人λ-干扰素在BHK-21中的表达及生物学活性的研究

目的:研究HuIFN-λ1和HuIFN-λ2真核细胞重组表达及其生物学活性.方法:用水疱性口炎病毒(VSV)刺激人宫颈癌HeLa细胞, 用RT-PCR克隆HuIFN-λ1和HuIFN-λ2基因, 与PCAGG-EGFP真核表达载体连接, 构建重组体PCAGG-HuIFN-λ1和PCAGG-HuIFN-λ2并进行鉴定, 后在BHK-21细胞进行表达, 采用VSV*GFP于人肺腺癌A549上进行表达产物抗病毒活性测定;并通过已构建的MDBK-Mxp-Luc细胞系对HuIFN-λ1和HuIFN-λ2诱导MxA抗病毒蛋白产生的特性进行研究.结果:HuIFN-λ1-PMD18-T Vector和HuIFN-λ2-PMD18-T Vector的SacⅠ、XhoⅠ和SacⅠ和SalⅠ双酶切鉴定, 均出现610 bp大小的带, 测序示与GenBank上报道的序列完全一致.PCAGG-HuIFN-λ1活性104 IU/mL, PCAGG-HuIFN-λ2活性为102 IU/mL, 且PCAGG-HuIFN-λ1诱导Mx抗病毒蛋白的表达一定时间内随时间延长表达不断增强, 9～12 h达高峰, 24 h后消失(P＜0.05).结论:成功构建了PCAGG-HuIFN-λ1PCAGG-HuIFN-λ2 的真核表达载体并在BHK-21细胞中得到表达, 其抗病毒活性与诱导Mx抗病毒蛋白密切相关.     

干扰素λ1在CHO细胞中的表达

目的 构建干扰素λ1表达载体PCI-dhfr-λ1和连接增强子SP163的表达载体PCI-dhfr-SP163-λ1,并在CHO(dhfr-)细胞中表达.方法 在合成的干扰素λ1基因中引入相应酶切位点,并通过融合PCR获得连接增强子SP163-λ1基因,测序正确后将该基因插入表达载体PCI-dhfr,构建重组表达载体PCI-dhfr-λ1和PCI-dhfr-SP163-λ1.将所构建的重组表达载体用脂质体法转入CHO(dhfr-)细胞,通过间接免疫荧光法和Western Blot鉴定了λ1蛋白的表达,应用细胞病变抑制法初步鉴定了λ1蛋白的抗病毒活性.结果 成功构建了干扰素λ1真核表达载体PCI-dhff-λ1和PCI-dhfr-SP163-λ1.免疫荧光结果显示分别转染了两种表达载体的CHO(dhfr-)细胞均能表达干扰素λ1蛋白,SP163增强子明显增强了干扰素λ1蛋白的表达,Western Blot结果显示转染SP163的CHO(dhfr-)细胞表达干扰素λ1蛋白.通过细胞病变抑制实验,在转染细胞48h后的细胞培养液中检测到了干扰素λ1的抗病毒活性.结论 本研究成功的在CHO(dhfr-)细胞中表达了干扰素λ1,表达的蛋白具有抗病毒活性,为进一步建立稳定表达干扰素λ1的细胞系提供了条件.     

重组人平足蛋白基因在中国仓鼠卵巢细胞的稳定表达

目的构建平足蛋白(PDPN)真核表达质粒PDPN-pEGFP-N1,建立稳定高表达重组人PDPN的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株并对其进行生物学活性研究。方法通过反转录PCR和DNA重组技术从HEK293细胞中克隆PDPN cDNA,插入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的真核表达载体pEGFP-N1中。通过PCR、酶切及测序等方法鉴定重组载体;进而将该重组载体转染至CHO细胞中,通过荧光显微镜检测EGFP的表达,Western blot法检测PDPN在CHO细胞中的表达,流式细胞术分选高表达PDPN的CHO细胞,运用血小板聚集实验检测分选后细胞株的生物学活性。结果 DNA测序和酶切鉴定证明PDPN基因正确克隆至pEGFP-N1载体中,重组载体稳定转染CHO细胞后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光,流式细胞术分选后的细胞高表达PDPN;Western blot结果显示转染后CHO细胞膜表面表达PDPN蛋白;过表达PDPN的CHO细胞可以诱导人血小板聚集。结论成功构建了稳定高表达PDPN蛋白的CHO细胞株,该细胞株可表达PDPN,并诱导血小板聚集。     

CD80/IgG融合基因真核表达载体的构建及在CHO细胞中的表达

目的：构建CD80/IgG真核表达载体，使其在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中呈分泌型表达，为白血病免疫基因治疗的研究奠定基础。 方法： 采用多聚酶链反应（PCR）技术分别从小鼠脾细胞和含小鼠CD80全长互补DNA（cDNA） 的质粒pcDNA/B7中扩增出免疫球蛋白IgG1的Fc段和CD80胞外区，以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.0中，获得重组表达载体pcDNA/CD80-IgG；采用脂质体转染技术转染CHO细胞,G418筛选得到稳定表达细胞株；免疫印迹、斑点ELISA及流式细胞术鉴定融合蛋白的表达,并初步检测其活性。 结果： DNA测序证明两段基因正确克隆至pcDNA3.0的多克隆位点，CHO细胞的培养上清中可检测到融合蛋白的表达，其分子量大小和预期的基本一致，该融合蛋白可提高白血病细胞表面CD80的表达。 结论： 成功构建pcDNA／CD80-IgG真核表达载体，并在CHO细胞中分泌性表达有活性的CD80-IgG融合蛋白。     

重组鸡Igλ轻链真核细胞分泌表达及其单克隆抗体的制备与鉴定

目的: 构建重组载体pcDNA-λ并在COS7细胞分泌表达鸡Igλ轻链, 制备抗鸡Igλ轻链的单克隆抗体(mAb).方法: PCR扩增带有信号肽的鸡Igλ轻链基因, 限制性酶切消化后, 定向克隆于真核表达载体pcDNA3, 构建具有6×His标签、分泌表达的重组载体pcDNA-λ.重组载体转染COS7细胞后, SDS-PAGE分析真核表达载体pcDNA-λ在COS7细胞的分泌表达.用2×106个雏鸡B淋巴细胞免疫BALB/c小鼠, 取脾细胞与骨髓瘤细胞融合, 分别采用细胞免疫荧光和间接ELISA筛选阳性杂交瘤克隆.结果: 成功构建分泌表达鸡Igλ轻链的重组载体, SDS-PAGE分析表明在COS7细胞上清有目的蛋白的分泌表达.杂交瘤细胞经筛选与鉴定, 获得2株分泌抗鸡Igλ轻链mAb的杂交瘤细胞株, Western blot检测到该mAb对重组鸡Igλ轻链的反应性.结论: 构建了重组表达载体pcDNA-λ并在COS7细胞上清分泌表达了重组鸡Igλ轻链.并用淋巴细胞杂交瘤技术成功筛选出抗鸡Igλ轻链mAb.为深入研究鸡Igλ轻链的结构与功能奠定了基础.     

小鼠sST2基因真核表达及其对LPS活化RAW264.7巨噬细胞的调节作用

目的:克隆并构建含小鼠sST2和人IgG Fc 融合基因的真核表达质粒, 初步探讨其表达产物sST2-Fc融合蛋白对LPS刺激小鼠巨噬细胞生物学活性的影响.方法:借助RT-PCR技术, 从小鼠脾脏总RNA中扩增全长sST2 cDNA, 构建sST2与hIgG Fc段融合基因的真核表达载体(psST2-Fc).应用脂质体将重组质粒psST2-Fc转染CHO细胞, 经G418筛选, 获得稳定表达sST2-Fc融合蛋白的CHO细胞株.细胞培养上清经蛋白A亲和层析纯化后, 采用Western blot进行鉴定, 应用FACS检测sST2-Fc与RAW264.7巨噬细胞表面相应受体结合情况;ELISA法检测sST2-Fc对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6的影响.结果:测序证实克隆和构建的小鼠sST2-Fc cDNA阅读框序列正确, Western blot 证实sST2-Fc融合蛋白的表达, sST2-Fc抑制LPS诱导巨噬细胞分泌的炎性细胞因子TNF-α和IL-6.结论:成功构建sST2-Fc融合基因并获得稳定表达, sST2-Fc通过与其特异性受体结合可抑制巨噬细胞介导的炎性反应.     

小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的表达及其生物学活性的研究

目的:制备B7-H3-Fc融合蛋白,研究其对T细胞的共刺激作用。方法:首先采用PCR技术分别从pMD19-T/小鼠B7-H3和pMD19-T/hIgG1(Fc)重组载体中扩增出小鼠B7-H3胞外段基因和人IgG1重链Fc恒定区基因。通过重叠PCR技术将2段基因连接成B7-H3-Fc,经EcoR I和BglII双酶切后插入真核表达载体pIRES2-EGFP构建成pIRES2-EG-FP/B7-H3-Fc重组载体。脂质体法转染CHO细胞,经G418加压筛选能稳定分泌表达小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的基因转染细胞,并经Western blot鉴定。该转基因细胞无血清培养后,收集细胞上清、超滤浓缩后行经Protein G柱纯化,获得纯品B7-H3-Fc融合蛋白。通过CCK-8以及ELISA方法检测小鼠B7-H3-Fc融合蛋白对T细胞体外增殖及细胞因子分泌的影响。结果:成功地构建了能稳定表达B7-H3-Fc融合蛋白基因的CHO转基因细胞株,该融合蛋白能够剂量依赖性地促进T细胞体外增殖及IL-2和IFN-γ等细胞因子分泌。结论:本研究提示B7-H3作为重要的共刺激分子,在调节T细胞免疫应答中发挥了正性共刺激作用。     

大鼠重组骨桥蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达和纯化

目的 构建包含大鼠骨桥蛋白(OPN)的真核表达载体,获得稳定表达重组蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株并对蛋白进行纯化,为OPN在大鼠模型实验中的进一步功能学研究奠定基础.方法 通过脂质体lipofectamine 2000将重组质粒pLVX-OPN转染到CHO细胞中,嘌呤霉素筛选出稳定克隆细胞.Real-time PCR法检测转染后CHO细胞中OPN的mRNA表达水平,酶联免疫吸附实验法(ELISA)检测上清中OPN分泌水平.取CHO细胞72 h无血清培养上清进行镍柱亲和层析纯化,ELISA法和Western blot法分别检测产量和纯度.结果 pLVX-OPN表达载体经DNA琼脂糖电泳鉴定为阳性,且质粒测序成功.经质粒pLVX-OPN转染的CHO细胞中OPN mRNA表达水平是转染前的上千倍,上清分泌蛋白水平较转染前增加.上清分泌的OPN蛋白通过镍柱亲和层析纯化后纯度有所提高,产量在30％以上.结论 pLVX-OPN真核表达载体的成功构建和在CHO细胞中的稳定表达及纯化为OPN的功能学研究提供了有效工具.     

共刺激分子配体B7-DC基因真核表达载体和转基因细胞的构建

目的：克隆小鼠B7-DC基因，并构建含该基因的真核表达载体pEF6／-B7-DC-V5His，证明该基因在CHO细胞中的表达方式，为建立B7-DC的转基因小鼠打下基础。方法：从小鼠胸腺中抽提总RNA为模板，通过RT—PCR技术，扩增出B7-DC编码区片段。按常规方法克隆进pEF6V5His载体中，重组质粒经鉴定后采用脂质体法转染CHO细胞，48小时后进行间接免疫荧光实验，72小时后用blasticidin进行筛选，挑选出能稳定表达B7-DC的细胞株。结果：已成功克隆小鼠B7-DC基因并构建了用于表达B7-DC基因的真核表达载体，经间接免疫荧光实验（IFA）证明，该基因在CHO细胞中得到表达。经Western blot检测表明筛选出的转基因细胞稳定表达了B7-DC基因。结论：构建了用于表达B7-DC基因的真核表达载体pEF6／-B7-DC-VSHis，并能在CHO细胞中稳定表达目的基因，为该基因功能的后续研究奠定了基础。     

可诱导共刺激分子和小鼠免疫球蛋白融合基因的分泌表达及生物学活性

目的：为获得重组可诱导共刺激分子胞外段与小鼠免疫球蛋白的融合蛋白（ICOS-Ig）并研究其生物学活性，以探讨它作为免疫拮抗剂阻断ICOS／B7RP-1共刺激通路的作用。方法：克隆编码人可诱导共刺激分子（ICOS）胞外片段，与编码小鼠免疫球蛋白IgG恒定片段（Ig）的基因融合，构建ICOS-Ig融合基因及其分泌型真核表达载体pSecTag2／Hygro A-ICOS-Ig；构建融合蛋白的稳定真核表达细胞株，用Western blot和ELISA法检测其表达、流式细胞仪（FACS）检测其配体结合活性、混合淋巴细胞反应（MLR）及细胞因子检测测定其生物学活性。结果：核苷酸序列测定显示克隆基因的核苷酸与Genebank序列一致：ELISA和Western blot检测表明转染细胞有分泌型重组蛋白的表达，其含量可达5～25μg／ml；该重组蛋白有配体结合活性，可体外抑制淋巴细胞增殖、减少IL-2、IFN-γ的分泌。结论：重组ICOS-Ig融合基因及其真核表达载体的构建完成并获得高效表达，该重组蛋白具有配体结合活性，可在体外通过抑制ICOS／B7RP-1共刺激通路抑制淋巴细胞增殖及细胞因子分泌。     

人Epsilon干扰素在CHO细胞中的表达及生物学活性的研究

目的 为了研究新发现的人epsilon干扰素（hIFN-ε）的生物学活性，我们通过RT-PCR克隆了hIFN-ε基因，并构建pcDNA3．1／myc-his（-）A-hIFN-ε（以下简称pcDNA3-1A-hIFN-ε）的真核表达载体，在CHO细胞中表达，并研究真核细胞重组表达的rhIFN-ε的生物学活性。方法 用TNF-α刺激人宫颈癌HeLa细胞，抽提总RNA，经RT-PCR获得全长cDNA，与pcDNA3．1／myc-his（-）A真核表达载体连接，构建重组体pcDNA3．1A-hIFN-ε并在CHO细胞中进行表达，采用微量细胞病变抑制试验研究表达产物中的rhIFN-ε对多种病毒的抗病毒活性；MTT法检测其对A375、HeLa和A549细胞的生长影响，并通过在Wish、HeLa、A375细胞中诱导MxA抗病毒蛋白的产生研究hIFN-ε的抗病毒机制。结果 经PCR和限制性酶切鉴定以及DNA测序，结果表明已经成功构建了重组体pcDNA3．1A-hIFN-ε，并在CHO细胞中稳定表达了rhIFN-ε蛋白，该蛋白具有抗HSV-I、PolioV、Ad3和VSV病毒的作用，能够抑制HeLa、A375、A549细胞的生长，刺激Wish、HeLa、A375细胞产生MxA蛋白。结论 本研究成功地构建了pcDNA3．1A-hIFN-ε真核表达载体并在CHO细胞中获得稳定表达，证明了ddFN．￡蛋白具有抗病毒和抗增殖活性，其抗病毒效应的分子机理可能与诱导细胞产生MxA抗病毒蛋白有关，为今后研究rhIFN-ε的生物学功能和基因重组药物研制及其开展基因治疗奠定了基础。     

CD80-IgG1 Fc段融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人CD80-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并住CHO细胞中进行表达。方法：应用T—A克降技术和亚克降技术，构建人CD80膜外段-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并将其转染人CHO细胞株并筛选，进行稳定表达：通过Western blot及ELISA法，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并建立CHO细胞稳定表达株。Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地构建了人CD80膜外段-IgGI Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgGI Fc／pcDNA3．1（＋），并在CHO细胞中稳定表达，为下一步抗肿瘤的研究奠定了基础。     

转染小鼠可诱导共刺激分子配体基因细胞株的构建及其对T细胞体外活化与增殖的促进作用

目的 构建转染小鼠可诱导共刺激分子配体(ICOSL)基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞株(CHO/ICOSL),探讨其对T细胞体外增殖与活化的促进作用.方法 从小鼠脾脏细胞中抽提总RNA,采用RT-PCR的方法获得小鼠ICOSL基因,经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后装入EGFP-pIRES2真核表达载体中并测序鉴定,用脂质体转染技术将重组载体EGFP-pIRES2/ICOSL转染CHO细胞,经G418加压筛选,流式细胞术和RT-PCR分析其在CHO细胞中的表达.以转染空载体CHO细胞(CHO/Mock)作为对照,将CHO/ICOSL细胞与T细胞体外共培养,通过检测活化T细胞上CD25、CD69的表达及T细胞增殖实验对小鼠ICOSL转基因细胞的生物学功能进行初步研究.结果 CHO/ICOSL基因转染细胞能稳定地高表达小鼠ICOSL分子.与CHO/Mock相比,CHO/ICOSL基因转染细胞能够显著促进T细胞的体外活化与增殖(P＜O.05).结论 成功构建稳定表达小鼠ICOSL的基因转染细胞株,该细胞株能显著促进T细胞的体外活化与增殖,为进一步深入研究该分子生物学功能奠定了基础.     

BTLA-HVEM通路阻断对树突状细胞功能影响的体内外研究

目的 探讨阻断BTLA-HVEM(B/T淋巴细胞弱化因子疱疹病毒进入介质)通路对树突状细胞功能的影响和相关免疫学机制.方法 构建小鼠BTLA胞外功能区的真核表达载体psBTLA,转染CHO细胞;HSP70-TC-1肿瘤抗原肽刺激小鼠骨髓来源DCs,流式细胞仪检测处理后DCs表面BTLA、HVEM的表达,同时给予转染了psBTLA质粒的CHO细胞的培养上清处理后,检测DCs表面B7-1的表达,ELISA检测上清中IL-12的分泌;处理后的DCs刺激脾细胞,检测淋巴细胞增殖和细胞因子分泌;检测psBTLA体内转染对宫颈癌细胞系TC-1成瘤小鼠DCs表达B7-1和肿瘤生长的影响.结果 成功构建小鼠BTLA胞外段的真核表达载体psBTLA,获得了稳定转染psBTLA的CHO细胞,在其培养上清检测到BTLA胞外段(sBTLA)的表达.DCs经抗原肽刺激后BTLA、HVEM表达均上调,加入含sBTLA的上清处理后上调B7-1,上清中分泌的IL-12增加,与脾细胞共培养时促进细胞增殖和IL-2、IFN-γ的分泌;体内基因转染psBTLA促进DCs表达B7-1以及抑制肿瘤生长.结论 通过sBTLA阻断BTLA-HVEM共抑制通路,可以进一步促进DCs的功能,更好地激活淋巴细胞,促进抗肿瘤免疫应答.     

mOX40-Fc的真核表达及其对混合淋巴细胞反应的影响

构建重组pcDNA3.1-mOX40-Fc真核表达载体,在CHO细胞中表达,并初步研究融合蛋白mOX40-Fc对MLR中细胞增殖的影响。克隆编码hIgG1Fc基因片段,与编码小鼠OX40胞外段的基因融合,构建mOX40-Fc融合基因及其分泌型真核表达载体pcDNA3.1-mOX40-Fc;转染CHO细胞构建融合蛋白的稳定真核表达细胞株,用RT-PCR及夹心ELISA检测其表达,纯化后经SDS-PAGE及Western blot法对其进行鉴定,混合淋巴细胞反应(MLR)测定其生物学活性。结果:核苷酸序列测定显示构建的mOX40胞外段和hIgG1Fc段基因序列与GenBank序列一致、阅读框完整;RT-PCR、ELISA和Western blot检测表明转染细胞有分泌型重组蛋白的表达;功能实验提示mOX40-Fc能抑制MLR中的细胞增殖。成功构建mOX40-Fc真核表达载体并获得高效表达,该重组蛋白可在体外通过抑制OX40/OX40L共刺激通路抑制淋巴细胞增殖。     

CD40突变体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的:构建CD40突变体(muCD40)融合蛋白的真核表达载体pIRES2-EGFP/muCD40Ig,并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达,以获得muCD40Ig融合蛋白,为检测体内可溶性muCD40分子建立实验基础。方法:从L929/muCD40基因转染细胞中通过RT-PCR扩增出人muCD40胞外段基因序列,从人脾脏细胞中扩增出人IgG1恒定区基因,分别插入真核表达载体pIRES2-EGFP,采用Superfectin转染CHO细胞,G418筛选出能稳定分泌muCD40Ig蛋白的基因转染细胞并亚克隆。筛选出的阳性克隆经无血清培养后,收集上清进行Western blot检测;并收集细胞进行RT-PCR鉴定,同时用流式细胞仪分析muCD40Ig蛋白与CD40L的结合能力。结果:成功构建了人pIRES2-EGFP/muCD40Ig重组真核表达载体,PCR及Western blot结果显示该CHO基因转染细胞能够稳定分泌人muCD40Ig蛋白;流式检测muCD40Ig融合蛋白能够与CD40L分子结合。结论:获得了能稳定分泌人muCD40Ig的CHO基因转染细胞株,muCD40Ig融合蛋白具有与CD40L结合的能力。     

CRT-E2-EGFP表达、胞内定位及其对B16细胞凋亡的影响

目的:观察CRT-E2融合蛋白在小鼠黑色素瘤B16细胞中的表达及其定位,并探讨CRT引起的E2蛋白表达定位改变对B16细胞增殖及调亡的影响.方法:构建荧光真核表达载体pEGFP-CRT、pEGFP-E2、pEGFP-CRT-E2,将上述载体以及空载体pEGFP-C1经脂质体瞬时转染B16细胞,West-em blot分析确认目的蛋白表达.荧光显微镜下观察CRT-E2融合蛋白在细胞中表达定位;流式细胞术检测不同重组表达载体转染B16细胞24 h、48 h后,对细胞周期的影响和诱导凋亡的情况.结果:CRT-E2融合蛋白在B16细胞中正确表达,主要分布于细胞质,能将细胞阻滞于G1期,有效诱导肿瘤细胞发生凋亡(P<0.01).结论:成功构建CRT-E2真核表达载体,外源性CRT能够引起E2蛋白表达定位于细胞质,并明显促进了肿瘤细胞的调亡.     

人IL-18结合蛋白A在CHO细胞中表达的研究

目的 克隆人IL－18结合蛋白A（hIL-18BPa)的cDNA，构建真核表达载体及其在CHO细胞中的表达。方法 采用RT－PCR，自人白血病血细胞株Jurkat中获得hIL-18BPa的cDNA。将其克隆至T-vector中，经测序确证后，将该基因定向插入真核表达载体pcDNA3．1中。以脂质体介导法，将其转染CHO细胞，用G418筛选抗性克隆，ELISA法测定其生物学活性。结果 获得的IL-18BPa的cDNA序列与GeneBank登录的cDNA序列一致。将hIL-18BPa插入载体pcDNA3．1后，成功地构建稳定表达的载体。转染CHO细胞2后，获得可稳定表达hIL-18BPa的基因工程细胞株。经纯化后，证明具有良好的生物学活性。结论 成功地克隆hIL-18BPa基因，并实现了在CHO细胞中的稳定表达，为研究其生物学活性奠定了基础。     

人BTLA-Fc融合蛋白的制备及其生物学活性的研究

为建立CHO/BTLA-Fc基因转染细胞株,使之能稳定分泌BTLA-Fc融合蛋白,采用PCR法从本单位构建的pEGZ-Term/B7-H1-Fc重组质粒中扩增人IgG1(Fc)恒定区,Xho I、BamH I双酶切后与真核表达载体pIRES2-EGFP连接为重组质粒pIRES2-EGFP-Fc,同时PCR法从pEGZ-Term/BTLA重组质粒中获得人BTLA胞外段基因片段,用Nhe I、Xho I双酶切插入上述pIRES2-EGFP-Fc构建重组载体pIRES2-EGFP/BTLA-Fc。脂质体法以该重组载体转染鼠CHO细胞,G418筛选并亚克隆化。Protein G亲和层析柱对上清中的融合蛋白进行纯化,Western blot作定性分析。CCK-8检测BTLA-Fc融合蛋白对抗人CD3单抗激发的T淋巴细胞增殖的影响。结果表明,基因转染CHO细胞培养上清中表达的BTLA-Fc融合蛋白能与L929/HVEM细胞有效结合,纯化的融合蛋白经Western blot鉴定有清晰的目的条带,而且BTLA-Fc融合蛋白对T细胞的体外增殖具有抑制作用。     

MAGE-3基因真核表达载体构建及在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的　扩增人黑色素瘤抗原 3(Melanomaantigen 3,MAGE 3)基因 ,构建真核表达载体 ,并在小鼠黑色素细胞瘤B16中进行表达。方法　采用PCR扩增MAGE 3基因 ,连接到真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,构建真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞。G4 18筛选阳性克隆 ,荧光显微镜和RT PCR分别检测阳性克隆中增强型绿色荧光蛋白 (Enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)的表达和MAGE 3mRNA的表达。结果　从pUC19 MAGE 3重组质粒中扩增获得一条约 95 0bp的片段 ,成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,转染B16细胞后筛选得到阳性克隆 ,可见融合蛋白表达产生明亮的绿色荧光 ,RT PCR检测到MAGE 3mRNA的表达。结论　成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,获得了稳定表达该载体的小鼠黑色素瘤B16细胞系 ,为研究MAGE 3在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了基础。