大鼠急性CCl_4损伤肝库普弗细胞对肝星状细胞增殖和Ⅰ型胶原分泌的影响

通过细胞体外培养观察急性CCl4 肝损伤的大鼠肝库普弗细胞对正常肝星状细胞的激活作用。方法　以 5 0 ?l4 橄榄油一次灌胃复制大鼠急性肝损伤模型 ,分离模型大鼠肝库普弗细胞并原代培养 ,收集条件培养液 ,以其温育正常大鼠分离的原代培养肝星状细胞 ,二苯基四氮唑溴盐 (MTT)法测定细胞增殖 ,ELISA法测定Ⅰ型胶原分泌。结果　损伤肝库普弗细胞条件培养液可显著促进肝星状细胞的增殖及Ⅰ型胶原分泌 ,并具一定量效、时效关系 ;还可促进星状细胞表型向肌成纤维样细胞转化 ,而正常大鼠分离的肝库普弗细胞则无明显作用。结论　肝损伤时库普弗细胞对肝星状细胞的活化有多方面旁分泌激活作用     

维生素E对肝星状细胞增殖及胶原合成的影响

动物实验研究表明维生素Ｅ(ＶｉｔＥ)具有抗肝纤维化作用[1] ,但其具体机制不明。目前认为肝星状细胞 (ＨＳＣ)在肝纤维化形成中起关键作用[2 ] 。为探讨ＶｉｔＥ抗肝纤维化的细胞学机制 ,我们以白细胞介素 2 (ＩＬ 2 )及肿瘤坏死因子α(ＴＮＦα)作为刺激因素观察了ＶｉｔＥ对大鼠ＨＳＣ增殖和胶原合成的调控作用。—、材料和方法1 实验动物 :雄性ＳＤ大鼠 ,体重 5 5 0ｇ。2 大鼠ＨＳＣ的分离和培养 :采用链酶蛋白酶和胶原酶液原位循环灌注消化肝脏 ,经 11%Ｍｅｔｒｉｚａｍｉｄｅ液一步密度梯度离心分离大鼠ＨＳＣ。将分离的ＨＳＣ按 2…     

三七总甙对肝星状细胞增殖及胶原生成的影响

目的:探讨三七总甙抗肝纤维化作用机制。方法:按常规方法分离正常大鼠肝星状细胞,用三七总甙药物温育液作用于传一代培养的肝星状细胞,~3H-TdR掺入观察细胞增殖,ELISA法测定上清及细胞层Ⅰ型胶原含量,改良Lowry's法测定细胞层总蛋白以校正细胞数。结果:三七总甙不同浓度组均能抑制肝星状细胞增殖及细胞内外Ⅰ型胶原生成,尤以细胞外的抑制更为明显,与对照组及2.5×10~(-7)M秋水仙碱组比较差异显著。结论:三七总甙抗肝纤维化作用可能是通过抑制肝星状细胞增殖及细胞内外Ⅰ型胶原生成来实现的。     

脂多糖诱导大鼠肝星状细胞增殖与提高其胶原表达水平的细胞模型研究

目的：建立较为全面反映肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)活化效应的细胞模型。方法：应用脂多糖(lipopolysccharide,LPS)刺激体外培养的大鼠HSC。噻唑蓝(MTT)法测定HSC增殖率。免疫组化法显示HSC表达其Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达水平，并进行图象分析。结果：LPS明显刺激HSC的增殖并提高I、Ⅲ型胶原表达水平，与对照组比较差异有非常显著性意义(P＜0．01)。结论：LPS诱导HSC活化模型能够相对全面地反映HSC活化的效应。     

罗格列酮对肝星状细胞增殖与胶原合成的影响

目的 观察罗格列酮对肝星状细胞增殖与Ⅰ型胶原合成的影响.方法 采用HSC-T6肝星状细胞系,将培养的肝星状细胞(HSC)分为对照组、不同浓度的罗格列酮组(5、10、20 μmol/L).采用MTT法观察罗格列酮对HSC增殖的影响,采用ELISA法检测细胞培养液上清中Ⅰ型胶原的含量.结果 与对照组相比,在10、20μmol/L罗格列酮组,罗格列酮可以抑制HSC的增殖(P<0.05),同时细胞堵养液上清中Ⅰ型胶原含量分别为135.72±6.00 ng/ml、128.65±5.34 ng/ml,均低于对照组(149.35±6.65 ng/ml),差异有统计学意义(P<0.05).结论 罗格列酮可以抑制HSC的增殖,抑制肝星状细胞Ⅰ型胶原的合成.     

舒肝颗粒对大鼠肝星状细胞增殖及胶原分泌的影响

目的:观察舒肝颗粒对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)增殖及胶原分泌的影响.方法:体外培养HSC-T6.设空白对照组、正常对照组和舒肝颗粒干预组,其中,舒肝颗粒干预组设7个浓度梯度.前两者加入无血清的RPMI 1640胞培养液,后者加入含舒肝颗粒的无血清RPMI 1640细胞培养液,药物终浓度分别为0.56、0.28、0.14、0.07、0.035、0.018和0.009 g/L.采用MTT法检测细胞增殖,ELISA法检测Ⅰ、Ⅲ及Ⅳ型胶原含量.结果:经48 h,舒肝颗粒干预组HSC抑制率分别为48.59%、38.24%、28.12%、21.15%、8.47%、7.26%和0.33%,明显高于正常对照组,且呈剂量效应关系.舒肝颗粒干预组细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原含量较正常对照组明显降低(5.437 μg/L±0.043 μg/L、3.26μg/L±0.217μg/L、2.18μg/L±0.245μg/L vs 13.817μg/L±0.787μg/L、8.629μg/L±0.178μg/L、5.29μg/L±0.315μg/L,均P<0.01).结论:舒肝颗粒可通过抑制HSC增殖和胶原蛋白的分泌,减少胶原纤维在肝脏内的沉积,这可能是其抗肝纤维化的作用机制之一.     

瘦素对乙醛诱导肝星状细胞活化过程中Ⅰ型胶原及α-平滑肌肌动蛋白表达的影响

目的:观察瘦素对乙醛诱导肝星状细胞(HSC)活化过程中α-SMA和I型胶原表达的影响,旨在从体外探讨瘦素在酒精性肝病中的可能作用。方法:采用SD大鼠肝脏原位灌流消化的方法获得并原代及传代培养HSC,分乙醛(200μmol/L)处理组,瘦素(100nmol/L)处理组及联合处理组(乙醛200μmol/L加瘦素100nmol/L)。用实时荧光定量PCR方法检测各组细胞TGF-β1、Ⅰ型胶原及α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)mRNA表达水平,Western blot检测各组细胞α-SMA表达量,ELISA法检测培养上清中TGF-β1及Ⅰ型胶原含量。结果:①乙醛处理组中TGF-β1和Ⅰ型胶原基因及蛋白表达量明显高于空白对照组(P<0.05),α-SMA表达量与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05);②瘦素处理组TGF-β1、Ⅰ型胶原及α-SMA表达量与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05);③联合处理组TGF-β1、Ⅰ型胶原及α-SMA表达量明显高于对照组(P<0.05),但TGF-β1、Ⅰ型胶原表达量与乙醛处理组相比差异无显著性意义(P>0.05)。结论:在乙醛诱导肝星状细胞活化过程中,瘦素能协同上调α-SMA的表达;但对TGF-β1及Ⅰ型胶原的表达无影响,Ⅰ型胶原和α-SMA的表达可能是依赖于不同的调控机制来实现。     

内毒素对肝星状细胞结缔组织生长因子表达的影响

结缔组织生长因子(CTGF)是调节细胞增生、分化和细胞外基质形成的重要效应分子。肝星状细胞(HSC)是肝纤维化时产生CTGF的主要细胞。内毒素(LPS)血症是肝纤维化的诱因之一。现研究HSC在LPS作用下CTGF mRNA表达情况,探讨CTGF在LPS介导肝纤维化中的作用和地位。     

重组转化生长因子β3基因对大鼠肝星状细胞Ⅰ型胶原表达的影响

目的观察转化生长因子D3基因（TGFβ3）对大鼠肝星状细胞株（HSC—T6）Ⅰ型胶原合成的影响。方法TGFβ3表达质粒[pcDNA3．1（＋）-TGFβ31和TGFβ1表达质粒[pcDNA3．1（＋）-TGFD11的构建。通过脂质体介导方法，将pcDNA3．1（＋）-TGFβ1、pcDNA3．1（＋）-TGFβ3分别及共同转染体外培养的HSC—T6细胞，荧光定量PCR法及Westernblot法分别检测转染后TGFβ1、TGFD3、Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达。将pcDNA3．1（＋）-TGFD1转染HSC—T6细胞，经G418筛选建立高表达TGFD1的HSC～T6细胞克隆，pcDNA3．1（＋）-TGFD3转染克隆细胞，荧光定量PCR法检测转染后TGFβ3、TGFβ1及Ⅰ型胶原mRNA的表达，Westernblot法检测TGFβ1、Ⅰ型胶原蛋白的表达情况。结果构建的pcDNA3．1（＋）TGFD3、pcDNA3．1（＋）-TGFD1质粒可转染HSC—T6细胞，转染率28．2％。pcDNA3．1（＋）TGF侈3转染细胞后，Ⅰ型胶原mRNA及蛋白的表达较空白组及对照组增加，以72h增高最为明显（P〈0．05）；共转染组Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达较pcDNA3．1（＋）-TGFβ1转染组明显降低（P〈0．05）。TGF侈3转染克隆细胞后，TGFD1mRNA表达较克隆组无明显改变（P〉0．05），而蛋白质表达明显下降（P〈0．05），Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质表达均较克隆组明显降低（P〈0．05）。结论TGFD3基因转染正常培养的HSC—T6细胞，增加Ⅰ型胶原的表达；转染高表达TGFβ1的克隆组HSC—T6细胞，Ⅰ型胶原表达明显降低，提示TGFβ3对肝纤维化的发生有抑制作用。     

去甲肾上腺素对肝星状细胞表达瘦素以及瘦素受体的影响

目的:探讨交感神经递质去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)对体外培养肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)系表达瘦素以及瘦素受体的影响.方法:用不同浓度的NE作用于HSC,分别于24、48及72 h收集细胞,免疫组织化学方法检测活化HSC表达α-肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)情况;Western blot法检测其表达瘦素以及瘦素受体蛋白的影响;real-time PCR检测NE对HSC瘦素以及瘦素受体m RNA的影响.结果:(1)免疫组织化学结果显示,1、10、100μm o l/L浓度N E作用于H S C 24 h,α-SMA表达明显增加(14.1±4.4,17.5±5.2,19.8±4.1 vs 11.3±4.5;P0.05);提示NE可以活化HSC,并促进HSC增殖.10μmol/L N E作用H S C 24、48、72 h后,α-S M A表达逐渐增强(17.5±5.2;18.5±5.4;19.2±6.2,P0.05);提示N E对H S C的促增殖作用具有时间依赖性;(2)Western blot结果显示,1、10、100μmol/L NE作用于HSC 24 h后,瘦素蛋白表达明显高于对照组(1.54±0.08,2.72±0.09,2.84±0.18 vs 0.85±0.12,P0.05);瘦素受体蛋白表达亦明显高于对照组(1.57±0.18,2.51±0.17,2.89±0.19 vs0.98±0.15,P0.05);(3)Real-time PCR检测HSC瘦素以及瘦素受体m RNA的表达增加,1、10、100μmol/L NE作用于HSC 24 h后,瘦素m RNA表达明显高于对照组(1.51±0.08,2.58±0.09,3.63±0.12 vs 1.00±0.07,P0.05);瘦素受体m RNA表达亦明显高于对照组(1.71±0.08,2.87±0.10,4.01±0.14 vs1.00±0.08,P0.05).结论:交感神经递质NE对体外活化的HSC瘦素以及瘦素受体的表达均有促进作用,从而参与了肝纤维化的进程.     

双环醇对慢性乙型肝炎患者肝星状细胞活化和胶原合成的影响

目的:观察双环醇对慢性乙型肝炎(乙肝)患者肝组织炎症、纤维化程度、肝星状细胞活化和胶原合成的影响,探讨其抗纤维化作用机制。方法:20例慢性乙肝患者以双环醇150mg/d治疗24周,治疗前、后分别行肝穿刺活体组织病理学检查,评估治疗前、后肝组织炎症及纤维化程度;并应用免疫组织化学技术和彩色病理图文分析系统观察治疗前、后肝组织内α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β1(TGF-β1)表达状况和Ⅰ、Ⅲ型胶原含量的变化。结果:慢性乙肝患者经双环醇治疗后,其血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和γ谷氨酰转移酶(γ-GT)水平可显著降低,复常率分别达95%和70%,不仅肝组织炎症和纤维化程度明显改善,且肝组织内α-SMA和TGF-β1的表达强度明显减弱,同时Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量也较治疗前明显降低。结论:双环醇治疗可减轻慢性乙肝患者肝脏炎症反应和纤维化程度,同时明显降低肝组织内TGF-β1、α-SMA的表达,阻止肝星状细胞活化和Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成,从而发挥抗纤维化作用。     

氧化苦参碱对大鼠肝星状细胞增殖的影响

目的探讨氧化苦参碱对大鼠肝星状细胞增殖的影响及其抗肝纤维化的机理.方法用链酶蛋白酶和胶原酶原位灌流消化正常大鼠肝脏,Nycodenz密度梯度离心分离肝星状细胞,以MTT比色法观察氧化苦参碱对肝星状细胞毒性作用,3H-TdR法观察氧化苦参碱对肝星状细胞增殖的效应.结果氧化苦参碱浓度＞10-5mol/1时对肝星状细胞增殖有抑制作用(P＜0.05).结论氧化苦参碱可抑制肝星状细胞的增殖,有抗肝纤维化的作用.     

Specific shRNA targeting of FAK influenced collagen metabolism in rat hepatic stellate cells

AIM:To investigate the effects and mechanism of disruption of focal adhesion kinase(FAK) expression on collagen metabolism in rat hepatic stellate cells(HSC).METHODS:The plasmids expressing FAK short hairpin RNA(shRNA) were transfected into HSC-T6 cells,and the level of FAK expression was determined by both real-time quantitative polymerase chain reaction(QPCR) and Western blotting analysis.The production of type collagen and type collagen in FAK-disrupted cells was analyzed by real-time Q-PCR.The level of ...     

氧化苦参碱对大鼠贮脂细胞增殖和胶原合成的抑制作用

目的 研究氧化苦参碱对大鼠贮脂细胞增殖和胶原合成的影响。为应用氧化苦参碱防治肝纤维化提供理论依据。方法 分离、培养大鼠贮脂细胞，采用甲基噻唑基四唑蓝（ＭＴＴ）法和＾３Ｈ－脯氨酸掺入法分别测定细胞增殖和交原合成。结果 氧化苦参碱在５ｕｇ～５００ｕｇ／ｍｌ浓度范围内能呈剂量依赖性抑制贮脂细胞的增殖和胶原合成，提高药物浓度则形成作用平台。结论 氧化苦参碱在体外具有抑制大鼠贮脂细胞增殖和胶原合成的作用。这对防治肝纤维化可能有一定的临床应用价值。     

牛磺酸对离体肝星状细胞增殖及凋亡的影响

目的　观察牛磺酸对肝星状细胞增殖及凋亡的影响 ,并探讨其作用的可能机制。方法　用噻唑蓝 (MTT)法检测细胞增殖 ,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡 ,丫啶噔活体染色观察细胞凋亡形态 ,免疫细胞化学结合计算机图像分析系统检测c jun、c fos表达。 结果　在 5～ 5 0mmol/L浓度范围内 ,牛磺酸能剂量依赖性地抑制肝星状细胞增殖 ,可使G0 /G1期细胞增多 ,S期细胞减少 ,并能明显抑制c jun、c fos的表达 (P <0 .0 1)。此外 ,牛磺酸尚可抑制血小板源生长因子BB对肝星状细胞的促增殖作用 ,而牛磺酸对肝星状细胞凋亡无诱导作用。结论　牛磺酸可显著抑制肝星状细胞增殖 ,使肝星状细胞阻滞于G0 ～G1期 ;牛磺酸对肝星状细胞增殖的抑制作用与其抑制c jun、c fos的表达有关 ;牛磺酸不能诱导肝星状细胞凋亡。     

大鼠肝细胞对肝星状细胞增殖与活化的影响及其机制探讨

目的观察肝细胞对原代肝星状细胞（HSC）增殖、表型、胶原表达等生物学特性的影响，并为探讨其作用机制提供线索。方法原位灌流分离大鼠HSC，与大鼠肝细胞系BRL共培养48h。在相差显微镜下观察HSC的表型变化，用Westernblot方法检测其α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型前胶原的表达，TUNEL方法检测其凋亡。取BRL细胞的培养上清液培养原代HSC，用MTT法检测其增殖。采用抗体芯片投水碌示BRL细胞的培养上清液与对照培养基之间细胞凶子的表达差异。结果BRL细胞的培养上清液明显促进HSC增殖（P〈0．01）。与BRL细胞共培养的原代HSC胞体收缩性增强，Ⅰ型前胶原及α-SMA的表达上调，凋亡增加（P〈0．01）。较对照培养基，BRL细胞的培养上清液中帆管内皮生长因子（VEGF）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP-1）等三种细胞因子显著上调。结论肝细胞可促进原代HSC的增殖与活化，其机制可能与肝细胞分泌VEGF、MCP-1、TIMP-1等细胞因子有关。     

羟基喜树碱对HSC-T6细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨羟基喜树碱(HCPT)对体外培养大鼠肝星状细胞(HSC)的增殖与凋亡的影响.方法 大鼠肝星状细胞(HSC-T6)和大鼠正常肝细胞(BRL-3A)分别在实验组(分别以含HCPT浓度为0.008、0.016、0.031、0.063、0.125,0.25、0.5、1、2、4、8、16、32mg/L的培养液培养)和对照组(单纯培养)体外培养24 h.用四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖情况,找出HCPT对HSC-T6细胞增殖抑制的最佳作用浓度;流式细胞仪检测细胞凋亡率;透射电子显微镜下观察细胞凋亡的形态学变化情况;琼脂糖凝胶电泳法检测DNA片段化.多个样本均数的比较采用单因素方差分析,两样本均数的比较采用t检验.结果 HCPT对HSC-T6细胞和BRL-3A细胞的增殖抑制率随着药物浓度的升高而逐渐升高;当HCPT浓度＞0.5mg/L时,对BRL-3A细胞的毒性作用显著增高(P值均<0.05);0.5 mg/L对HSC-T6细胞增殖抑制作用最大,为HCPT对HSC-T6细胞增殖的最佳抑制浓度.0.125、0.25、0.5 mg/L的HCPT作用HSC-T6细胞24h,流式细胞仪检测显示细胞凋亡率分别为13.46%±2.42%、26.25%±5.65%、47.05%±8.76%,与对照组(4.89%±1.80%)相比,差异有统计学意义(F=34.24,P<0.01).0.5mg/L的HCPT作用HSC-T6细胞24 h,透射电子显微镜下可见细胞体积缩小,核仁消失,染色质浓缩聚集成团块状,沿核膜排列等凋亡形态学改变;琼脂糖凝胶电泳可见明显的DNA梯度带形成.结论 HCPT在体外可以明显地抑制HSC-T6细胞的增殖、诱导HSC-T6细胞凋亡,作用强度呈剂量依赖性.     

去甲肾上腺素对大鼠肝星状细胞作用的实验研究

目的 探讨交感神经系统在肝纤维化发生和发展中的作用. 方法采用免疫荧光和RT-PCR检测体外培养的肝星状细胞(HSC)中α1、β2-肾上腺素能受体的表达;用四甲基偶氮唑盐法检测不同浓度的去甲肾上腺素(NE)对HSC增殖活性的影响.同时用RT-PCR检测受NE作用后HSC的活化指标胶原蛋白-1、转化生长因子β(TGF β)及α-平滑肌动蛋白(α-SMA)的表达.用高效液相色谱-电化学法测定活化的HSC中交感神经递质NE的水平. 结果α1和β2-肾上腺素能受体表达于HSC的胞膜和胞质内;NE可呈剂量依赖性地促进HSC增殖,在浓度为100μmol/L时达到最大效应,F=140.464,P<0.05,差异有统计学意义.以NE 100 μmol/L作用细胞24h后,可显著促进反应HSC活化的指标上升,胶原蛋白-1表达为0.3022±0.0610,TGF β表达为2.2080±0.2151,α-SMA mRNA表达为0.5469±0.0108,与对照组胶原蛋白-1(0.1040±0.0556)、TGF β(1.1190±0.0070)、α-SMA mRNA表达(0.0759±0.0449)比较,t值分别为-4.160、-8.763和-17.651,P值均<0.05,差异均有统计学意义.HSC可以合成并释放NE,且受血小板衍生生长因子(10ng/ml)刺激后HSC中NE含量为(14.24±0.21)ng/ml,对照组为(11.34±0.15)ng/ml,两组比较,t=-32.907,P<0.05,差异有统计意义.结论 抑制交感神经系统使HSC活性降低对临床上治疗肝纤维化有一定的指导意义.     

Effect of lipid on proliferation and activation of rat hepatic stellate cells (Ⅰ)

ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮＤｅｓｐｉｔｅｔｈｅｅａｒｌｙｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｙｏｖｅｒｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｃｅｌｕｌａｒｓｏｕｒｃｅｏｆｅｘｔｒａｃｅｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｌｉｖｅｒｆｉｂｒｏｓｉｓ,ｃｏｍｐｅｌｉｎｇｉｎｖｉｔｒｏ...     

miR-21对肝星状细胞的增殖和成纤维化的影响

目的研究miR-21对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)的增殖和成纤维化的影响。方法将大鼠HSC-T6传代分为四组,分别为正常组、酒精组、miR-21模拟物组、miR-21抑制剂组。其中正常组不做处理;miR-21模拟物组和miR-21抑制剂组分别将miR-21模拟物和miR-21抑制剂瞬时转染入细胞;然后,再用含有酒精的培养基诱导酒精组、miR-21模拟物组、miR-21抑制剂组的HSC的活化;48 h后,分别做两部分实验,一部分是细胞增殖测试实验(cell counting kit-8,CCK8);另一部分是提取各组细胞蛋白,Western blotting检测因子增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)、Smad3、平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscles actin,α-SMA)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的表达变化。结果CCK8结果显示,miR-21模拟物能够促进HSC的增殖与活化,从而促进纤维化的进展;而miR-21抑制剂能够抑制HSC的活化,降低HSC的活力值,缓解纤维化的进展。Western blotting检测结果显示,PCNA、TGF-β1、Smad3、α-SMA、CTGF在酒精组的表达量明显比正常组高(P<0.05),而在miR-21模拟物组则比酒精组高(P<0.05),miR-21抑制剂组比酒精组明显降低(P<0.05)。结论miR-21能够促进HSC的增殖,促进HSC成纤维化的进展。