不同来源人角膜缘干细胞的体外培养研究

目的探讨胎儿和成人角膜缘干细胞的体外培养方法并观察其生物学特性。方法应用消化培养法对胎儿和成人角膜缘上皮组织分别进行体外培养,观察记录培养细胞的生长特性并计算其克隆形成率(colony-form-ing efficiency,CFE)。对胎儿和成人角膜缘组织及培养细胞采用一系列单克隆抗体进行免疫酶细胞化学染色检测;并用扫描电镜观察原代细胞的表面状况。结果胎儿角膜缘干细胞原代培养时生长旺盛,8~10 d达到生长高峰,CFE为(26.18±4.75)%,传代时保持高增殖速率;成人角膜缘干细胞原代培养时生长不及胎儿细胞旺盛,6~8d达到生长高峰,CFE为(15.45±3.88)%,随着传代次数增加其增殖能力明显下降;两种细胞原代培养时CFE值差异有显著性(t=6.78,P<0.001)。免疫酶细胞化学染色见培养前胎儿角膜缘组织基底层有多量AE5阴性、AE1和PCNA阳性细胞,并见较多HLA-DR阳性细胞;胎儿原代培养细胞绝大部分AE5和HLA-DR染色阴性,AE1和PCNA阳性;传代培养至第3代时AE5阴性细胞仍占大部分;成人角膜缘组织及培养细胞染色结果则见上述干细胞特征细胞数量比例较低,而HLA-DR染色结果相似。扫描电镜观察胎儿原代细胞以球形或短圆柱形为主,表面多突起和微绒毛,成人原代细胞形态相似,但直径较大。结论采用消化培养法可成功培养出具有高增殖力等干细胞特性的胎儿角膜缘干细胞,其抗原性较培养前明显降低,且其生物学特性显著优于成人角膜缘干细胞,是一种新的优越的角膜缘干细胞来源,将在临床眼表重建中展现广阔的应用前景。     

人胎儿角膜缘干细胞的体外培养及鉴定

目的 探讨人胎儿角膜缘干细胞的体外培养及鉴定方法。方法 应用消化培养法对人胎儿角膜缘上皮组织进行体外培养并观察记录培养细胞的生长特性；对胎儿角膜缘组织及培养细胞采用一系列单克隆抗体进行免疫酶细胞化学染色检测；并用扫描电镜观察原代细胞的表面状况。结果 胎儿角膜缘上皮细胞原代培养时生长旺盛，传代培养时保持高增殖速率。免疫酶细胞化学染色见培养前胎儿角膜缘组织基底层有多量AE5阴性、AE1和PCNA阳性细胞，并见较多HLA-DR阳性细胞；原代细胞绝大部分AE5和HLA-DR染色阴性，AEI和PCNA阳性；传代培养至第3代时AE5阴性细胞仍占大部分；扫描电镜观察原代细胞以球形或短圆柱形为主，表面多突起和微绒毛。结论 采用消化培养法可成功培养出具有高增殖力和低抗原性的人胎儿角膜缘干细胞．为临床眼表重建开辟了新的思路。     

深低温保存兔角膜缘干细胞的体外培养

目的 探寻深低温保存兔角膜缘干细胞的体外培养方法。方法 将2mm宽的兔角巩膜组织通过程序降温仪降温后置于-196℃液氮中深低温保存。1年后复温，应用消化培养法分别对冻存及新鲜的兔角膜缘干细胞进行体外培养，观察并记录细胞生长情况，HE染色观察培养细胞的形态特征。结果 经过深低温保存的兔角膜缘干细胞可以在体外被成功培养并传代，其在原代培养48h后开始贴壁生长，5d后生长较旺盛，但可见部分破裂和死亡细胞，约12d基本形成单层；传代培养时次日贴壁，7d形成单层。新鲜兔角膜缘干细胞原代培养时细胞形态相似，但破碎死亡细胞少见，且于7d左右即基本形成单层，传代时两者无明显差别。结论 深低温保存的角膜缘干细胞能被成功地进行体外培养，培养后细胞具有与培养的新鲜角膜缘干细胞基本相似的特性，为深低温保存的角膜缘干细胞培养后移植治疗临床眼表疾病提供了实验依据，并为眼库技术的发挥开辟了新的应用途径。     

兔角膜缘干细胞的体外培养、鉴定及形态学特点

目的 体外培养兔角膜缘干细胞(limbal stem cells,LSCs),观察其生物学特性.方法 用含20%胎牛血清DMEM:F12(1:1)培养基对兔LSCs进行体外培养,倒置显微镜及HE染色观察培养细胞体外生长的形态,免疫细胞化学AE5和P63染色鉴定并进行图像分析,透射电镜观察超微结构特点.结果 培养2～3 d细胞从组织块游出,6～8 d形成良好的单层,细胞多呈圆形或卵圆形.电镜观察,培养7 d LSCs呈卵圆形,表面有少量微绒毛突起;胞质内细胞器少,核大,核仁明显,核浆比例大,部分细胞可见双核现象.免疫组化观察,培养第7天,大量细胞AE5免疫反应染色呈阴性,阳性细胞数量较少,大量细胞P63免疫反应染色呈阳性;培养第14天,AE5阳性细胞数明显增多,免疫反应染色增强,阳性细胞的平均灰度值显著降低(7 d:184.30±9.85,14 d:133.36±25.00,P<0.01).P63免疫反应阳性细胞数第14天与第7天相比明显减少,而阳性细胞的平均灰度值显著增高(7 d:108.13±17.96,14 d:177.59±7.86,P<0.01).结论 应用组织培养方法获得的原始细胞具有与体内正常LSCs相一致的形态特征;培养第7天为LSCs生长的峰值期.     

兔角膜缘干细胞的体外原代培养和生物学鉴定

目的 建立兔角膜缘干细胞体外培养方法,观察其生物学特性。方法 用含20％胎牛血清1640培养液对兔角膜缘干细胞进行体外培养,倒置显微镜观察培养细胞体外生长的形态,电镜观察培养细胞的超微结构并进行免疫细胞化学和间接免疫荧光鉴定。结果 植块48～72h细胞开始贴壁生长,7～10d形成良好的单层,细胞呈圆形、卵圆形或多边形,类似角膜上皮细胞;电镜下,可见细胞表面有许多微绒毛,细胞间有桥粒连接,胞质丰富,胞质细胞器较多,含有线粒体等结构;免疫细胞化学和间接免疫荧光染色显示,培养第8天少量细胞角蛋白K3(AE5)免疫反应呈阳性,细胞质被染色,培养第14天和第21天,较多细胞．AE5免疫反应阳性。结论 含20％胎牛血清1640培养液能作为角膜缘干细胞培养的基础液。应用组织培养方法获得的原代培养细胞具有与正常角膜缘干细胞相一致的生物学特性。     

角膜缘干细胞体外培养的研究进展

<正>角膜上皮细胞具有自我更新的能力,眼表的正常结构和功能的维持有赖于角膜缘干细胞的不断分化、增殖、移行来完成。随着眼表疾病研究有突破性进展,角膜缘干细胞在眼表中的重要性越来越受到人们的重视,角膜缘干细胞体外培养的研究也日渐增多。笔者现就角膜缘干细胞的体外培养与临床应用作     

兔角膜缘干细胞体外无血清培养及生物学特性初步研究

目的探讨兔角膜缘干细胞体外无血清培养方法及生物学特性并与传统的10%血清培养方法进行比较。方法获取兔角膜缘组织,酶消化法制成单细胞悬液,分含B27的无血清组和传统方法的10%血清组两组进行培养,观察两组细胞的生长情况,CCK-8检测其克隆增殖能力,细胞免疫化学染色方法对两组细胞进行鉴定。结果较传统10%血清培养组,无血清培养组培养的兔角膜缘干细胞表现出相似的生长特性及增殖能力,细胞免疫化学染色无血清组⊿Np63阳性细胞较10%血清组明显多,角蛋白K3（AE5）阳性细胞10%血清组较多。结论用含B27的无血清培养基可以培养获得角膜缘干细胞,减少了血清中不明成分对干细胞的影响,为角膜缘干细胞的体外培养、扩增及纯化提供了新的选择。     

兔角膜上皮体外培养及其生物学特性的研究

应用组织培养技术对兔角膜上皮进行了研究,观察了其形态、生物学特性及超微结构,对影响上皮生长的某些因素进行了讨沦。结果表明:组织块培养及角膜基质对上皮的生长有促进作用。细胞群体平均倍增时间17.60±4.51h((?)±s),细胞平均直径24.20±3.85μm((?)±s),平均密度2174.10个/mm~2。光镜及电镜显示培养的细胞与正常活体内的细胞相似,可代替活体内的细胞用于多方面的研究。     

兔角膜基质细胞的体外培养及生物学特性

目的 改进兔角膜基质细胞培养技术，观察其生物学特性。方法 先同时消化角膜上皮及内皮层，然后刮去上皮，内皮，前弹力和后弹力层，接着将剩余的基质层剪碎消化，接种，采用MTT法观察细胞生长情况，并对比有，无血清培养基对细胞生长的影响。结果 角膜基质细胞10d后形成细胞单层，增殖旺盛，有血清培养基培养到第8天左右达到生长高峰，无血清培养基培养的细胞生长较慢，第9天左右达到生长高峰，结论 改进的角膜细胞培养技术简便，成功率高，培养出的角膜基质细胞生长良好，血清对角膜基质细胞生长有一定的影响。     

兔角膜缘上皮细胞体外培养及其生物学特性的初步研究

目的：建立体外培养兔角膜缘上皮细胞的方法,观察其体外生长的生物学特性。方法：应用组织培养的方法,对兔角膜缘上皮细胞进行体外原代和传代培养,用倒置显微镜观察培养的兔角膜缘上皮细胞体外生长的特征,用苏木精-伊红染色、糖原（PAS）染色,细胞角蛋白免疫组化染色和电镜检查的方法对培养细胞进行形态学检查和鉴定。结果：兔角膜缘上皮细胞可以在体外成功的培养传代,原代培养细胞大多48h贴壁,5天后旺盛生长,15天形成单层,传代培养细胞次日贴壁10天形成单层。细胞角蛋白AE1单克隆抗体染色阳性,PAS染色阴性,培养细胞呈多角形,细胞表面具有丰富的微绒毛,细胞之间有桥粒连接,结论：应用组织培养的方法可以成功获得原代和传代培养的兔角膜缘上皮细胞,培养的细胞具有与正常兔角膜上皮细胞相一致的生物学特性。     

去上皮羊膜上培养兔角膜缘干细胞的实验研究

目的探讨去上皮羊膜上培养兔角膜缘干细胞的可行性。方法取小块兔角膜缘组织,采用组织块 细胞悬液共培养,待细胞长至对数生长期,分别传代于去上皮羊膜和完整羊膜,甲基偶氮蓝比色(MTT)法对比两组细胞增殖率,并行AE_5免疫鉴定。结果原代细胞接种7d左右,生长至对数生长期,细胞融合成单层。去上皮羊膜组细胞传代培养效果明显优于完整羊膜组。AE_5单克隆抗体染色强阳性。结论去上皮羊膜上培养出的兔角膜缘组织既有角膜上皮特性,又具有强的增殖潜力。     

兔骨髓基质干细胞体外培养的生物学特性

目的：分离培养兔骨髓基质干细胞并探讨其体外生物学特性。方法：通过梯度密度离心法分离兔骨髓基质干细胞,体外培养、扩增,观察细胞的大体形态和超微结构;通过绘制细胞生长曲线、四甲基谷氮唑盐（MTT）实验来研究细胞的增殖能力和代谢活性。结果：兔骨髓基质干细胞呈梭形,胞浆内有丰富的粗面内质网和线粒体,具有很强的增殖能力和代谢活性。结论：本实验方法取材方便,能较容易地获得大量的兔骨髓基质干细胞。     

培养的异体人角膜缘干细胞移植治疗眼表疾病

目的探讨培养的异体人角膜缘干细胞移植治疗眼表疾病的方法和疗效。方法采用消化培养法,对角膜移植术后剩余角膜缘组织进行体外培养,载体为冰冻保存人羊膜,培养的细胞形成单层后,移植到已去除病变组织的眼球表面,观察眼表结构的愈合情况。结果31例(34眼)眼表疾病患者进行了培养的异体人角膜缘干细胞移植,所有病例术后早期(2月内)均形成良好眼表,但随访3~41(平均15.4±11.6)个月后,有3例复发性翼状胬肉患者再次复发,1例急性眼碱烧伤于术后2月时发现角膜轻度血管化和结膜化,其他患者在随访期内均维持稳定的眼表情况,视力也有不同程度的提高。结论培养的异体角膜缘干细胞移植术是治疗因角膜缘干细胞缺乏或功能障碍引起的眼表疾病的有效方法。     

兔骨髓间充质干细胞的提取与体外培养

目的 通过提取兔骨髓中间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)并加以纯化，在体外培养条件下研究其增殖及生长特性。方法 从骨髓中提取间充质干细胞，体外培养扩增，再以相差显微镜、电镜观察并绘制生长曲线。结果 原代培养及传代培养显示，兔自体骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖倍增能力；骨髓间充质干细胞内细胞器与其生物活性变化相一致。结论 骨髓间充质干细胞体外培养成功，为今后利用自体间充质干细胞通过组织工程学方法修复软骨、骨、肌肉系统的组织缺损奠定了基础。     

带角膜缘干细胞的板层角膜移植术治疗严重角膜病变

目的 报告带角膜缘干细胞的异体板层角膜移植术治疗严重角膜病变的疗效。方法 供体角膜选用新鲜尸体眼球，制作的板层角膜植片包括透明角膜、角膜缘和角膜缘周围4mm的巩膜，移植到已去除病变组织的眼球表面，观察眼表结构的愈合情况。结果 63例（63眼）角膜病变患者被实施了带角膜缘干细胞的板层角膜移植术，经过5～52月，平均（12．5土6．2）月的随访，大部分患者维持较稳定的眼表，但有3例患者出现明显的上皮排斥反应，经过强化抗排斥治疗，2例被控制；1例蚕蚀性角膜溃疡患者于术后6月复发；所有角膜良性肿瘤患者在随访期内均未见复发。结论 带有活性角膜缘干细胞的异体板层角膜移植是治疗伴有角膜缘干细胞缺乏或功能障碍的严重角膜病变的较好方法。     

三种不同型别小鼠骨髓来源间质干细胞的生物学特性分析

【目的】间质干细胞(MSC)是一种间质来源的多潜能基质细胞,目前人和多种动物来源的MSC均已被成功分离鉴定。然而由于小鼠骨髓MSC的分离相对人和其他物种更为困难,关于小鼠骨髓MSC的克隆分析结果也相对有限且结果不尽一致。为此,本研究拟进一步探讨小鼠MSC的体外分离方法,并对MSC克隆形成单位进行生物学特性分析。【方法】 取C57BL/6小鼠,冲洗股骨骨髓腔获得骨髓单个核细胞悬液,低密度接种培养,并通过有限稀释克隆挑选获得三种形态、生长特点不同的克隆形成单位(CFU)。采用流式分析技术对三种类型的CFU进行表型分析,并用油红O和茜素红分别进行成脂和成骨分化诱导鉴定。【结果】 低密度培养并结合克隆化培养分离技术成功获得C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,并观察到偏圆形(MSC1)、长梭形(MSC2)以及纺锤形、多边形(MSC3)三种贴壁形态细胞类型;免疫表型分析显示,三种细胞均强表达Sca-1,不表达CD11b、CD45,部分表达CD90.2;体外诱导分化实验证实,MSC1仅具有向脂肪细胞分化的潜能,MSC2仅具有向成骨细胞分化的潜能;MSC3则具有成骨、成脂双向分化能力。【结论】 低密度培养并结合克隆化培养分离技术可成功分离小鼠骨髓间充质干细胞;小鼠MSCs是一种高度异质性的细胞群,其中可能含有多能MSC或单一分化方向的前体细胞等处于不同分化阶段的细胞类型。