人皮肤角质形成细胞库的构建

目的探索人皮肤角质形成细胞的分离、培养、传代、冻存、复苏及鉴定技术。方法采用细胞培养技术及免疫组化技术。结果我们采用细胞培养技术体外分离培养了小儿包皮角质形成细胞,传代后的角质形成细胞,经冻存、复苏后,此角质形成细胞仍既能增殖、又能分化,生长状态与新鲜分离的角质形成细胞相类似。结论酶消化法是快速大量培养皮肤角质形成细胞的简便易行的方法。     

氧化苦参碱上调角质形成细胞Fas抗原介导细胞凋亡

目的：探讨苦参碱上调角质形成细胞Fas抗原表达，治疗银屑病的机制。方法：采用流式细胞仪定量分析不同浓度氧化苦参碱对角质形成细胞Fas抗原表达的影响。结果：当氧化苦参碱浓度≥100mg/L时，可上调角质形成细胞Fas抗原表达，随着浓度升高，表达量增加，结论：一定浓度的氧化苦参碱可上调角质形成细胞Fas抗原表达，继而诱导角质形成细胞凋亡，这可能是苦参治疗银屑病的重要机制之一。     

研究表皮黑素细胞与毛囊角质形成细胞在接触性共培养体系中的相互作用

目的研究分析表皮黑素细胞和毛囊角质形成细胞在接触性共培养体系的建立,以及相互作用。方法用胰酶融化游离毛囊与包皮的表皮,获得纯度角度高的角质形成细胞与黑素细胞,第三代毛囊角质形成细胞在6孔板中接种,2 d以后按照表皮黑素细胞与毛囊角质形成细胞之间的比例,按照1∶2、1∶10、1∶20的比例接种黑素细胞,其中在1∶10的比例中,加入-黑素细胞刺激素,在干预6 d以后,用NKI/beteb作一抗。结果以1∶10的接种比例,很符合表皮基底层的黑素细胞与角质形成细胞比例;但是在1∶2情况下可获得数量多的表皮黑素细胞。而在1∶20情况下可以发现角质细胞、黑素细胞之间的联系。结论表皮黑素细胞与毛囊角质形成细胞在接触性共培养体系下,非常适合用于人色素系统方面的研究。     

皮肤角质形成细胞的无血清培养方法

目的探索建立少量成年自体皮肤角质形成细胞体外无血清培养体系,为自体组织工程皮肤的构建与移植奠定物质基础。方法:无菌条件下,取2cm×2cm 兔耳皮肤组织块,Dispase 消化,分离真表皮,表皮以胰蛋白酶+EDTA 消化获得角质形成细胞,以含钙和不含钙的角质形成细胞培养液(K-SFM),按不同细胞密度接种于24孔板,观察细胞生长状况;免疫组化鉴定,MTT 法测定不同血清浓度对角质形成细胞增殖分化的影响。结果:在适当的 Ca~(2+)浓度下,少量自体角质形成细胞能够在无血清培养液 k-SFM 中培养扩增,最多可传4～6代。添加血清后可明显加速细胞分化。结论:无血清培养体系适用于少量成年自体角质形成细胞的体外连续培养扩增,培养的细胞可用于自体组织工程皮肤的构建。     

己酮可可碱对糖尿病足皮肤角质形成细胞的影响

目的探讨己酮可可碱对角质形成细胞的影响及其用于糖尿病足溃疡治疗的可能机制。方法对糖尿病足患者下肢手术后剩余皮肤,采用皮肤器官培养法(浮游法)培养皮肤标本,观察己酮可可碱对角质形成细胞游走的影响。结果浓度为3×10~(-5)mg/mL的己酮可可碱,对皮肤角质形成细胞游走有显著的促进作用。经过120小时的培养,己酮可可碱其他各个浓度组角质形成细胞游走距离均略高于对照组,但未见具有统计学意义的显著性差异。结论一定浓度的己酮可可碱具有促角质形成细胞游走的作用,且可能是其治疗糖尿病足溃疡的作用机制。     

T细胞在银屑病发病中的作用的研究进展

银屑病是一种常见的病因不清的慢性炎症性疾病，过去认为银屑病是由于角质形成细胞生长异常或炎症导致，认为角质形成细胞是发病机制中的关键因素。近年来，随着免疫学研究的进展，这种观点有所改变，许多学者认为T细胞在银屑病发病机制中起着非常重要的作用。     

P物质受体在人表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞中的表达调控

目的考察P物质受体(Neurokinin1R,NK1R)在正常人表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞中的表达调控特征。方法培养人表皮角质形成细胞株HaCaT细胞和真皮成纤维细胞,应用免疫组织化学法检测NK1R在两种细胞中的表达;采用RTPCR方法检测NK1R在两种细胞mRNA水平的表达特征,并采用流式细胞术定量检测在不同刺激因素及药物作用下两种细胞中NK1R的表达调控情况。结果NK1R在HaCaT细胞及真皮成纤维细胞中均有表达,阳性部位位于细胞膜及细胞质。NK1RmRNA在HaCaT细胞上的表达水平要高于在真皮成纤维细胞上的表达。P物质和IFNγ可以上调NK1R在两种细胞上的表达,而LPS抑制了NK1R的表达;抗组胺药盐酸西替利嗪和P物质受体特异性拮抗剂SpantideI可以降低两种细胞上NK1R的表达。结论皮肤角质形成细胞和真皮成纤维细胞在细胞、蛋白及mRNA水平均有NK1R的表达,而且这种表达可被过敏炎症因子调控,提示角质形成细胞和真皮成纤维细胞参与了皮肤免疫调控,神经肽P物质可能在皮肤过敏性炎症中起重要作用。     

探究2型单纯疱疹病毒(HSV-2)对人永生化角质形成细胞株(HaCaT)分泌白细胞介素(IL)-19、IL-20的影响

目的:分析2型单纯疱疹病毒对人永生化角质形成细胞株分泌白细胞介素(IL)-19、IL-20的影响,为临床探讨角质形成细胞对2型单纯疱疹病毒感染初期的免疫防御机制提供依据。方法:应用2型单纯疱疹病毒感染人永生化角质形成细胞,并对感染后24、48、72h的IL-19、IL-20mRNA(信使RNA)的表达量使用荧光实时定量PCR进行检测,分析HSV-2对HaCaT细胞分泌白细胞介素(IL)-19、IL-20的影响。结果:实验组HSV-2对HaCaT细胞分泌IL-19、IL-20mRNA表达量显著高于对照组,P0.05。结论:角质形成细胞经2型单纯疱疹病毒感染后可分泌IL-19、IL-20,并参与2型单纯疱疹病毒感染初期的免疫防御反应。     

金樱子提取液对H2O2诱导HaCaT细胞氧化损伤保护作用研究

目的探讨金樱子提取液对H2O2诱导后人角质形成细胞(HaCaT cell)氧化损伤的保护作用。方法体外培养人角质形成细胞,用不同浓度的H2O2诱导细胞构建氧化应激损伤模型。CCK-8法检测不同浓度金樱子提取液对细胞增殖作用的影响;Hochest染色法检测不同浓度金樱子提取液对细胞凋亡作用的影响。结果100μmol·L-1 H2O2为构建氧化应激损伤模型的最适浓度。CCK-8法检测结果表明金樱子提取液能显著提高细胞的增殖,且随浓度的升高而增大。Hochest染色结果表明金樱子提取液能有效抑制由H2O2氧化损伤引起的细胞凋亡。结论金樱子提取液对H2O2诱导后的人角质形成细胞具有一定的氧化损伤保护作用。     

酮洛芬异丙酯在皮肤细胞中的代谢

目的：研究酮洛芬异丙酯在皮肤细胞中的代谢作用，为进一步研究利用酯类前体药物方法改善药物的经皮吸收特性提供实验依据。方法：将人包皮的第3代角质形成细胞或成纤维细胞超声破碎制成匀浆，加入不同量的酮洛芬异丙酯进行37℃温孵实验，通过高效液以谱法分别在不同时间测定细胞匀浆中酮洛芬异丙酯及酮洛芬的浓度。结果：酮洛芬异丙酯在表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞的匀浆中存在代谢现象，有前者的代谢能力明显大于后者。结论：酯类前体药物可在皮肤细胞中被代谢为活性母体药物本身。     

珍珠发酵液对人角质形成细胞HaCaT增殖和迁移的影响

利用人永生化角质细胞生长实验,研究珍珠发酵液对细胞划痕迁移的影响,进而研究珍珠发酵液的细胞修护能力。本研究以淡水珍珠为原料,进行发酵获得珍珠发酵液,检测其理化性质。通过培养获得角质细胞,CCK8法评估细胞生存能力;细胞划痕实验检测珍珠发酵液对角质细胞的迁移的能力,评估珍珠发酵液的促愈合功效。研究表明,珍珠发酵液在浓度为0.1 mL/mL时,对角质细胞没有毒性,不影响细胞生长速率,排除细胞增殖对细胞迁移的影响。在细胞划痕实验中,发现珍珠发酵液在0.1 mL/mL浓度作用于角质细胞48 h后,细胞迁移率达到了96.54%±1.53%,与空白组相比,有显著性差异(P<0.05)。研究结果说明0.1 mL/mL珍珠发酵液可以促进角质细胞迁移,且对细胞无毒性,可为珍珠发酵液修护能力提供依据。     

地塞米松、FK-506和CX-659s对TARC产生的调控作用研究

目的研究地塞米松、他克莫司（FK-506）和CX-659s对胸腺活化调节趋化因子（TARC／CCL17）产生的调控作用。方法运用ELISA方法分别研究了3种药物对人角质形成细胞株——HaCd细胞和人成纤维细胞株——NG1RGB细胞的TARC表达作用的影响。结果3种药物对于HaCaT细胞中TARC的表达,10^-9～10^-5mol／L地塞米松显示明显的抑制作用;对于IFN-γ刺激下HaCaT细胞产生TARC水平,10^-12～10^-6mol／L地塞米松、10^-12～10^-6mol／L的FK-506均表现为明显的抑制作用（P〈0．05或P〈0．01）;CX-659s显示明显抑制NGlRGB细胞中TARC水平,且具有浓度依赖性（P〈0．01）。3种免疫抑制剂分别在不同条件下抑制皮肤角质形成细胞和／或成纤维细胞的TARC表达。结论这些药物明显抑制TARC在皮肤角质形成细胞和成纤维细胞的表达,因此认为角质形成细胞和成纤维细胞可能在病理状态下通过促进CCR4＋T细胞向炎症部位的游走,参与免疫调控作用。     

β-溶血型链球菌胃蛋白酶消化产物对银屑病 PBMCs和角质形成细胞的作用

目的 :探讨链球菌M蛋白在银屑病发病中的可能机制。方法 :应用胃蛋白酶消化的方法获得M蛋白粗品(pep -M) ,其不同剂量对银屑病组和健康人组外周血单一核细胞 (PBMCs)增殖的影响用MTT方法检测。用3H -TdR掺入法和流式细胞仪检测pep -M对人角质形成细胞株Colo -16的作用。结果 :pep -M可以明显促进银屑病组和对照组的PBMCs增殖 (P<0.05) ;并且银屑病组PBMCs的增殖强度要明显高于健康对照组 (P<0.05)。pep-M不能明显促进体外培养的角质形成细胞DNA合成 ;相反 ,大剂量时出现Colo -16细胞死亡增多的现象 ,Colo -16细胞亚二倍体细胞的含量并未明显增加。结论 :pep -M对角质形成细胞没有直接的促增殖作用。它可能通过M蛋白特异性的T淋巴细胞在银屑病发病中发挥作用     

皮肤角质形成细胞中TRPV1受体激活后的蛋白质组差异分析

目的 研究皮肤角质形成细胞中辣椒素受体TRPV1激活后细胞中蛋白质组学的变化,并鉴定差异蛋白质。方法 皮肤角质形成细胞株HaCaT细胞经辣椒素(CAP)刺激24 h后,提取蛋白样品,采用双向凝胶电泳技术分离HaCaT细胞总蛋白,用PDQuest软件分析对照组和CAP刺激组蛋白组图谱的表达差异点,再运用串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白。结果 CAP刺激HaCaT细胞后,磷酸甘油醛异构酶、烯醇化酶、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶和组织蛋白酶D蛋白表达水平增高,角蛋白14和60S酸性核糖体蛋白P2表达量降低,这些蛋白可能在TRPV1激活后影响细胞功能的过程中有重要作用。结论 利用蛋白质组学技术,研究皮肤角质形成细胞株HaCaT细胞中TRPV1受体激活后蛋白表达差异,为研究TRPV1受体的作用机制,以及为研发针对性药物,提供新的线索和方向。     

玉屏风多糖组分对皮肤角质形成细胞的作用研究

目的 研究中药方剂玉屏风的多糖组分在体外对角质形成细胞的免疫调节作用。方法 利用Real-time PCR法检测玉屏风多糖组分对激活的皮肤角质形成细胞中各炎症因子表达的调控作用;分别用Real-time PCR法和Elisa法对聚角蛋白微丝蛋白（Filaggrin）在mRNA和蛋白水平的表达进行检测;用Western bolt法检测多糖组分对NF-κB信号通路的调节作用。结果 玉屏风多糖组分明显抑制激活的皮肤角质形成细胞分泌炎症因子,促进Filaggrin的表达,并对NF-κB信号通路有明显的抑制作用,该信号通路对炎症和免疫细胞的活化有重要作用。结论 玉屏风多糖组分在体外对皮肤角质形成细胞有免疫调节作用,能够减缓皮肤局部炎症的发展,为玉屏风方剂的进一步开发应用奠定理论基础。     

以角质形成细胞异常增生为特点的皮肤病hTR、hTERT mRNA表达

目的：探讨端粒酶RNA（hTR）／和端粒酶反转录酶（hTERT）在几种以角质形成细胞异常增生为特点的皮肤病中的表达及其与角质形成细胞增殖的关系。方法：应用原位杂交方法检测银屑病、基底细胞癌（BCC）、鳞癌（SCC）、脂溢性角化（SK）组织标本中hTR、hTERT mRNA的表达。应用免疫组织化学方法检测Ki-67抗原的表达，并对hTR、hTERT mRNA的表达与Ki-67抗原的表达行相关性分析。结果：hTR表达在基底细胞、棘细胞、颗粒层细胞层和所有有核细胞的胞浆。与细胞的增殖情况无关；其阳性细胞百分率在各组差异无统计学意义（P〉0．05）。而hTERT主要表达在癌巢和生长活跃的组织和细胞。与细胞的增殖状态有关。阳性细胞百分率高于正常皮肤（P〈0．05）。Ki-67抗原主要表达在细胞生发层和分裂旺盛的组织；其表达与hTERT的表达呈正相关（r=0．674。P〈0．01）：而与hTR（r=0．295，P〉0．05）无关。结论：hTERT mRNA与细胞增殖活性有关，在银屑病、基底细胞癌、鳞癌、脂溢性角化中的表达明显升高．可作为细胞增殖活性的分子生物学标志。     

银屑病发病机制的免疫学研究进展

银屑病是多基因遗传背景下的免疫性疾病,与T细胞、树突状细胞等多种免疫细胞以及血管内皮生长因子等多种细胞因子有关,发病机制复杂,病因尚不明确。银屑病的组织病理学表现为角质形成细胞过度增生、炎症细胞聚集和真皮乳头部血管增生扩张,其皮损中多种细胞因子表达增加。本文就银屑病发病机制的免疫学研究进展作一综述。     

UVA损伤人表皮细胞模型中载物界面的选择

目的选择一种建立长波紫外线（ultrayiolet，UVA）照射人表皮角质形成细胞损伤模型的理想载物界面。方法选取原代培养的处于指数生长期的角质形成细胞，分别采用泡沫板、锡纸板、冰面作为载物界面，进行相同剂量的UVA照射，同时设未照射组为对照组，通过改良MTr法检测细胞损伤程度。结果冰面作为载物界面时，细胞损伤相对较弱，损伤率仅为19.88％；锡纸面作为载物界面时，细胞照射损伤最重，损伤率高达82.76％；泡沫板作为载物界面时的细胞照射损伤率为55.58％，介于上述两种载物界面之间，各组与对照组比较均有显著性差异（P〈0.05）。结论泡沫板是UVA照射人表皮细胞损伤模型的理想载物界面。     

酮洛芬及其异丙酯对HaCaT细胞构建的组织工程皮肤的渗透作用

目的体外构建适用于经皮给药研究的组织工程皮肤。方法以表皮角质形成细胞系HaCaT细胞及人真皮成纤维细胞为细胞来源，用I型牛胶原蛋白为真皮基质包埋成纤维细胞，其上接种HaCaT细胞，采用气-液界面方式培养，观察不同的培养介质对组织工程皮肤的影响，HE染色切片观察培养皮肤结构形态。以酮洛芬及其异丙酯为模型药物研究经皮渗透和代谢特性。结果HaCaT细胞经气-液界面培养可形成类表皮层，但不能形成完整的角质层。维生素C可明显促进细胞增殖，维生素D₃可促进细胞分化，雌二醇对此组织工程皮肤没有明显的影响。同皮肤细胞匀浆代谢相似，酮洛芬异丙酯被代谢成原药酮洛芬。结论HaCaT细胞在气-液界面培养条件下可形成多层分化不完全的表皮层，保留了一定的酶活性，可用于药物的经皮渗透和代谢等研究。     

苦参和土茯苓联用改善小鼠银屑病样皮损的作用机制

目的 采用62.5 mg咪喹莫特乳膏诱导的小鼠银屑病样皮损模型,探索苦参和土茯苓联用外治银屑病的作用及其机制。方法 首先通过银屑病进行期和复发期的小鼠模型,结合HE染色,评价其外治银屑病的作用;其次采用免疫组化研究苦参和土茯苓联用对银屑病的核心病理机制——角质形成细胞异常增殖与皮肤免疫微环境正反馈环路的干预作用;最后利用代谢组学探索苦参和土茯苓联合外用是否通过调节银屑病中炎症、脂质相关代谢通路等治疗银屑病。结果 苦参和土茯苓联用改善小鼠银屑病样皮损;有效减弱小鼠银屑病痊愈后复发,药效与本维莫德相当,并且抑制小鼠表皮角质形成细胞的增殖和减少皮肤中T细胞的数量,调节花生四烯酸、鞘脂、色氨酸、苯丙氨酸等代谢通路。结论 苦参和土茯苓联合外用通过抑制表皮角质形成细胞的增殖和减少皮肤中T细胞的数量改善小鼠银屑病样皮损及调节代谢干预其复发,本研究提供了一种减缓银屑病复发的潜在外用治疗药物。