探讨凋亡素基因（VP3）在卵巢癌细胞株CoC1及CoC1细胞耐药亚株CoC1/DDP中的诱导凋亡情况。[方法]构建重组凋亡素真核表达载体pcDNA3.1-VP3。在体外将pcDNA3.1-VP3转染入卵巢癌细胞株CoC1及CoC1细胞耐药亚株CoC1/DDP中,RT-PCR检测凋亡素在细胞中的表达,用流式细胞仪检测细胞凋亡。[结果]RT-PCR证实VP3基因在CoC1及CoC1/DDP中存在并在转录水平表达。转染pcDNA3.1-VP3细胞凋亡率明显高于转染空质粒组（P〈0.01）,转染pcDNA3.1-VP3细胞凋亡率CoC1/DDP细胞明显高于CoC1细胞（P〈0.01）。[结论]凋亡素诱导人卵巢癌细胞CoC1和CoC1顺铂耐药亚株CoC1/DDP凋亡,且更易诱导CoC1顺铂耐药亚株CoC1/DDP细胞的凋亡。