Gremlin对高糖环境下系膜细胞转化生长因子β1及胞外调节蛋白激酶表达的影响

Gremlin是骨形态发生蛋白(BMP)的一种内源性拮抗剂,对胚胎发育、生长和细胞分化起重要的调节作用[1].近年来的研究发现Gremlin与糖尿病肾病(DN)的发生发展密切相关,但我们对Gremlin在糖尿病肾损害过程中所扮演的角色尚知之甚少.TGF-β1及细胞外信号调节激酶1/2(ERK 1/2)在DN的发病中起重要作用,TGF-β1及其下游结缔组织生长因子(CTGF)可导致肾组织纤维化[2-3].我们的前期研究发现体外高糖环境下小鼠系膜细胞ERK1/2通路可被激活[4].本研究通过转染Gremlin基因,观察其对高糖环境下小鼠肾小球系膜细胞(MMCs) TGF-β1、CTGF及磷酸化ERK1/2 (p-ERK1/2)表达的影响,为进一步揭示DN发病的分子学机制及寻找早期防治方法提供理论依据.     

P38 MAPK抑制剂在高糖诱导系膜细胞CTGF表达和基质蛋白分泌中的作用

目的:探讨P38 MAPK抑制剂SB203580在高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞对丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1,MKP-1)与结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达和细胞外基质蛋白分泌的作用。方法:体外培养大鼠肾小球系膜细胞分为4组:正常对照组(NG组,5. 5 mmol/L葡萄糖);渗透压对照组(NG+M组,5. 5 mmol/L葡萄糖+24. 5 mmol/L甘露醇);高糖组(HG组,30 mmol/L葡萄糖);高糖+SB203580组(HG+SB203580组,30 mmol/L葡萄糖+10μmol/L SB203580),分别给予不同刺激。48 h收集细胞,分别提取系膜细胞蛋白、RNA及细胞上清液。采用Western blot检测MKP-1、p38 MAPK及磷酸化p38MaPK的表达; RT-PCR检测p38 MAPK、MKP-1、CTGF和FN mRNA的表达; ELISA法测定细胞上清CTGF和纤维黏连蛋白(fibronectin,FN)含量,放免法测定细胞上清液Ⅳ型胶原的含量。结果:与NG组相比,HG组系膜细胞MKP-1表达下调,p38 MAPK蛋白表达无明显差别,但磷酸化的p38 MAPK表达明显升高,MKP-1 mRNA表达下降,p38 MAPK、CTGF和FN mRNA的表达增加,细胞上清液中CTGF、FN和Ⅳ型胶原含量增加;与HG组相比,HG+SB203580组MKP-1表达升高,p38 MAPK蛋白表达无明显差别,但磷酸化的p38MAPK表达明显下降,p38 MAPK、CTGF和FN mRNA的表达下降,系膜细胞上清液中CTGF、FN和Ⅳ型胶原含量下降。结论:p38 MAPK抑制剂SB203580通过增强MKP-1的表达,增强p38 MAPK去磷酸化,使p38 MAPK活性下降,从而阻断CTGF的合成和细胞外基质蛋白表达,在糖尿病肾病细胞外基质重构中发挥保护作用。     

ERK1/2 MAPK通路在TIMP-1抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡中的作用

目的 探讨细胞外信号调节激酶(ERK1/2)丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路在基质金属蛋白酶1组织抑制剂(TIMP-1)抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡中的作用。 方法 将人正义、反义TIMP-1用脂质体法转染大鼠肾小球系膜细胞，并将细胞分为正常对照组、未转染组、空载体组、正义转染组和反义转染组。各组细胞分别用高糖(25 mmol/L)和(或)MEK(ERK1/2通路中的MAPK激酶)特异性抑制剂PD98059(50 μmol/L)刺激24 h。应用透射电镜观察细胞内部结构变化。Western 印迹观察磷酸化(p)的ERK1/2、P90rsk、Bad及总的P90rsk、Bad、Bcl-2蛋白的表达。 结果 加入PD98059后，各组细胞内可见凋亡小体形成、细胞皱缩、核固缩、染色体边集及膜泡样突变等现象，与未转染组比较，以反义转染组最明显，凋亡细胞数目最多；正义转染组细胞形态改变不十分明显，凋亡细胞数目相对较少。此外，加入PD98059后，ERK1/2、P90rsk、Bcl-2及Bad的磷酸化明显减少(P < 0.05)，ERK1/2和P90rsk的磷酸化以正义转染组最明显(P < 0.01)；总P90rsk、总Bad表达量在各组之间无显著差异。 结论 ERK1/2 通路在TIMP-1抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡过程中起重要作用。     

匹格列酮对高糖时肾小球系膜细胞p38信号通路和TGF-β的影响

目的：研究匹格列酮对高糖培养下人肾小球系膜细胞P38促分裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信号通路及转化生长因子（TGF-β）的影响,进一步探讨匹格列酮抗糖尿病肾病的作用机制。方法：实验分组：正常对照组、甘露醇组、高糖组、高糖＋SB203580组、高糖＋匹格列酮组,观察匹格列酮对高糖培养下的人肾小球系膜细胞p38MAPK信号通路和TGF-β蛋白表达的影响。结果：与高糖组相比,匹格列酮降低系膜细胞p38MAPK信号通路和TGF-β蛋白表达水平。结论：匹格列酮抗糖尿病肾病的作用可能与其抑制p38MAPK信号通路激活和减少TGF-β的表达密切相关。     

肾小球系膜细胞蛋白激酶C同工酶的激活与糖尿病肾病

糖尿病肾病(DN)是糖尿病全身微血管并发症之一,以早期肾小球滤过率升高、继以肾小球毛细血管基底膜增厚、系膜区基质沉积,最终弥漫性或结节性肾小球硬化形成为特征.高血糖是DN损害的主要因素,而在高糖环境下肾小球系膜细胞(mesangial cell,MC) 蛋白激酶C (PKC)的激活是进展性DN的中心环节.     

SphK/S1P信号通路与糖尿病肾病

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)作为糖尿病的一个重要微血管并发症,是终末期肾病的首要病因,多种因素参与其发生与发展.近年来发现高血糖可以刺激肾脏的SphK/S1P信号通路,通过MAPK、Smads、PKC、Rho家族的小GTPases的激活,从而引起系膜细胞的增殖和系膜基质(extracellular matrix,ECM))的累积,导致肾脏的纤维化,而通过对该通路的选择性干预可延缓DN的进展,为DN提供新的治疗措施.     

细胞外基质增殖在糖尿病肾病的作用

糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)的主要慢性并发症,病理特点是肾脏高灌注,肾小球基底膜(GBM)增厚和以肾小球系膜区为主的细胞外基质(ECM)积聚,导致弥漫性或结节性肾小球硬化,出现蛋白尿、高血压、肾功能衰竭等功能紊乱。DN的发生机制目前尚不清楚,可能是代谢异常,血流动力学障碍或遗传因素。但不论其机制是什么,DN病人均出现了ECM的生化和结构改变。因此对ECM的研究可提高对DN发病机理的认识,对DN防治具有重要意义。近年对ECM的研究已取得了很大进展,我们主要综述DM状态对ECM的影响和ECM与DN发生发展的关系。     

普罗布考对结缔组织生长因子在系膜细胞中表达的调节

结缔组织生长因子(CTGF)是一种相对分子质量为36 000～38 000的分泌多肽,在包括肾脏在内的多种不同器官中可致纤维化病变[1].CTGF可诱导人肾小球系膜细胞产生与糖尿病.肾病相关的病理变化,如增加细胞外基质积聚及诱导细胞周期停滞在G1晚期[1].CTGF在糖尿病肾病中的作用及如何调控CTGF表达为当前研究热点.普罗布考是一种降脂药物,并具有抗增殖活性,已初步应用于糖尿病的治疗[2].本研究旨在明确CTGF在高糖状态下系膜细胞中的表达变化以及普罗布考对CTGF表达的调控,并进一步探讨其分子机制.     

高糖对系膜细胞胞外调节蛋白激酶表达及细胞外基质合成的影响

目的：探讨高糖环境下系膜细胞中胞外调节蛋白激酶（ERK）转导途径活性和转化生长因子-β1（TGF-β1）mRNA表达的变化。方法：分离培养大鼠肾脏系膜细胞,调整培养液浓度为以下3组,即正常糖组、高糖组、甘露醇组。分别予干预12h、24h、48h后用免疫细胞化学法和Western-blot法对系膜细胞中磷酸化ERK1/2（pERK1/2）的表达进行定位、定性及半定量分析,用RT-PCR法检测细胞中TGF-β1 mRNA的表达,放免法测定各组细胞上清中Ⅳ型胶原的含量。结果：高糖组系膜细胞中pERK1/2蛋白的表达较正常糖组明显增高并由胞浆向胞核内转移,随培养时间延长其表达呈上升趋势（P〈0.01）,高糖组TGF-β1 mRNA的表达及细胞上清液Ⅳ型胶原的含量均高于正常糖组（P〈0.01）,甘露醇组上述指标较正常糖组略有升高,但两组间无统计学意义（P〉0.05）。结论：高糖环境下系膜细胞中ERK信号转导通路被激活,TGF-β1 mRNA表达上调,可能是糖尿病肾病系膜细胞受损,肾小球硬化的机制之一。     

megsin基因转染对高糖环境中系膜细胞胞外调节蛋白激酶表达的影响

目的 观察megsin基因转染对高糖环境中小鼠肾小球系膜细胞血小板源性生长因子BB（PDGF-BB）、磷酸化胞外调节蛋白激酶1/2（pERK1/2）、转化生长因子β1（TGF-β1）的表达及Ⅳ型胶原水平的影响;探讨megsin基因对细胞外信号调节激酶（ERK）通路的作用。 方法 将小鼠肾小球系膜细胞分为7组：低糖组（A组,5.5 mmol/L）、高糖组（B组,30 mmol/L）、高糖+空质粒组（C组）、高糖+megsin质粒组（D组）、高糖+megsin质粒+ERK通路抑制剂组（E组）、高糖+ megsin siRNA组（F组）和低糖+甘露醇组（24.5 mmol/L甘露醇,G组）。分别在培养12、24、48 h后,采用Western印迹法测定各组系膜细胞megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表达,放射免疫测定法（RIA）测定各组细胞上清液中Ⅳ型胶原浓度。 结果 与A组相比,高糖刺激可上调系膜细胞megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表达及上清液Ⅳ型胶原的水平（均P ＜ 0.05）,且有一定的时间依赖性。转染megsin基因可进一步上调高糖环境下系膜细胞PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1、Ⅳ型胶原的表达（均P ＜ 0.05）。应用ERK通路抑制剂后,与D组相比系膜细胞megsin 和PDGF-BB的表达无明显变化（均P ＞ 0.05）,而pERK1/2、TGF-β1及Ⅳ型胶原的表达则明显降低（均P ＜ 0.05）。转染megsin siRNA对系膜细胞megsin基因进行干扰后,系膜细胞PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表达及Ⅳ型胶原的含量较B组下调（均P ＜ 0.05）。 结论 高糖环境下,转染megsin基因可使小鼠系膜细胞megsin、PDGF-BB表达增高,其可能部分通过ERK通路使TGF-β1表达上调及Ⅳ型胶原合成与分泌增加。megsin siRNA干扰可使上述指标下调,megsin基因可能在糖尿病肾病发病中起重要作用。